Summary
Hier presenteren we een protocol voor wide area scannen sonde nanolithography ingeschakeld door de iteratieve uitlijning van sonde arrays, evenals het gebruik van de lithografische patronen voor celoppervlak interactie studies.
Abstract
Scanning probe microscopie is het creëren van een verscheidenheid van methoden voor de constructieve ('additieven') topdown fabrikatie van nanometerschaal functies ingeschakeld. Een groot nadeel van het scannen van de sonde litho is historisch gezien de intrinsiek lage doorvoersnelheid van één sonde systemen. Dit is aangepakt door het gebruik van matrices met meerdere sondes om toegenomen nanolithography doorvoer. Oog op de uitvoering van dergelijke parallelized nanolithography, de nauwkeurige uitlijning van sonde arrays met het oppervlak van het substraat is van vitaal belang, zodat alle sondes maken contact met het oppervlak tegelijkertijd wanneer lithografische patroon van de muziek begint. Dit protocol beschrijft het gebruik van polymeer pen lithografie te produceren nanometerschaal functies over centimeter en middelgrote gebieden, vergemakkelijkt door het gebruik van een algoritme voor de snelle, nauwkeurige en automatische uitlijning van sonde arrays. Nanolithography van thiolen op gouden substraten toont hier, de generatie van functies met hoge uniformiteit. Deze patronen zijn vervolgens matiemaatschappij met fibronectine voor gebruik in de context van oppervlak geleide cel morfologie studies.
Introduction
Vooruitgang op nanotechnologiegebied is afhankelijk van de ontwikkeling van technieken staat voor efficiënt en betrouwbaar fabriceren nanoschaal functies op oppervlakken. 1 , 2 genereren dergelijke echter beschikt over grote gebieden (meerdere cm2) betrouwbaar en bij relatief lage kosten is een niet-triviale inspanning. De meeste bestaande technieken, afgeleid van de halfgeleiderindustrie, is afhankelijk van ablatieve fotolithografie te fabriceren van 'harde' materialen. Meer recentelijk opgedoken lithografische technieken die zijn afgeleid van de scanning probe microscopie (SPM) als een handige en veelzijdige aanpak voor de rapid prototyping van nanoschaal ontwerpen. 3 SPM gebaseerde technieken kunnen gemakkelijk en snel 'schrijven' door de gebruiker gedefinieerde patroon. De meest bekende hiervan is duik-pen nanolithography (DPN), gepionierd door Mirkin et al.,4 waar een scannen sonde wordt gebruikt als een 'pen' overbrengen van een moleculaire 'inkt' naar de oppervlakte productie van functies op een wijze analoog aan schrijven. Onder de omgevingsomstandigheden, terwijl een sonde wordt gescand over een oppervlak de 'inkt' moleculen worden overgebracht naar de oppervlakte via een water-meniscus die tussen de sonde en het oppervlak (Figuur 1 vormt). DPN kan dus de depositie van de nanolithographic van een breed scala van materialen, met inbegrip van 'zachte' materialen zoals polymeren en biomoleculen. 5 verwante technieken met behulp van sondes gebouwd met de kanalen voor de vlotte levering, afwisselend aangeduid als 'nanopipettes' en 'nano-vulpennen', zijn ook gemeld. 6 , 7 , 8
De voornaamste hinderpaal voor de ruimere toepassing van SPM afkomstige litho is doorvoersnelheid, want het vereist een erg lang patroon centimeter-schaal gebieden met één sonde. Begin inspanningen om dit probleem te verhelpen gericht op de paralellisatie van cantilever gebaseerde DPN, met zowel 'één-dimensionale' en 'twee-dimensionale (2D) sonde arrays worden gerapporteerd voor de litho centimeter en middelgrote gebieden. 5 , 9 echter deze cantilever arrays worden geproduceerd door middel van relatief complexe meerstaps fabricage methoden en zijn relatief kwetsbaar. De uitvinding van polymeer pen litho (PPL) wordt deze kwestie behandeld door vervanging van de standaard SPM uitkragingen met een 2D-matrix van zachte siloxaan elastomeer sondes gebonden aan een glasplaatje. 10 deze eenvoudige sonde setup aanzienlijk vermindert de kosten en de complexiteit van de patronen van grote gebieden, openstelling van de nanolithography tot een breder scala van toepassingen. Deze ' Freischwinger '-vrije architectuur is ook uitgebreid naar harde-tip soft-voorjaar lithografie,11 waarmee een hybride van zachte elastomere steun met harde silicon tips geven verbeterde resolutie in vergelijking met patronen geproduceerd met behulp van zachte elastomeer tips.
Een cruciale factor bij de uitvoering van deze technologieën 2D matrix is dat de sonde array precies parallel aan het oppervlak substraat moet zodat wanneer lithografie wordt gebruikt, alle de sondes in contact met het oppervlak komen tegelijkertijd. Zelfs een kleine afwijking kan leiden tot een groot verschil in de grootte van de ene kant van de array naar de andere, omdat sommige sondes in aanraking het oppervlak eerder tijdens de afdaling van de matrix, komen terwijl anderen in contact later of helemaal niet komen zal. 12 exacte uitlijning is vooral belangrijk met PPL als gevolg van de vervormbaarheid van de zachte elastomeer sondes, waar de sondes eerder contact opnemen met het oppervlak worden gecomprimeerd, waardoor een grotere voetafdruk op het oppervlak.
Het vroege werk op het PPL werkzaam puur visuele inspectie bij het uitlijning proces, met behulp van een camera gemonteerd boven de array te observeren van de vervorming van de piramidale sondes, als ze in aanraking met het oppervlak werden gebracht. 10 uitlijning werd beoordeeld door observeren welke kant van de sondes kwam in contact met het oppervlak eerst, dan de hoek aan te passen en het procédé op iteratieve wijze tot het verschil in contact aan weerskanten van de sonde was te onderscheiden voor het oog. Als deze alignement procedure is gebaseerd op subjectieve visuele inspectie door de exploitant, is reproduceerbaarheid laag.
Vervolgens een objectievere aanpak ontwikkeld, die bestaat uit een kracht sensor gemonteerd onder het substraat voor het meten van de kracht toegepast bij contact van de sondes op het oppervlak. 12 uitlijning werd aldus bereikt door aanpassing van de tilt hoeken om te maximaliseren de kracht uitgeoefend, die aangegeven dat alle de sondes tegelijk in contact waren. Deze methode bleek dat aanpassing aan binnen 0,004 ° van de oppervlakte parallel mogelijk. Deze 'force feedback nivellering' is nu uitgevoerd in volledig geautomatiseerde systemen in twee onafhankelijke rapporten. 13 , 14 een drietal van krachtsensors gemonteerd onder het substraat of boven de array te gebruiken zowel de hoeveelheid kracht die uitgeoefend wordt op contact tussen de sonde arrays en oppervlak meten. Deze systemen geven hoge precisie, onjuiste wisselkoersenverhoudingen van ≤0.001 ° rapportage over een schaal van 1 cm lengte,14 of ≤ 0.0003 ° meer dan 1,4 cm.13 deze automatische uitlijning systemen bieden ook grote besparingen in tijd van de exploitant en totale tijd genomen om te voltooien de lithografie proces.
Een belangrijke toepassing van high-throughput oppervlakte fabricage ingeschakeld door deze technologie is de generatie van cel cultuur substraten. Nu ook vaststaat dat fenotype van cellen kan worden gemanipuleerd door het beheersen van de eerste interactie tussen cellen en oppervlaktekenmerken, en dat dit kan worden verbeterd op nanoschaal. 15 specifiek, scannen sonde lithografie methoden hebben aangetoond dat een facile methode voor de productie van een verscheidenheid van oppervlakken van de nanofabricated voor dergelijke cel cultuur experimenten. 16 bijvoorbeeld, oppervlakken presenteren nanoschaal patronen van zelf geassembleerde monolayers en extracellulaire matrix eiwitten templated door PPL en DPN zijn gebruikt voor het bestuderen van de mogelijkheden van nano-bewerkt materialen in materiaal geïnduceerde differentiatie van de cellen van de stam. 17
Dit protocol beschrijft het gebruik van een gemodificeerde atomaire kracht Microscoop (AFM) systeem waarmee grote terrein PPL. We detail de detectie van kracht met behulp van meerdere krachtsensors als middel voor het bepalen van de sonde-oppervlak contact, samen met een algoritme om de iteratieve uitlijning proces te automatiseren. Latere functionalization van deze patronen met de extracellulaire matrix eiwit fibronectine en de cultuur van menselijke mesenchymale stamcellen (hMSC) worden beschreven, als een demonstratie van de PPL-verzonnen oppervlakken toegepast voor celkweek.
Protocol
1. fabricage van de PPL pen matrix
- Ter voorbereiding van het mengsel van de copolymeren Polydimethylsiloxaan (PDMS):
- Voeg 10 µL van het platina (0) - 1,3 - divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane complexe oplossing en 172 µL van 1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane met 250 g (7-8% w/w vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane co-polymeer. Meng deze onderdelen grondig op een roterende mixer voor 7 dagen om homogeen mengen.
Let op: platina (0) - 1,3 - divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane is toxisch. Lees MSDS voordat u gaat werken met deze oplossing. Veiligheidsuitrusting moet gedragen worden tijdens het verwerken van de chemische stof. - Voeg toe 0,5 g (25-35% w/w methylhydrosiloxane)-co-polymeer dimethylsiloxane aan een gedeelte van de 1,7 g van mengsel uit stap 1.1.1 in een weging boot en meng met een spatel.
- Ontgas dit mengsel door het over te dragen aan een vacuüm exsiccator en het ontmaskeren van het mengsel te lage druk (200 mTorr, 0.3 mBar) gedurende 20 minuten totdat alle de gasbellen is verdwenen.
- Voeg 10 µL van het platina (0) - 1,3 - divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane complexe oplossing en 172 µL van 1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane met 250 g (7-8% w/w vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane co-polymeer. Meng deze onderdelen grondig op een roterende mixer voor 7 dagen om homogeen mengen.
- Plaats een glasplaatje 13 x 13 mm in een kunststof schroef-bedekte flesje gevuld met 20 mL 2-propanol, plaats dan de ampul in een ultrasoonbad gedurende 10 minuten grote puin te verwijderen. De dia's was door het inlaten van dia's in vers 2-propanol (100 mL) en droog onder een stroom van stikstofgas.
- Plaats een silicium master18 in een petrischaal van 4 cm diameter en voeg voldoende ontgaste PDMS prepolymer mengsel (uit stap 1.1) tot volledig gedekt. Meestal is 100 µL vereist voor een meester van 20 x 20 mm. Plaats de meester met het prepolymer mengsel in een vacuüm dessicator. Ontgas het polymeer voor een verdere 5 min te verwijderen elke gasbellen gevormd tijdens de overdracht van het mengsel. De O2 plasma behandeling van de glazen dia's (stap 1.4 hieronder) moet worden uitgevoerd terwijl de ontgassing plaatsvindt.
- Behandel de glas vierkanten met O2 plasma (600 mTorr) bij het RF maximumvermogen voor 1 min te verwijderen van de organische verontreiniging en voor het genereren van een uniforme oxide laag op het glas voor de hechting van de elastomeer. 19 gebruik het plasma wordt de dia's onmiddellijk behandeld in de volgende stap.
- Zorgvuldig plaats de vierkante glasplaatje (uit stap 1.4) over de prepolymeren op de master (uit stap 1.3) met de plasma-gereinigd kant naar beneden. Zachtjes druk naar beneden het glasplaatje op de silicium-master te verwijderen van elk ingesloten lucht en om ervoor te zorgen dat een uniforme film voor PDMS is ingeklemd tussen de kapitein en de dia.
- Plaats de ingeklemd PDMS-array uit de bovenstaande stap in een petrischaal met het silicium master aan de onderkant (dat wil zeggen, met de rug van het glasplaatje naar boven) en zet de schotel in een oven bij 70−80 ° C gedurende 24−48 h thermisch genezen het PDMS.
- Verwijder de uitgeharde array uit de oven en laat afkoelen gedurende 15 minuten en daarna met een scheermesje zorgvuldig alle overtollige PDMS verwijderen uit de rug en kanten van het glas schuif en een stroom van droge stikstof gebruiken om alle losse deeltjes van de PDMS wegwaaien.
Opmerking: zorg niet te krabben het silicium-model met het scheermesje, als dit schade aan de niet-stick coating veroorzaken kan. - Wig een scheermesje in de hoek van de matrix op een diepte van 1 mm en voorzichtig loeren de array afgezien van de meester. Deze actie uitvoeren in één continu hijs actie; laat niet de arrays om terug te vallen op de master.
- Zorgvuldig gesneden en 0,5 mm van het PDMS weg te schrapen aan de randen van de matrix met een scheermesje. Gebruik een stroom van droge stikstof om eventuele losse deeltjes van de PDMS wegwaaien.
Opmerking: Het wellicht eenvoudiger uit te voeren deze trimmen stap onder de stereoscoop of een vergrootglas. Zorg niet te krabben het silicium-model met het scheermesje, als dit schade aan de niet-stick coating veroorzaken kan.
2. array voorbereiding en substraat montage
- Genereren een hydrofiele oppervlak op de sonde array door O2 plasma behandeling:
- Plaats de PPL pen array in een petrischaaltje in plasma kamer vacuüm op 600 mTorr toepast. Schakel over op de generator van de plasma (maximale instelling) voor 30 s.
- Vrijgeven van het vacuüm, de array te verwijderen en controleren van de hydrophilicity door daalt 20 µL gedeïoniseerd water op de array en observeren of is er zelfs verspreiding van het water over het oppervlak. Als dit niet gebeurt, afhankelijk van de array naar een tweede ronde van plasma behandeling. Daarna drogen de matrix grondig met een stroom van droog stikstofgas.
- Met behulp van koolstof dubbelzijdige tape, hechten de array op het midden van de houder van de sonde. Monteer de houder van de sonde naar de AFM kinematische houder (Figuur 2).
- Voor het laden van de PPL-matrix met 16-mercaptohexadecanoic zuur (MHA) ('inkt'):
- Bereid 1 mM 16-mercaptohexadecanoic zuur (MHA) oplossing door ontbinding van 8.6 mg in 30 mL ethanol in een buis en plaatsen het in een ultrasoonbad voor 10 min te ontbinden volledig de compound.
Let op: 16-mercaptohexadecanoic acid is giftig. Lees MSDS voordat u gaat werken met deze oplossing. Veiligheidsuitrusting moet gedragen worden tijdens het verwerken van de chemische stof. - Met behulp van een micropipet, de storting 20 µL drop van de MHA-oplossing op de matrix. Vermijd contact van de uiteinden van de pipet met de arrays. Laat het verspreid over de matrix, dan toestaan dat de ethanol te verdampen onder omgevingsomstandigheden.
Opmerking: De PPL-array kan als alternatief worden geïnkt nadat de uitlijning heeft plaatsgevonden. 10
- Bereid 1 mM 16-mercaptohexadecanoic zuur (MHA) oplossing door ontbinding van 8.6 mg in 30 mL ethanol in een buis en plaatsen het in een ultrasoonbad voor 10 min te ontbinden volledig de compound.
- Zodra de MHA-oplossing is opgedroogd, mount de houder van de sonde met de PPL-array op de AFM.
3. bereiding van gouden substraten voor PPL.
- Gouden substraten kunnen worden gekocht of in-house gemaakt door thermische of electron beam depositie, en worden geconstrueerd van een 2 nm titanium hechting laag gevolgd door 20 nm van goud op een glas of silicium wafer. 18
- Indien nodig Reinig de substraten door zuurstof plasma behandeling met behulp van de parameters die zijn beschreven in stap 1.4.
- Plaats het gouden substraat in het midden van de AFM monster fase en veilig met plakband rond de grenzen van het substraat (Figuur 2). Aanpassen van de etappe naar de juiste hoogte, zoals aangegeven in de gebruiksaanwijzing van de fabrikant met de z-as controller.
4. automatische uitlijning van pen matrix
- Open en de etappe-controller setup-programma (SetupNSF.exe) uitvoeren op de computer resetten ('nul') alle assen en hoeken naar een vooraf gekalibreerde nulpunt en gebruik vervolgens de etappe x/y-as controller console om het substraat naar de gewenste uitlijning / de locatie van het afdrukken. Voor een optimaal resultaat moet het substraat in de buurt van het midden van het podium, tussen van de etappe krachtsensors worden geplaatst.
Opmerking: In sommige modellen van de computer, de x/y-as controller USB signaal kan interfereren met die van de z-as controller. Als dit zich voordoet, haal de x/y-as controller, USB-kabel na deze stap. Het moet vervolgens weer ingeschakeld worden nadat de alignement procedure (stap 4.7). - Schakel de ontgrendelingshendel van de etappe laat het monster podium en activeer de trits van de krachtsensors zoals aangegeven door de instructies van de fabrikant van de AFM. Laat de krachtsensors aan equilibreer gedurende ten minste 15 minuten. Voor een optimaal resultaat kunt u 30-50 min.
- De hoogte van de z-as om de array in de directe nabijheid met het substraat door visueel observatie van de sonde matrix en het oppervlak te vergroten.
Opmerking: Hoe dichter de array is aan de oppervlakte, de minder iteraties vereist zijn voor het uitlijning proces, waardoor het opslaan van tijd. - De automatische uitlijning programma (automatische uitlijning v16.exe) openen/uitvoeren en relevante uitlijning parameters invoeren.
- Voer de waarde van de parameter van de gewenste 'hoek Step', meestal 0,15 °. Deze parameter is de offset hoek van de 'optimale' hoek voor elke as die wordt bepaald door het programma. Stel deze parameter tussen 0,1 en 0,2 °, zoals hoeken lager dan dit bereik niet leiden een duidelijk aantoonbare werking verschil op de aanpak van de sondes aan de oppervlakte tot.
Opmerking: Software accepteert waarden in millidegrees (d.w.z., 1 x 10-3 °). Bijvoorbeeld voor 0,15 °, moeten gebruikers invoeren '150.' - Invoeren van de gewenste grof stap ' parameterwaarde, meestal 0,6 µm. Deze parameter is de z-as stap-grootte gebruikt door het podium als het nadert de sondes in de eerste ruwe uitlijning. Stel deze parameter tussen 0,2 en 1 µm. grotere daling van de maten de tijd die nodig is voor het uitlijning proces stap maar verminderen de nauwkeurigheid van de uitlijning, en meer de slijtage van de sondes.
Opmerking: Software accepteert waarden van grof stappen in micrometers. Bijvoorbeeld voor 0,6 µm moeten gebruikers invoeren '0.6'. - Voer de gewenste ' fijn ' parameter intervalwaarde, doorgaans 0,2 µm. Deze parameter is de z-as stap-grootte gebruikt voor fijne aanpassing van de optimale uitlijning. Voor de meeste toepassingen, stelt u deze parameter tussen 0.1 en 0.4 µm. grotere waarde stap grootte zal verminderen de hoeveelheid tijd die nodig is voor het uitlijning proces maar ook de kwaliteit van de uitlijning verminderen.
Opmerking: Software accepteert waarden van fijne stappen in micrometers. Bijvoorbeeld voor 0,2 µm, moeten gebruikers invoeren '0.2.' - Configureer de 'Excel bestandspad' en een ongewijzigde kopie van het sjabloonbestand verstrekte werkblad koppelen met behulp van het pictogram 'map', naar de bestandslocatie navigeren en op 'OK' te drukken. Dit bestand bevat de ruwe en berekende gegevens dat wordt gebruikt voor het bepalen van de optimale fase tilt hoeken van het werkgebied.
- Voer de waarde van de parameter van de gewenste 'hoek Step', meestal 0,15 °. Deze parameter is de offset hoek van de 'optimale' hoek voor elke as die wordt bepaald door het programma. Stel deze parameter tussen 0,1 en 0,2 °, zoals hoeken lager dan dit bereik niet leiden een duidelijk aantoonbare werking verschil op de aanpak van de sondes aan de oppervlakte tot.
- Openen/uitvoeren van de software van de controle van de AFM. Ga naar het deel van de spectroscopie van dit programma door te klikken op de knop 'spectroscopie' (volgens de instructies van de fabrikant) en stel de AFM scan hoofd z-as oscilleren door 10 µm meer dan 100 ms, met een pauze tijd van 250 ms, vervolgens als wilt intrekken van 10 µm meer dan 100 ms met een pauze tijd van 250 ms (Figuur 3).
- Als de AFM hoofd is oscillerende, klikt u op de knop 'start' van de uitlijning software om de automatische uitlijning proces te beginnen. Wanneer het programma wordt uitgevoerd, is de software schrijven en lezen gegevens in het bestand beschreven in stap 4.4.4.
Opmerking: De uitlijning duurt 30 minuten en 3 uur afhankelijk van de positie van de eerste fase ingesteld in stap 4.3 en softwareconfiguratie die werden ingegeven in stap 4.4.
Let op: De etappe controller consoles zijn nog steeds actief tijdens het uitlijning proces - gebruik niet hen tijdens het uitlijning proces als het met de uitlijning interfereren zal. - Als de uitlijning is voltooid, zal het groene licht vak 'Aanpassing voltooid' op de uitlijning software (uit stap 4.4) worden ontstoken. Wanneer dit gebeurt, klikt u op de 'STOP' knop in de gebruikersinterface het uitlijning proces beëindigen.
- De grafieken in het werkbladbestand sjabloon van een correlatie tussen opgenomen gegevenspunten en de lijn passen die wordt gegenereerd door de software te inspecteren. Zie representatieve resultaten voor voorbeelden van een goede correlatie, met typische R2 waarden van > 0.99. Als de aanpassing mislukt is, de matrix sonde vervangen door een nieuw bereid matrix (stap 2) en herhaalt u de uitlijning (stap 4.4).
- De etappe naar boven verplaatsen in de z-as met behulp van de console van de controller fase voor die as. Het werkgebied moet verplaatsen in stappen van 500 nm tot contact kan worden waargenomen vanuit de camera bovenaanzicht van de AFM. Contact tussen de array en substraat kunnen worden waargenomen als een 'witte stip' voor hoog contrast op de top van de afzonderlijke sonde piramides.
- Op dit punt, klik op de 'stop' knop op de besturingssoftware van de AFM om te stoppen met het programma van de spectroscopie van stap 4.5. Dit zal de array intrekken door 10 µm, daarom verlaten van 10 µm voor de uitbreiding mogelijk z-as. Controleer het beeld van de camera van het bovenaanzicht van de AFM om ervoor te zorgen dat de sondes niet in contact met de ondergrond zijn.
5. polymeer pen litho (PPL)
- Navigeer naar de litho-component van de controle-software door te klikken op de knop 'litho' op besturingssoftware. Kies de z-modulatie operationele modus en importeren van een raster (bitmap) of vector image die worden als de litho-patroon gebruikt zal. Gebruiken om het genereren van de functies in de representatieve resultaten weergegeven, een bitmap bestaande 20 x 20 zwarte pixels (Zie aanvullende materiaal), overeenkomt met de litho van een raster van 20 x 20 dots per sonde op de PPL-array.
- De litho-parameters opgeven in het venster 'Pixel grafische Import' van de AFM controller-software.
- Configureer de 'grootte' van het patroon dat moet worden gegenereerd, bijvoorbeeld, 40 µm in lengte en breedte. Deze parameters geven de breedte- en lengtegeleiders waarover de afbeelding in de bitmap wordt teruggebracht. Voor het genereren van functies in de representatieve resultaten weergegeven, een breedte en lengte van 40 µm in beide dimensies te gebruiken.
- De 'oorsprong' van het patroon moet worden gegenereerd op 25 µm op zowel x - en y -as instellen. Deze parameters bepalen het midden van de afbeelding ten opzichte van het middelpunt van de AFM x/y-assen. Deze parameters om te voorkomen dat de regio van het oppervlak waar de sondes in contact tijdens de uitlijning waren instellen.
- Stel de afdrukken 'Parameters'. Deze waarden bepalen hoe de sondes worden uitgebreid (d.w.z. bracht in contact met het oppervlak) in reactie op elke pixel in de bitmapafbeelding.
- Selecteer uit het drop-down menu 'Modulatie Abs Z Pos' en 'Vereenvoudigen om' twee lagen. Deze modus verzoekt de AFM om uit te breiden van de sondes door een absolute afstand bepaald door slechts twee resultaten, 'Black (0)' of 'White (1)' velden.
- Stel de waarden in de 'Black (0)' en 'White (1)' velden op 5 en -5 µm, respectievelijk. Deze waarden bepalen de afstand van de sondes moeten worden verplaatst in reactie op een pixel zwart of wit op de bitmapafbeelding en zijn meestal instellen tussen 3 en 5 µm voor 'Black' (dat wil zeggen, uitbreiden van sondes naar beneden door die afstand ten opzichte van het nulpunt van de as) en -3 tot-5 µm voor 'White' (dat wil zeggen, de sondes naar boven trekken door 3 tot en met 5 µm ten opzichte van het nulpunt).
Opmerking: Deze representatieve afstanden veronderstellen dat een 5 µm uitbreiding leidt tot de sondes komt in contact met het oppervlak en vandaar de generatie van een functie, terwijl de intrekking van een 5 µm de sondes uit de buurt van het oppervlak liften wat resulteert in geen contact. Z-extensie beïnvloedt grootte bepalen van de mate van sonde contact met het resultaat van de ondergrond, meer extensies in de sondes in het oppervlak, wat resulteert in grotere functies verder wordt ingedrukt. 10 - Klik op de knop 'OK' om deze instellingen te implementeren en sluit het venster.
- Voer de 'pauze tijd' in het venster van de lithografie van de AFM besturingssoftware, meestal 1 s. Deze instelling bepaalt hoe lang die de sondes blijven in het uitgebreide standpunt van 'Black', dat meestal tussen 0.1 en 10 s ligt.
: Langere pauzetijden Anmerkung in een groter formaat van de functie te wijten aan de grotere hoeveelheid MHA vervoerd naar het gouden oppervlak. Nadere gegevens over het bepalen van de grootte van kenmerken gegenereerd kunnen worden gevonden in andere verslagen. 20 - De behuizing van de atmosferische controle voor te bereiden.
- Verlaag de atmosferische isolatie-kamer op de AFM en openen/uitvoeren de fabrikant geleverde atmosferische controle-software (MHG_control.exe).
- Stel de atmosferische controle-software om een relatieve vochtigheid van 45% en een temperatuur van 25 ° C en een sfeer uitwisseling 'Flow rate' van 500 mL door deze waarden invoeren in de software. Klik op 'Gebruik' ter uitvoering van de instellingen. De atmosferische controlemodule zal dan beginnen te pomp bevochtigde lucht in de kamer.
: Hogere luchtvochtigheid Anmerkung in een groter formaat van de functie als gevolg de vorming van een groter water meniscus gegenereerd tussen pen arrays en oppervlak. 21 deze waarde ligt meestal tussen 40 en 60%. Het debiet ligt meestal tussen de 300 en 500 mL. Grotere stromen toestaan de gewenste vochtigheidsgraad te komen sneller maar minder nauwkeurig is. De representatieve resultaten gebruiken een debiet van 500 mL voor de eerste generatie van vochtigheid en verkleind tot 300 mL bij het bereiken van de gewenste luchtvochtigheid, een nauwkeurige en stabiele om kwaliteitsniveau te handhaven tijdens lithografie.
- Zodra de gewenste luchtvochtigheid wordt verkregen, start u de lithografische volgorde door op de 'start'-knop op de interface van de software.
- Na voltooiing van de lithografie, de z-as fase controller console Hiermee kunt het substraat uit de buurt van de array door het intrekken van de fase door 500 µm. Verwijder de atmosferische isolatie-zaal van de berg.
- Wissel de ontgrendelingshendel van de fase om te vergrendelen van de monster-fase en deactiveren van de krachtsensors, zoals aangegeven door de instructies van de fabrikant van de AFM, vervolgens het substraat uit het werkgebied verwijderen.
6. patroon visualisatie
- Patronen kunnen worden gevisualiseerd met behulp van een van de volgende methoden, zijdelingse kracht scanning probe microscopie of chemische etsen.
- Scan het patroon oppervlak aan de AFM met laterale force-modus met behulp van contact modus cantilever te onderzoeken de functies videoframes.
Opmerking: Laterale kracht microscopie kan worden gebruikt als een niet-destructieve methode voor het weergeven van de functies die zijn geproduceerd door polymeer pen lithografie; met deze methode kan slechts een relatief klein gebied echter gevisualiseerde (meestal 100 x 100 µm). - Aangezien de gedeponeerde MHA als een etsen weerstaan fungeren kan, kan chemische etsen worden gebruikt om het goud uit de gebieden van niet-patroon. De resulterende unetched gebieden kunnen vervolgens worden gevisualiseerd door optische microscopie, wat betekent dat een groot gebied kan tegelijk worden bekeken. 18
Opmerking: Substraten die zijn geëtst op deze manier niet dan worden gebruikt voor de volgende cel cultuur experimenten die hieronder worden beschreven.- Afzonderlijk, waterige oplossingen van 40 mM thioureum, 27 mM ijzer(III) nitraat- en 100 mM zoutzuur te bereiden. Bereid de etchant door het mengen van 5 mL van elk van deze drie oplossingen. Vers Meng vóór elk gebruik. 22
Let op: thioureum, ijzer(III) nitraat en zoutzuur zijn giftig. Lees MSDS voordat u gaat werken met deze oplossing. Veiligheidsuitrusting moet gedragen worden tijdens het verwerken van de chemische stof. - Breng het patroon substraat in een petrischaal en Pipetteer, voldoende etchant-oplossing in de schotel ter dekking van het oppervlak van het substraat (meestal 10 mL). Houden van het substraat ondergedompeld voor 4-5 min naar etch 15 nm van goud (met een geschatte snelheid van 3 nm/min).
- Bij het etsen is voltooid, verwijderen van het substraat en spoel met water en drogen met een stikstofstroom.
Opmerking: De voltooiing van het ETS proces wordt bepaald door de dikte van de gouden oppervlak verkregen (stap 3.1) die zijn gekoppeld aan de ETS opgegeven snelheid (stap 6.2.2). - Inspecteer de geëtste gouden functies onder heldere veld optische microscopie. De overige gouden functies die nog moeten worden die overeenkomt met het patroon dat werd gedrukt weergegeven (uit stap 5.2). Het gehele oppervlak homogene, dit geeft aan dat een aanzienlijke hoeveelheid goud blijft en de etsen stap (volgende stap 6.2.2) moet worden herhaald voor 1-2 min.
- Afzonderlijk, waterige oplossingen van 40 mM thioureum, 27 mM ijzer(III) nitraat- en 100 mM zoutzuur te bereiden. Bereid de etchant door het mengen van 5 mL van elk van deze drie oplossingen. Vers Meng vóór elk gebruik. 22
7. patroon functionalization met fibronectine
- Het patroon substraten onderdompelen in een oplossing van 1 mM (11-mercaptoundecyl) hexa(ethylene glycol) oplossing in ethanol voor 1 h. wassen het substraat driemaal met ethanol en droog grondig onder een stroom van stikstof. Deze stap passiveringen de unpatterned gouden gebieden.
Let op: hexa(ethylene glycol) (11-mercaptoundecyl) is giftig. Lees MSDS voordat u gaat werken met deze oplossing. Veiligheidsuitrusting moet gedragen worden tijdens het verwerken van de chemische stof. - De substraten in een 10 mM Co (3)2 waterige oplossing gedurende 5 min. onderdompelen. Verwijder vervolgens de substraten uit de oplossing, driemaal met ultrazuiver water wassen en droog onder een stroom van droge stikstof.
Let op: Co (3)2 is giftig. Lees MSDS voordat u gaat werken met deze oplossing. Veiligheidsuitrusting moet gedragen worden tijdens het verwerken van de chemische stof. - Onderdompelen van het substraat in een 50 µg Mo/mL oplossing van fibronectine in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en Incubeer bij 4 ° C voor 16 h. wassen het substraat driemaal met PBS en droog het substraat onder een stroom van droge stikstof.
Opmerking: Fibronectine is gebonden aan MHA-matiemaatschappij gebieden via chelatie van Co(II) door de terminal carbonzuur-groepen op de MHA. Fibronectine wordt vervolgens gebonden aan Co(II) via de collageen-bindend domein. 23 - Indien gewenst, visualiseer de fibronectine oppervlak-gebonden door etikettering van het met fluorescerende antilichamen:
- Toepassing van een oplossing van 2 mL van 1:100 unconjugated konijn anti-fibronectine primair antilichaam in 5% (m/v) van bovien serumalbumine (BSA) in PBS op het oppervlak en Incubeer bij 4 ° C voor 16 h. Aspirate het supernatant en spoel driemaal met PBS.
- Het substraat in een oplossing van 2 mL van fluorescently geconjugeerd anti-konijn secundair antilichaam (bij de fabrikant opgegeven verdunning, 2 druppels/mL) in 5% (m/v) van de BSA in PBS dompelen, dekking in aluminiumfolie en Incubeer bij kamertemperatuur voor 1 h. Aspirate de supernatant en wassen drie keer met PBS.
- Record de epifluorescence microscopie beelden van de functies die gebruikmaken van een fluorescentie Microscoop volgens de aanwijzingen van de fabrikant met een excitatie-filter ingesteld tot en met 594 nm.
8. celkweek op nanofabricated oppervlakken
- Maak een suspensie van goed gekarakteriseerd hMSCs die tussen de 4th en 6th passage. 24
- Opschorten van een confluente kolf van cellen door eens spoelen met 10 mL PBS, distantiëren van zelfklevend cellen door toevoeging van 5 mL trypsine/EDTA in de maatkolf van T75 weefselkweek en Incubeer de kolf in een bevochtigde ruimte bij 37 ° C aangevuld met 5% CO2 gedurende maximaal 5 minuten tot 90% o f cellen losgekoppeld van oppervlak.
- Vervolgens Voeg 6 mL verse voedingsbodems met 10% foetaal kalfsserum (FCS) in de destillatiekolf en kort spoel de kolf met de media toegevoegd. Pipetteer celsuspensie in een tube van 15 mL centrifuge en centrifugeer bij 400 g bij 25 ° C gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 3 mL verse voedingsbodems.
- Tellen van de celdichtheid met behulp van een hemocytometer-25 en de dichtheid van de celsuspensie tot 2 x 104 cellen/mL aanpassen door de toevoeging van een passende omvang van voedingsbodems.
- Zaad de cellen op substraten bij een dichtheid van 104 cellen/cm2.
- Snijd het substraat in 1 x 1 cm2 met diamant scribe en plaats deze in een put in 12-well weefselkweek plaat.
- Pipetteer 2 mL celsuspensie in kweekmedia (uit stap 8.1.4) in de put en broeden in een bevochtigde ruimte bij 37 ° C aangevuld met 5% CO2 gedurende 24 uur.
- Na celgroei op de patronen, de mate van cel gehechtheid en verspreiden met immunofluorescentie te analyseren:
- Verwijder media en wassen van substraten keer met PBS. Het herstellen van cellen met 2 mL van een oplossing van 4% paraformaldehyde in PBS (vooraf opgewarmd tot 37 ° C) gedurende 20 min. in de zuurkast en wassen drie keer met PBS.
Let op: Paraformaldehyde is giftig. Lees MSDS voordat u gaat werken met deze oplossing. Veiligheidsuitrusting moet gedragen worden tijdens het verwerken van de chemische stof. - Permeabilize van de cellen met 2 mL van een oplossing van 0.5% wasmiddel (Zie Tabel van materialen) in PBS gedurende 15 minuten, daarna wassen drie keer met PBS.
- Het substraat in 2 mL van een oplossing van unconjugated konijn anti-fibronectine primair antilichaam bij verdunning 1:100 met 5% (m/v) BSA in PBS onderdompelen en Incubeer bij 4 ° C voor 16u, dan Spoel driemaal met 0,1% (v/v) Tween-20 in PBS (PBST).
- Vervolgens onderdompelen van het substraat in 2 mL van een oplossing van fluorescently geconjugeerd anti-konijn secundair antilichaam (verdund met 5% (m/v) BSA in PBS bij de fabrikant opgegeven verdunning, 2 druppels/mL), dekken in aluminiumfolie en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, daarna wassen drie keer met 0,1% PBST.
- Om een label met door samensmelting van filamenten actine, onderdompelen 2 mL fluorescently geconjugeerd phalloidin bij een verdunning 1:250 in PBS, dekking in aluminiumfolie en Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 minuten en spoel driemaal met PBS.
- Gelijktijdig vlek celkernen en mount het substraat door het toepassen van een druppel medium met DAPI en bedek met een dekglaasje aan te monteren.
- Verwijder media en wassen van substraten keer met PBS. Het herstellen van cellen met 2 mL van een oplossing van 4% paraformaldehyde in PBS (vooraf opgewarmd tot 37 ° C) gedurende 20 min. in de zuurkast en wassen drie keer met PBS.
- Visualiseren van cellen een fluorescentie Microscoop volgens de instructies van de fabrikant, met excitatie filters van 365 nm voor kernen (DAPI), 488 nm voor F-actine en 594 nm voor fibronectine.
Representative Results
Om te controleren of de automatische uitlijning is geweest, werden de grafieken van de uitlijning gegevens (in het werkblad uit stap 4.8) uitgezet onderzocht. Waar het uitlijning proces succesvol was geweest bleek de twee percelen, overeenkomt met de hoek waaraan de monster-fase geweest langs de assen van θ en φ bewogen heeft, een reeks van stijgende en dalende gegevenspunten. In elk van de percelen, bleek twee lineaire vlagen van de gegevenspunten een welomschreven snijden "piek" met vermelding van de maximale z-uitbreiding en de overeenkomstige hoek waartegen uitlijning was bereikt (figuur 4A en 4B). Dit proces is herhaalde vier keer (dat wil zeggen, twee keer voor elk zwaartepunt) en uitgezet als een set van vier coördinaten. Het snijpunt van elke combinatie van coördinaten toont dus de algemene optimale hoeken (figuur 4C). 13 in gevallen waar de uitlijning niet succesvol was, kan worden geconstateerd dat hun overeenkomstige θ en φ hoek percelen geen goede kwaliteit lineaire past geven of niet (Figuur 5 snijden). Dergelijke mislukte afstemmingen zijn meestal als gevolg van de matrices ten onrechte wordt bijgesneden of gemonteerd aan de sonde houder (stap 1.7, 1.8 en 2.2). In deze gevallen de arrays werden weggegooid een nieuwe voorbereid en gemonteerd (stappen 1 en 2) en het uitlijning proces herhaald (stap 4).
Na succesvolle uitlijning en lithografie met MHA door PPL, waren patroon gouden substraten dan beeld met behulp van laterale kracht microscopie om te onderzoeken of afzetting had plaatsgevonden. Een grotere ruimte-onderzoek van de bedrukte oppervlakken was ook optische microscopie van de substraten olv na ETS van het goud niet beschermd door de gedeponeerde thiol (Figuur 6 en Figuur 7). Echter de geëtste patronen kunnen niet worden gebruikt voor verdere functionalization en moeten alleen worden gebruikt ter bevestiging van de patronen op representatieve monsters van een partij van gedrukte oppervlakte substraten. Als de geëtste patronen weergeven lege gebieden overeenkomt met individuele pennen (Figuur 8), dit resultaat geeft aan dat de productie van arrays van de sonde niet met succes is gebeurd, dat sommige sondes zijn beschadigd of ontbreken. Deze heterogeniteit van de sondes kan worden veroorzaakt door het gebruik van een oude meester waar de perfluorinated-coating heeft gedragen weg (stap 1.3), wat resulteert in sommige sondes die weg worden gescheurd, wanneer de matrix wordt gescheiden van de meester. In deze gevallen moet een nieuw model worden gebruikt. Het resultaat kan ook zijn als gevolg van de aanwezigheid van lucht bubbels gevangen tussen het glas back-ups maken en de master (stap 1.5), of als de sonde matrix was niet netjes gescheiden van de master na het uitharden (stap 1.8).
TL microscopie beelden van de oppervlakken van de fibronectine matiemaatschappij bebroede hMSCs ook waren verzameld (Figuur 9). In het algemeen, alle substraten bleven stabiel binnen de in vitro cultuur-omgeving en de cellen vastgehouden en hun morfologie op de gedrukte patronen in het geval van kleinere geïsoleerde 20 x 20 scala aan functies aangepast.
Figuur 1. Schematische weergave van polymeer pen lithografie waarop moleculaire inkt vervoer via een water-meniscus sondepunt. (A) de zijaanzicht en (B) het bovenaanzicht van de polymeer pen matrix blijkt dat wanneer de sonde matrix en oppervlakte substraat zijn volledig op elkaar afgestemd, alle de sondes in contact het oppervlak tegelijkertijd komen, wat resulteert in litho heeft. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Schematisch diagram van polymeer pen lithografie instellen omhoog (A) uitgebreide zijaanzicht van experimentele instellen waar de matrix bereid sonde is gehecht aan de sonde houder en gemonteerd op AFM scanner. Het substraat in het werkgebied is geplaatst, onder die bevinden zich de drie force sensoren. (B) een vertegenwoordiging van de geassembleerde instrumentatie, tonen de AFM scan hoofd ten opzichte van het werkgebied van de steekproef. (C) onderste weergave toont kracht sensor locatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Schematische voorstelling van het programma van de spectroscopie voor het alignement procedure. De AFM scanner is ingesteld op de sondes naar monster verplaatsen door een afstand van 10 µm binnen 100 ms, gehouden op positie voor 250 ms, gevolgd door een retractie van 10 µm binnen 100 ms, en vervolgens voor 250 ms in de terugetrokken positie. De beweging wordt dan herhaald tijdens het uitlijning proces. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Grafieken ter illustratie van een succesvolle aanpassing. Grafieken van de positie van de z tegen de tilt hoeken a θ en φ (B) voor een succesvolle aanpassing, waar ● geeft de werkelijke waarden gemeten en + toont u het beste past bij de methode van de kleinste kwadraten. (C) grafiek van φ tegen θ uitgerust hoeken met de vier punten waar de maximale z-positie werd bereikt. Het snijpunt gemarkeerd is de uiteindelijke optimale tilt hoek over beide assen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5. Grafieken ter illustratie van een mislukte uitlijning. Grafieken van de positie van de z tegen de tilt hoeken a θ en φ (B) voor een mislukte uitlijning, waar ● geeft de werkelijke waarden gemeten en + toont u het beste past bij de methode van de kleinste kwadraten. (C) grafiek van φ tegen θ uitgerust hoeken met de vier punten waar de maximale z-positie werd bereikt. Geen duidelijke optima of snijpunt in acht worden genomen en daarom de optimale uitlijning hoeken niet worden opgelost. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6. Illustratieve optische microscopie en atomic force microscopie beelden van gouden substraten die werden door de uitgelijnde PPL arrays met MHA patroon en vervolgens geëtst. (A) en (B) zijn sequentieel vergrote optische microscopie beelden van de geëtste patronen; (C) is een AFM topografie beeld van een enkele raster van patronen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7. Illustratieve optische microscopie beelden van gouden substraten die werden door de uitgelijnde PPL arrays met MHA patroon en vervolgens geëtst. (A) en (B) zijn sequentieel vergrote optische microscopie beelden van geëtste patronen en (C) is een afbeelding met een lagere vergroting waarin groot gebied homogene patronen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8. Illustratieve optische microscopie beeld van een gouden substraat dat was ongelijk patroon met MHA en vervolgens geëtst. De beoogde patronen (getoond in de inzet) waren herhalende rasters van 20 dot lijnen ingedeeld in 20 lijnen, met ieder twee lijnen geproduceerd door het verhogen van de z-as verlenging met 1 µm (variërend van 5 tot-5 µm). Het kan worden gezien dat op sommige gebieden geen patronen worden gegenereerd, als gevolg van ontbrekende sondes op deze locaties. In de gebieden waar slechts twee lijnen van stippen worden geproduceerd, dit resultaat geeft aan dat een sonde aanwezig is, maar het is niet van dezelfde hoogte als de volledig functionerende sondes, dus enige storting beschikt wanneer de matrix wordt uitgebreid tot de volledige z-as afstand. In dit beeld, is het contrast opzettelijk veranderd zodat de waarneming van de gedeeltelijk afgedrukte gebieden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9. Epifluorescence microscopie beelden van hMSCs gekweekt op de fibronectine arrays templated door PPL. (A) en (B) zijn van hoge vergroting beelden weergegeven: afzonderlijke cellen. (C) toont een voorbeeld-patroon van de fibronectine matrix zonder een aanhanger cel en (D) is het beeld van een breed veld van de cellen gekweekt in een raster-regeling (een schematische voorstelling van het afgedrukte patroon blijkt ook uit de inlay). De cellen zijn gekleurd om te tonen fibronectine (rood), F-actine (groen) en cel kernen (blauw). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Dit protocol dient om gebruikers te voorzien van een handige methode snel uit te voeren nanolithographic patronen met hoge uniformiteit en controleerbaar grootte over grote gebieden (cm2). Substraten, rekening houdend met de nanopatterns van deze grote gebied kunnen dan verder worden uitgewerkt voor een verscheidenheid van toepassingen. Een belangrijke toepassing van deze technologie is in de generatie van nanofabricated oppervlakken voor celoppervlak interactie studies. Deze lijst geeft illustratieve voorbeelden van celkweek voor deze materialen, controle van de hMSC morfologie aangetoond door nanofabricated substraten.
De essentiële factor van dit protocol is de automatisering van het alignement procedure (stap 4) waarmee zeer uniform en hoog-productie productie van functies op oppervlakken, tot nanoschaal resolutie, waarmee de snelle opeenvolging van cel cultuur experimenten. Het polymeer pen lithografie uitgevoerd met dit algoritme uitlijning kan genereren nanoschaal functies binnen ongeveer 30 min. De reproduceerbaarheid en de nauwkeurigheid van de automatische uitlijning, en dus de uniformiteit van de patroon functies, is echter kritisch afhankelijk van de kwaliteit van de sonde matrices die worden geproduceerd (stap 1 en 2). Eventuele gebreken in hun voorbereiding die leiden tot een botte, gebroken of ontbrekende sondes; zoals ingesloten lucht bubbels (stap 1.5) of onjuiste scheiding van de sondes van de meester (stap 1.8) kan leiden tot onjuiste uitlijning en slechte kwaliteit lithografie.
Dit gemeld methode deelt een beperking gemeen met een andere uitlijning methoden die afhankelijk zijn van force feedback. De nauwkeurige bepaling van wanneer de sondes in contact met het oppervlak zijn wordt beperkt door de noodzaak voor achtergrond trillingen veroorzaakt door het omringende milieu en het verkeer van de monster-fase. In het algemeen, de sensoren hebben een gevoeligheid van kracht in het µN regime (2 µN in dit geval), maar de uitlijning algoritme is ontworpen voor alleen een kracht van minstens 490 µN registreren als definitieve contact tussen de sondes en het oppervlak, teneinde eventuele 'false positives' resul ting van achtergrondgeluiden. 13 zo, deze methode heeft de neiging te produceren grote functies (1-2 µm) Aangezien de sondes moet uitgebreid met een grote afstand op de z-as (met een daaruit voortvloeiende hogere kracht) om te kunnen registreren contact. Om te compenseren, kleinere functies kunnen worden gegenereerd door het verminderen van de z-as afstand afgelegd tijdens de litho stap (bijvoorbeeldhet invoeren van de 'Zwarte' instelling in stap 5.2.3.2 als 3 µm in plaats van 5 µm).
Niettemin, zelfs met deze beperking, de automatisering algoritme is kunnen inspelen op een kritiek aspect bij de toepassing van heeft scannen sonde lithografie methoden, zoals uitlijning was eerder het meest tijd veeleisende en onnauwkeurig stap in de uitvoering van deze technieken. Deze automatisering nu verschuift de snelheidslimieten stap van het fabricageproces van de uitlijning naar de lithografische schrijven zelf. Terwijl dit protocol de toepassing van deze alignement procedure voor PPL blijkt, kan het kader worden toegepast op een aantal SPL technieken zoals lipide-DPN26 en matrix-bijgewoonde lithografie27 evenals mogelijke toekomst katalytische sonde systemen. 28
Disclosures
De uitlijning algoritme software werden ontwikkeld door en zijn eigendom, de Universiteit van Manchester. Het is beschikbaar voor download op http://www.click2go.umip.com/.
Acknowledgments
De auteurs erkennen financiële steun uit een verscheidenheid van bronnen, met inbegrip van de UK Engineering and Physical Sciences Research Council (verlenen refs. EP/K011685/1, EP/K024485/1) en een afgestudeerde studententijd voor JH; het vertrouwen van de Leverhulme (RPG-2014-292); de Wellcome Trust institutionele strategische Steunfonds (105610/Z/14/Z); de British Council (216196834); en de Universiteit van Manchester voor een universiteit van Manchester Research Institute (UMRI pomp zelfaanzuigende Fonds) en een presidentiële doctorale beurs voor SW. technische bijstand door Dr. Andreas Lieb (Nanosurf AG) ook dankbaar is erkend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| FlexAFM mounted on a motorised 5-axis (XYZΘΦ) translation and goniometer stage | NanoSurf | P40008 | |
| AFM control software | NanoSurf | C3000 | |
| Engraving pen | Sigma-Aldrich | Z225568 | |
| Plasma Cleaner | Harrick plasma | PDC-32G-2 | |
| PlasmaFlo | Harrick plasma | PDC-FMG-2 | |
| Economy Dry Oxygen Service Pump | Harrick plasma | PDC-OPE-2 | |
| Tube Rotator | Stuart | SB3 | |
| Vacuum Desiccator | Thermo Fisher Scientific | 5311-0250 | |
| Milli-Q Water Purification System | Merck Millipore | ZRXQ015WW | |
| Modular Humidity Generator | proUmid | MHG32 | |
| Proline Plus Pipette 100-1000 µL | Sartorius | 728070 | |
| Silicon masters | NIL Technology | custom-made | |
| Upright snapshot fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Microscope objectives | Olympus | 10x and 60x UPlan FLN ∞/-/FN 26.5 | |
| Upright bright field microscope | Leica | DM 2500M | |
| Ultrasonicator | Ultrawave Ltd. | U95 | |
| Spreadsheet for recording and intepreting automated alignment results | Microsoft | Excel | |
| Reagent | |||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 34863 | FLAMMABLE |
| Microscope Sildes, Clear, Ground | Thermo Fisher Scientific | 451000 | |
| (7–8% vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxy-terminated | Gelest | VDT-731 | |
| 1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane | Gelest | SIT7900.0 | |
| Platinum(0)-1,3-divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane complex solution | Sigma-Aldrich | 479527 | HARMFUL, TOXIC |
| (25–35% methylhydrosiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxane-terminated | Gelest | HMS-301 | |
| Weigh Boat 100 mL | Scientific Laboratory Supplies | BALI828 | |
| Pasteur pipette | Appleton Woods | KS230 | |
| Petri dish | SARSTEDT | 82.1473 | |
| Razor blade | Thermo Fisher Scientific | ST10-031T | |
| Adhesive Carbon Tape | Agar scientific | AGG3939 | |
| 16-Mercaptohexadecanoic acid | Sigma-Aldrich | 448303-1G | HARMFUL, TOXIC |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 34852 | FLAMMABLE |
| Gold coated microscope slide | Sigma-Aldrich | 643203 | Once opened gold will remain reactive to thiols for at least 1 month |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | HARMFUL, TOXIC |
| Iron(III) nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | 529303 | HARMFUL, TOXIC |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 84415 | HARMFUL, TOXIC |
| (11-Mercaptoundecyl)hexa(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 675105 | HARMFUL, TOXIC |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Cobalt(II) nitrate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 203106 | HARMFUL, TOXIC |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium | Lonza UK | PT-3001 | |
| Human Mesenchymal Stem Cells | Lonza UK | PT-2501 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Heraeus Multifuge X1 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004210 | |
| CELLSTAR Centrifuge Tubes | Greiner Bio-One | 188261 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | P/0840/53 | HARMFUL, TOXIC |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | "Detergent" in manuscript |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Rabbit anti-fibronectin antibody | Abcam | ab2413 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | R37117 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| 12-well plate | Thermo Fisher Scientific | 10253041 | |
| T75 tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10790113 | |
| cantilever | BudgetSensor | ContAl-G |
References
- Saavedra, H. M., et al. Hybrid Strategies in Nanolithography. Rep. Prog. Phys. 73, 036501 (2010).
- Gates, B. D., et al. New Approaches to Nanofabrication: Molding, Printing, and Other Techniques. Chem. Rev. 105, 1171-1196 (2005).
- Garcia, R., Knoll, A. W., Riedo, E. Advanced Scanning Probe Lithography. Nat. Nanotechnol. 9, 577-587 (2014).
- Piner, R. D., Zhu, J., Xu, F., Hong, S., Mirkin, C. A. "Dip-Pen" Nanolithography. Science. 283, 661-663 (1999).
- Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. Applications of Dip-Pen Nanolithography. Nat. Nanotechnol. 2, 145-155 (2007).
- Lewis, A., et al. Fountain Pen Nanochemistry: Atomic Force Control of Chrome Etching. Appl. Phys. Lett. 75, 2689-2691 (1999).
- Kim, K. -H., Moldovan, N., Espinosa, H. D. A Nanofountain Probe with Sub-100 Molecular Writing Resolution. Small. 1, 632-635 (2005).
- Gruter, R. R., Voros, J., Zambelli, T. FluidFM as a Lithography Tool in Liquid: Spatially Controlled Deposition of Fluorescent Nanoparticles. Nanoscale. 5, 1097-1104 (2013).
- Salaita, K., et al. Massively Parallel Dip-Pen Nanolithography with 55 000-Pen Two-Dimensional Arrays. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7220-7223 (2006).
- Huo, F., et al. Polymer Pen Lithography. Science. 321, 1658-1660 (2008).
- Shim, W., et al. Hard-Tip, Soft-Spring Lithography. Nature. 469, 516-520 (2011).
- Liao, X., Braunschweig, A. B., Mirkin, C. A. "Force-Feedback" Leveling of Massively Parallel Arrays in Polymer Pen Lithography. Nano Lett. 10, 1335-1340 (2010).
- Wang, S., Hosford, J., Heath, W. P., Wong, L. S. Large-Area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment of Probe Arrays. RSC Adv. 5, 61402-61409 (2015).
- Noh, H., et al. "Multipoint Force Feedback" Leveling of Massively Parallel Tip Arrays in Scanning Probe Lithography. Small. 11, 4526-4531 (2015).
- Dalby, M. J., et al. The Control of Human Mesenchymal Cell Differentiation Using Nanoscale Symmetry and Disorder. Nat. Mater. 6, 997-1003 (2007).
- Connell, C. D., Higgins, M. J., Moulton, S. E., Wallace, G. G. Nano-Bioelectronics via Dip-Pen Nanolithography. J. Mater. Chem. C. 3, 6431-6444 (2015).
- Giam, L. R., et al. Scanning Probe-Enabled Nanocombinatorics Define the Relationship Between Fibronectin Feature Size and Stem Cell Fate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 4377-4382 (2012).
- Eichelsdoerfer, D. J., et al. Large-Area Molecular Patterning with Polymer Pen Lithography. Nat. Protoc. 8, 2548-2560 (2013).
- Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. Irreversible, Direct Bonding of Nanoporous Polymer Membranes to PDMS or Glass Microdevices. Lab Chip. 10, 548-552 (2010).
- Liao, X., Braunschweig, A. B., Zheng, Z., Mirkin, C. A. Force- and Time-Dependent Feature Size and Shape Control in Molecular Printing via Polymer-Pen Lithography. Small. 6, 1082-1086 (2010).
- Sheehan, P. E., Whitman, L. J. Thiol Diffusion and The Role of Humidity in "Dip Pen Nanolithography". Phys. Rev. Lett. 88, 156104 (2002).
- Geissler, M., et al. Fabrication of Metal Nanowires Using Microcontact Printing. Langmuir. 19, 6301-6311 (2003).
- Gmeiner, B., Leibl, H., Zerlauth, G., Seelos, C. Affinity Binding of Distinct Functional Fibronectin Domains to Immobilized Metal Chelates. Arch. Biochem. Biophys. 321, 40-42 (1995).
- Curran, J. M., et al. Introducing Dip Pen Nanolithography as a Tool for Controlling Stem Cell Behaviour: Unlocking the Potential of the Next Generation of Smart Materials in Regenerative Medicine. Lab Chip. 10, 1662-1670 (2010).
- Davey, M. R., Anthony, P. Plant Cell Culture: Essential Methods. , John Wiley & Sons. 153-172 (2010).
- Brinkmann, F., et al. Interdigitated Multicolored Bioink Micropatterns by Multiplexed Polymer Pen Lithography. Small. 9, 3266-3275 (2013).
- Senesi, A. J., Rozkiewicz, D. I., Reinhoudt, D. N., Mirkin, C. A. Agarose-Assisted Dip-Pen Nanolithography of Oligonucleotides and Proteins. ACS Nano. 3, 2394-2402 (2009).
- Carnally, S. A. M., Wong, L. S. Harnessing Catalysis to Enhance Scanning Probe Nanolithography. Nanoscale. 6, 4998-5007 (2014).
