Bu yöntem klonlama, ifade ve yapısal tayini için rekombinant Nsa1 arınma x-ışını kristalografisi ve küçük açı X-ray saçılma (SAXS) tarafından açıklar ve diğer proteinlerin hibrid yapısal analiz için geçerlidir her ikisi de içeren düzenli ve düzensiz etki alanları.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
X-ışını kristalografisi Nsa1 S. Cerevisiae üzerinden yapılandırılmamış bölgelerinde modellemek için küçük açı X-Ray saçılma ile birleştirerek
Bu makalede
Özet
Özet
Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) elde ribozom derleme faktörü Nsa1 tam uzunlukta yapısını belirlenmesi zor nedeniyle düzensiz ve proteaz değişken C-terminus protein. Bu el yazması x-ışını kristalografisi ve SAXS göre yapısal analiz için S. cerevisiae üzerinden rekombinant Nsa1 arındırmak için yöntemleri açıklar. X-ışını kristalografisi Nsa1 iyi N-terminal WD40 etki alanı yapısını çözmek için kullanılmıştır ve sonra SAXS Nsa1, C-terminus yapısında çözüm çözmek için kullanıldı. Çözüm saçılma veriler çözüm tam uzunlukta Nsa1 üzerinden toplanmıştır. Teorik saçılma genlikleri WD40 etki alanı yüksek çözünürlüklü kristal yapısı hesaplanan ve C-terminus Nsa1, katı vücut ve ab initio modelleme bir arada ortaya koydu. Bu melez yaklaşımla tüm protein dördüncül yapısının yeniden. Burada sunulan yöntemleri genel olarak yapılandırılmış ve yapılandırılmamış etki alanları karışımından oluşan diğer proteinlerin hibrid yapısal kararlılık için uygulanabilir olmalıdır.
Giriş
Ribozom mRNA tüm canlı hücrelerdeki protein dönüştürerek httpd'ye temel rolü gerçekleştirmek büyük Ribonükleoprotein makinelerdir. Ribozom ribozom biyongenezi1,2,3,4olarak adlandırdığı karmaşık bir süreç içinde üretilen iki altbirimden oluşur. Ökaryotik ribozom derleme gerekli ribozomal derleme faktörler2,3,5yüzlerce yardımıyla dayanır. Nsa1 (Nop7 ilişkili 1) özellikle büyük ribozomal altbirimde6üretimi için gerekli olan bir ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. rekombinant Protein üretimi ve Nsa 1 arıtma
- Nsa1 ifade plazmid tasarım ve klonlama
- Elde etmek veya S. cerevisiae genomik DNA satın alın.
- PCR yükseltmek Nsa1 hedef dizisi (Nsa1FL, artıkları 1-463) ve C-terminal kesildi Nsa1 (Nsa1ΔC, artıkları 1-434) S. cerevisiae ve erime sıcaklığını izole genomik DNA'yı kullanarak uygun astar ile yaklaşık 1-2 dk bir uzantısı zaman ile 60 ° C. Aşağıdaki astar Nsa1 yükseltmek için kullanılmıştır:
SC_Nsa1_FLFw:CGCCAAAGGCCTATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGGATAG
SC_Nsa1_FLRv:AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTTGCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGCGC
SC_Nsa1ΔcFw:GGGCGCCATGGGATCCATGAGG....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Nsa1 S. cerevisiae genomik DNA'güçlendirilmiş ve ardından MBP ve TEV proteaz site bir N-terminal 6 x-histidin benzeşme etiketi içeren bir vektör içine subcloned PCR yapıldı. Nsa1 E. coli BL21(DE3) hücrelere dönüştü ve yüksek verim protein ifade aşağıdaki IPTG ile indüksiyon ve 25 ° c gece (şekil 1A) büyüme elde edilmiştir. Nsa1 benzeşme saf üzerinde immobilize kobalt benzeşme reçine, MBP bölünme TEV proteaz ile izledi ve sonunda boyutu dışla.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu iletişim kuralını kullanan, rekombinant Nsa1 S. cerevisiae gelen yapısal çalışmaları için x-ışını kristalografisi ve SAXS tarafından oluşturuldu. Nsa1 çözümde su kuyusu-davranmak ve kristal yükseltgen kristalize. Bu kristaller en iyileştirme sırasında C-terminus Nsa1, proteaz düşmesine duyarlı keşfedilmiştir. Yüksek çözünürlüklü Ortorombik kristal formu sadece çoğaltılamaz C-terminal kesme türevleri Nsa1, büyük olasılıkla ile esnek C-terminus Nsa1, kristal ambalaj engelledi çünkü. Nsa1 yapısını x-ışını krista.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Kırınım veri Güneydoğu bölgesel işbirliği Access ekibi (SER-CAT) 22-ID ve 22-BM beamlines, Gelişmiş foton kaynak (APS), Argonne Ulusal Laboratuvarı, toplanmıştır. SAXS veri FALCILAR beamline, önceden ışık kaynağı (ALS), Lawrence Berkeley Ulusal Laboratuvarı üzerinde toplandı. FALCI beamline onların yardımıyla uzak veri toplama ve işleme için personel teşekkür etmek istiyorum. Ulusal çevre sağlık Bilimler Enstitüsü (NIEHS) kütle spektrometresi araştırma ve destek grubu için protein etki alanı sınırları belirleme konusunda yardım için sana şükrediyoruz. Bu eser bize Ulusal Enstitüsü, sağlık Intramural araştırma programı tarafından desteklenen; ABD Ulusal Enstitüsü çevre....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| pMBP2 paralel vektörünün | Sheffield ve diğerleri, Protein Ekspresyonu ve Saflaştırma 15, 34-39 (1999)N-terminal | His-tag (pHMBP) | |
| S. cerevisiae genomik DNA | ATCC | 204508D-5 | |
| Nsa1 değiştirilmiş bir versiyonunu kullandık> | |||
| SC_Nsa1_FLFw | IDT | CGC CAA AGG CCT ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT GGATAG | |
| SC_Nsa1_FLRv | IDT | AATGCAGCAGCGGCCGCTCAAATTTT GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC AGC | |
| SC_Nsa1_DeltaCFw | IDT | GGGCGCCATGGGATCCATGAGG TTACTAGTCAGCTGTGTGG | |
| SC_Nsa1_DeltaCRv | IDT | GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC CTTCCTTTTTTTTGCTTCCC | |
| Nsa1Escherichia | |||
| pMBP- NSA1'in Rekombinant Protein Üretimi ve Saflaştırılması ve çeşitli kesmeler | Lo ve diğerleri, 2017 | ||
| IPTG, Dioksan İçermeyen | Promega | V3953 | |
| EDTA İçermeyen Proteaz İnhibitörü Kokteyl | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| Sodyum Klorür | Caledon Laboratuvar Kimyasalları | 7560-1-80 | |
| Magnezyum Klorür hekzahidrat | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Tris Tamponu, 1 M pH 7.5 | KD Tıbbi | RGF-3340 | |
| Gliserol | Invitrogen | 15514-029 | |
| beta-merkaptoetanol | Sigma | M6250 | |
| 1M İmidazol, pH 8.0 | Teknova | I6980-06 | |
| Pençe Afinite | Reçinesi Clonetech | 635503 | |
| Amicon Ultra 15 mL Santrifüj Filtre (MWCO 10K) | Millipore | UFC901024 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 Hazırlık Sınıfı Jel Filtrasyon Kolonu | GE-Healthcare | 28989335 | |
| NIEHS Tarafından Hazırlanan TEV Proteaz Protein Ekspresyonu Çekirdek | Ekspresyon NCI tarafından sağlanan plazmid (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009) | ||
| %4-15 Mini-PROTEAN TGX Prekast Protein Jelleri | BioRad | 456-8056 | |
| Kristalizasyon, Proteolitik Tarama | |||
| Kristal Ekran | Hampton Araştırma | HR2-110 | |
| Kristal Ekran 2 | Hampton Araştırma | HR2-112 | |
| Tuz Rx | Hampton Araştırma | HR2-136 | |
| İndeks Ekranı | Hampton Araştırma | HR2-144 | |
| PEG / İyon Ekran | Hampton Araştırma | HR2-139 | |
| JCSG + | Moleküler Boyutlar | MD1-37 | |
| Sihirbaz Çökeltici Sinerji | Moleküler Boyutlar | MD15-PS-T | |
| Swissci 96 kuyulu 3 damlalı UVP oturma damla plakaları | TTP Labtech | 4150-05823 | |
| 3 İnç Geniş Kristal Berraklığında Sızdırmazlık Bandı | Hampton Research | HR4-506 | |
| Proti-Ace Kiti | Hampton Research | HR2-429 | |
| PEG 1500 | Moleküler Boyutlar | MD2-100-6 | |
| PEG 400 | Moleküler Boyutlar | MD2-100-3 | |
| HEPES/sodyum hidroksit pH 7.5 | Moleküler Boyutlar | MD2-011-Sodyum | |
| Sitrat tribazik | Moleküler Boyutlar | MD2-100-127 | |
| 22 mm x 0,22 mm Silikonize Kapak Kaydırakları | Hampton Research | HR3-231 | |
| Mastikli 24 Kuyulu Plakalar (VDX Plaka ile Mastik) | Hampton Research | HR3-172 | |
| 18 mM Montajlı Naylon Halkalar (0,05 mm ila 0,5 mM) | Hampton Research | HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971 | |
| Tohum Boncuk Kiti | Hampton Research | HR2-320 | |
| Manyetik Kristal Kapaklar | Hampton Research | HR4-779 | |
| Manyetik Kriyo Değnek | Hampton Research | HR4-729 | |
| Kriyojenik Köpük Dewar | Hampton Research | HR4-673 | |
| Kristal Disk Sistemi | MiTeGen | M-CP-111-021 | |
| Tam Etek 96 kuyulu Şeffaf Plaka | VWR | 10011-228 | |
| AxyMat Sızdırmazlık Matı | VWR | 10011-130 | |
| Equipment | |||
| UVEX-m | JAN Scientific, Inc. | ||
| Nanodrop Lite Spektrofotometre | Thermo-Fisher | ||
| Sivrisinek Robotu | TTP Labtech | ||
| Software/Websites | |||
| HKL2000 | Otwinoski ve Minor, 1997 | ||
| Phoenix | Adams ve diğerleri, 2010 | ||
| Coot | Emsley ve diğerleri, 2010 | ||
| ATSAS | Petoukhov ve diğerleri, 2012 | https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/ | |
| Scatter | Rambo ve Tainer, 2013 | ||
| Pymol | PyMOL Moleküler Grafik Sistemi, Sürüm 1.8 Schrö dinger, LLC. | ||
| BUNCH | Petoukhov ve Svergun, 2005 | ||
| CRYSOL | Svergun ve diğerleri, 1995 | ||
| PRIMUS | Konarev ve diğerleri, 2003 | ||
| EOM | Tria ve diğerleri, 2015 |
Kaynaklar
- Thomson, E., Ferreira-Cerca, S., Hurt, E. Eukaryotic ribosome biogenesis at a glance. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 4815-4821 (2013).
- Woolford, J. L. Jr, Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
- Kressler, D., Hurt, E., Bas....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
