Summary
Här presenterar vi ett protokoll för nätverkslänkar skanning sond nanolithography aktiverad iterativ anpassningen av sonden matriser, samt utnyttjandet av litografiska mönster för cellytan interaktionsstudier.
Abstract
Scanning sonden mikroskopi har möjliggjort skapandet av en mängd metoder för konstruktiv ('tillsatser') uppifrån tillverkning av nanometerskalan funktioner. Historiskt har varit en stor nackdel med skanning sonden litografi intimt låg genomströmning av inre sonden system. Detta har tacklats med hjälp av matriser av flera sonder för att möjliggöra ökad nanolithography genomströmning. För att genomföra sådana parallelliserad nanolithography, korrekt uppriktning av sonden matriser med substrat yta är viktigt, så att alla prober göra kontakt med ytan samtidigt när litografiska mallning börjar. Det här protokollet beskriver användningen av polymer penna litografi att producera nanometerskalan funktioner över centimeter och medelstora utrymmen, underlättas genom användning av en algoritm för snabb, noggrann och automatiserad uppriktning av sonden matriser. Här visar nanolithography av tioler på guld substrat generering av funktioner med hög jämnhet. Dessa mönster är sedan functionalized med Fibronektin för användning i samband med surface-regisserad morfologi cellstudier.
Introduction
Framstegen inom nanotekniken är beroende av utvecklingen av tekniker kan effektivt och pålitligt fabricera nanoskala funktioner på ytor. 1 , 2 dock generera sådana har över stora områden (flera cm2) tillförlitligt och på relativt låg kostnad är en icke-trivial strävan. De flesta befintliga tekniker, härrör från halvledarindustrin, lita på ablativ photolithography att fabricera 'hårt' material. Mer nyligen, litografiska tekniker härrör från genomsökning sonden mikroskopi (SPM) har dykt upp som en bekväm och mångsidig strategi för den rapid prototyping av nanoskala mönster. 3 SPM-baserade tekniker kan snabbt och bekvämt 'skriva' något användardefinierade mönster. Den mest kända av dessa är dopp-pen nanolithography (DPN), uppfunnen av Mirkin et al.,4 där en skanning sond används som en ”penna” för att överföra en molekylär 'bläck' till ytan producerar funktioner på ett sätt som är analoga med skrivande. Under omgivningsförhållanden, som en sond är scannade över en yta 'bläck' molekylerna överförs till den ytan via en vatten menisk som bildar mellan sonden och ytan (figur 1). DPN kan således nanolithographic nedfall av ett brett utbud av material, inklusive 'mjuka' material såsom polymerer och biomolekyler. 5 relaterade tekniker använder sonder konstruerad med kanaler för leverans av flytande, omväxlande kallas 'nanopipettes' och 'nano-fountain pennor', har också rapporterats. 6 , 7 , 8
Det främsta hindret för en bredare tillämpning av SPM-derived litografi är genomströmning, eftersom det kräver en orimligt lång tid att mönster centimeter-skala områden med en enda sond. Tidiga insatser för att adressera detta fokuserade på parallelization av fribärande-baserade DPN, med både 'en-dimensionell' och 'tvådimensionella' (2D) sond matriser som rapporteras för litografin av centimeter stora områden. 5 , 9 dock dessa fribärande arrayer produceras genom relativt komplexa utgångsämnet framställningsmetoder och är relativt bräckliga. Uppfinningen av polymer penna litografi (PPL) upp denna fråga genom att ersätta de vanliga SPM-utliggare med en 2D array av mjuk siloxan elastomer sonder limmade på en glasskiva. 10 denna enkla sonden setup avsevärt minskar kostnaderna och komplexiteten av mönstring stora områden, öppna upp nanolithography till ett bredare användningsområde. Denna fribärande-fri arkitektur har utökats till att hård-tip soft-våren litografi,11 som ger en hybrid mjuk elastomeriska backing hårt kisel tips ger förbättrad upplösning jämfört med mönster som produceras med hjälp av mjuk elastomer tips.
En avgörande faktor i utförandet av dessa 2D array teknik är att sonden matrisen måste vara exakt parallellt med ytan substratet så att när litografi utnyttjas, alla sonderna kommer i kontakt med ytan samtidigt. Även en liten förskjutning kan orsaka en stor skillnad i storleken från ena sidan av matrisen till den andra, eftersom vissa sonder kommer i kontakt med ytan tidigare under nedstigningen av arrayen, medan andra kommer att komma i kontakt senare eller inte alls. 12 exakt anpassning är särskilt viktigt med PPL på grund av deformability av de mjuka elastomer sonderna, där sonderna kontakta ytan tidigare komprimeras, vilket ger en större fotavtryck på ytan.
Det tidiga arbetet på PPL anställd rent visuell inspektion att vägleda justeringsprocessen, med hjälp av en kamera monterad ovanför matrisen för att följa deformationen av de pyramidala sonderna som de tog i kontakt med ytan. 10 justering bedömdes genom att observera vilken sida av proberna kom i kontakt med ytan först, och sedan justera vinkel och upprepa proceduren på en iterativ sätt tills skillnaden i kontakt på varje sida av sonden var icke-urskiljbara för ögat. Som proceduren justering är beroende av subjektiv visuell inspektion av operatören, är reproducerbarhet låg.
En mer objektiv syn har därefter utvecklats, bestående av en kraftsensor monterad under substraten för att mäta den kraft som anbringas vid kontakt av sonderna på ytan. 12 justering uppnåddes således genom att justera de tilt vinklar för att maximera den kraft som utövas, som visade att alla sonderna samtidigt i kontakt. Denna metod visade att anpassningen till inom 0,004 ° om ytan var möjligt. Denna 'force feedback nivellering' har nu genomförts i helautomatiska system i två oberoende rapporter. 13 , 14 både använda en triad av kraftgivare monterade antingen under substratet eller ovanför matrisen och mäta mängden kraft som utövas vid kontakt mellan sonden matriser och yta. Dessa system ger hög precision, anmäla avvikelser på ≤0.001 ° över en 1 cm längd skala,14 eller ≤ 0.0003 ° över 1,4 cm.13 dessa automatiserade alignment system ger också stora besparingar i operatörstiden och totala tiden för att slutföra den litografi-processen.
En viktig tillämpning av hög genomströmning ytan fabrication aktiveras med denna teknik är generation av cell kultur substrat. Det är nu väl etablerat det cell fenotypen kan manipuleras genom att styra inledande samspelet mellan celler och surface-funktioner, och att detta kan förbättras på nanonivå. 15 särskilt sonden litografi skanningsmetoderna har visat sig vara en lättköpt metod för att producera en mängd nanofabricerade ytor för sådan cell kultur experiment. 16 till exempel ytor presentera nanoskala mönster själv monterade enskiktslager och extracellulära matrix proteiner mallade av PPL och DPN har använts för att studera potentialen för nano-modifierade material i material inducerad differentiering av stamceller. 17
Det här protokollet beskriver utnyttjandet av en modifierad atomic force Mikroskop (AFM) system som gör att stora ytor PPL. Vi detalj detektion av kraft använder flera kraftgivare som medel för att bestämma sond-yta kontakt, tillsammans med en algoritm som automatiserar iterativ justeringsprocessen. Efterföljande funktionalisering av dessa mönster med den extracellulära matrix protein Fibronektin och kulturen av humana mesenkymala stamceller (hMSC) beskrivs, som en demonstration av PPL-fabricerade ytor tillämpas för cellodling.
Protocol
1. tillverkning av PPL penna matrisen
- Att förbereda Polydimetylsiloxan (PDMS) sampolymer blandningen:
- Tillsätt 10 µL av platina (0) - 1,3 - divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane komplex lösning och 172 µL av 1,3,5,7-tetrametyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane 250 g (7-8% w/w vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane kopolymer. Blanda komponenterna noggrant på en roterande mixer för 7 dagar för att säkerställa homogen blandning.
FÖRSIKTIGHET: platinum (0) - 1,3 - divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane är giftigt. Läs MSDS innan du arbetar med denna lösning. Säkerhetsutrustning skall användas vid hantering av kemikalien. - Tillsätt 0,5 g (25-35% w/w methylhydrosiloxane)-dimethylsiloxane kopolymer en 1,7 g del av blandningen från steg 1.1.1 i en vägning båt och blanda med en spatel.
- Degas denna blandning av överföring till vakuum exsickator och utsätta blandningen till lågt tryck (200 mTorr, 0.3 mBar) i 20 min tills alla gasbubblor har försvunnit.
- Tillsätt 10 µL av platina (0) - 1,3 - divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane komplex lösning och 172 µL av 1,3,5,7-tetrametyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane 250 g (7-8% w/w vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane kopolymer. Blanda komponenterna noggrant på en roterande mixer för 7 dagar för att säkerställa homogen blandning.
- Plats en 13 x 13 mm glasskiva i en plast skruv-topped injektionsflaskan fylld med 20 mL 2-propanol, sedan placera injektionsflaskan i ett ultraljudsbad i 10 min att ta bort eventuella stora skräp. Tvätta bilderna genom att dränka bilder i färska 2-propanol (100 mL) och torka under en ström av kvävgas.
- Placera en silicon master18 i en 4 cm diameter petriskål och tillsätt tillräckligt avgasade PDMS prepolymer blandning (från steg 1.1) tills helt täckt. 100 µL är vanligtvis krävs för samlingsdokument 20 x 20 mm. Placera master med prepolymer blandningen i ett vakuum exsickator. Degas polymeren i ytterligare 5 minuter att ta bort eventuella gasbubblor som bildas under överföringen av blandningen. O2 plasmabehandling av glas glasen (steg 1.4 nedan) bör utföras medan avgasning pågår.
- Behandla rutorna glas med O2 plasma (600 mTorr) vid maximal RF-effekt för 1 min att ta bort organiska föroreningar och skapa en enhetlig oxidskiktet på glas för vidhäftning av elastomer. 19 använda plasma behandlade bilder omedelbart i nästa steg.
- Noggrant placera den fyrkantiga glasskiva (från steg 1.4) över prepolymer på master (från steg 1.3) med plasma-rengöras vänd. Tryck försiktigt ner glas bilden på kisel befälhavaren att ta bort någon instängd luft och säkerställa en enhetlig film av PDMS är inklämt mellan befälhavaren och bilden.
- Plats inklämt PDMS matrisen från ovanstående steg i en petriskål med kisel behärska längst ned (dvs, med baksidan av en glasskiva som pekar uppåt) och placera skålen i en ugn vid 70−80 ° C för 24−48 h att termiskt bota PDMS.
- Ta bort arrayen botade från ugnen och låt svalna i 15 min, sedan med ett rakblad noggrant bort någon överflödig PDMS från baksidan och sidorna av glaset Skjut och använda en ström av torrt kväve för att blåsa bort alla löst PDMS skräp.
Obs: ta hand inte att repa av kisel master med rakbladet, eftersom detta kan skada den non-stick beläggningen. - Kil ett rakblad i hörnet av matrisen på ett djup av 1 mm och bänd försiktigt arrayen förutom befälhavaren. Utföra den här åtgärden i en enda kontinuerlig lyftande åtgärd; Låt inte matriserna att falla tillbaka på master.
- Försiktigt skär och skrapa bort 0,5 mm av PDMS vid kanterna av matrisen med ett rakblad. Använd en ström av torrt kväve för att blåsa bort alla löst PDMS skräp.
Obs: Det kan vara lättare att utföra denna trimning steg under stereoskop eller ett förstoringsglas. Ta hand inte att repa av kisel master med rakbladet, eftersom detta kan skada den non-stick beläggningen.
2. array förberedelse och substrat montering
- Generera en hydrofil yta på sonden matrisen genom O2 plasmabehandling:
- Placera matrisen PPL penna i en petriskål in plasma kammaren sedan tillämpa vakuum till 600 mTorr. Slå på den plasma generatorn (maximal inställning) för 30 s.
- Frigör vakuumet, ta bort kedjan och kontrollera dess hydrophilicitet genom att lämna 20 µL avjoniserat vatten på matrisen och observera om det finns även sprids av vatten över ytan. Om detta inte sker, omfattas av matrisen en andra omgång plasmabehandling. Efteråt, torr arrayen noggrant med en ström av torr kvävgas.
- Använda dubbelsidig kol tejp, bifoga matrisen på mitten av sondhållaren. Montera sondhållaren på AFM kinematisk innehavaren (figur 2).
- Att läsa PPL matrisen med 16-mercaptohexadecanoic syra (MHA) ('pennanteckningar'):
- Bered 1 mM 16-mercaptohexadecanoic acid (MHA) genom upplösning 8,6 mg i 30 mL etanol i en tub och placera den i ett ultraljudsbad i 10 min att helt upplösa föreningen.
Varning: 16-mercaptohexadecanoic syra är giftiga. Läs MSDS innan du arbetar med denna lösning. Säkerhetsutrustning skall användas vid hantering av kemikalien. - Med hjälp av en mikropipett, insättning 20 µL droppe MHA lösningen på matrisen. Undvik kontakt pipettspetsarna med arrayer. Låt det spridda över hela matrisen, sedan tillåta etanolen avdunsta under omgivningsförhållanden.
Obs: PPL matrisen kan alternativt vara indränkta med färg efter justeringen har ägt rum. 10
- Bered 1 mM 16-mercaptohexadecanoic acid (MHA) genom upplösning 8,6 mg i 30 mL etanol i en tub och placera den i ett ultraljudsbad i 10 min att helt upplösa föreningen.
- När MHA lösningen har torkat, montera sondhållaren med den PPL matrisen på AFM.
3. beredning av guld substrat för PPL.
- Guld-substrat kan antingen köpas, eller gjord in-house av termiska eller electron beam nedfall, och är konstruerade för ett 2 nm Titan vidhäftning lager följt av 20 nm guld på en glas eller silicon wafer. 18
- Vid behov ren substratesna av plasma syrgasbehandling med hjälp av parametrar som beskrivs i steg 1.4.
- Placera guld substratet i mitten AFM prov scenen och säkra med tejp runt gränsar av substratet (figur 2). Justera scenen till rätt höjd som anges i tillverkarens bruksanvisning använda z-axeln controller.
4. automatisk justering av pennan matris
- Öppna och köra den scenen controller installationsprogrammet (SetupNSF.exe) på datorn för att återställa ('zero') alla axlar och vinklar till en pre kalibrerad nollpunkten, sedan använda scenen x/y-axeln controller-konsolen att flytta substratet till önskad justering / skriva ut läge. För optimalt resultat, bör substratet placeras nära mitten av scenen, mellan scenens kraftgivare.
Obs: I vissa modeller av dator, x/y-axeln controller USB-signal kan störa som från z-axeln controller. Om detta inträffar, koppla på x/y-axeln controller USB kabel efter detta steg. Det bör vara återanslöt efter justering förfarandet (steg 4.7). - Växla scenen frigöringsspaken för att släppa prov scenen och aktivera triaden av kraftgivare som indikeras av AFM tillverkarens anvisningar. Låt kraft sensorerna temperera för minst 15 min. För optimalt resultat, tillåta 30-50 min.
- Öka höjden z-axeln för att få matrisen i närheten med substratet genom att visuellt Observera den sonden array och yta.
Obs: Ju närmare arrayen är till ytan, de färre iterationerna krävs för justeringsprocessen, vilket sparar tid. - Öppna/köra programmet automatisk justering (automatisk justering v16.exe) och ange parametrar för relevanta justering i programmet.
- Ange önskad 'vinkel steg' parametervärde, vanligtvis 0,15 °. Denna parameter är offset vinkel från den 'optimala' vinkeln för varje område som bestäms av programmet. Ange den här parametern mellan 0,1 och 0,2 °, som vinklar lägre än detta intervall inte resulterar i en klart påvisbar kraft skillnad vid inställning av sonderna till ytan.
Obs: Programvaran accepterar värden i millidegrees (dvs., 1 x 10-3 °). Exempelvis för 0,15 °, bör användaren matar in '150.' - Att ange den önskade grova steg ' parametervärde, vanligtvis 0,6 µm. Denna parameter är z-stegstorlek används av scenen när den närmar sonderna i den inledande grovuppriktning. Denna parameter mellan 0,2 och 1 µm. större steg storlekar minskar tiden för justeringsprocessen men minska riktigheten av justeringen, och öka slitaget på sonderna.
Obs: Programvaran accepterar värden av grova steg i mikrometer. Exempelvis bör användare för 0,6 µm ingång '0,6'. - Ange önskad ' fina ' parameter stegvärdet, vanligen 0,2 µm. Denna parameter är z-stegstorlek används för finjustering av optimal anpassning. För de flesta tillämpningar, denna parameter mellan 0,1 och 0,4 µm. större värde steg storlekar kommer att minska den tid det tar för justeringsprocessen men minska kvaliteten på justeringen.
Obs: Programvaran accepterar värden av fina steg i mikrometer. Exempelvis för 0,2 µm, bör användaren matar in '0,2.' - Konfigurera sökvägen' Excel-filen' och fäst en omodifierad kopia av medföljande mall kalkylbladsfilen genom att använda ikonen 'folder', navigera till filplatsen och trycka på 'OK'. Denna fil innehåller rå och beräknade data som används för att bestämma de optimala scenen lutningsvinklar av scenen.
- Ange önskad 'vinkel steg' parametervärde, vanligtvis 0,15 °. Denna parameter är offset vinkel från den 'optimala' vinkeln för varje område som bestäms av programmet. Ange den här parametern mellan 0,1 och 0,2 °, som vinklar lägre än detta intervall inte resulterar i en klart påvisbar kraft skillnad vid inställning av sonderna till ytan.
- Öppna/köra programvaran AFM kontroll. Navigera till komponenten spektroskopi av detta program genom att klicka på knappen 'spektroskopi' (enligt tillverkarens instruktioner) och ange AFM scan huvud z-axeln att svänga av 10 µm över 100 ms, med en paus på 250 ms, sedan om du vill återkalla 10 µm över 100 ms med en paus på 250 ms (bild 3).
- Som chefen för AFM oscillerande, klicka på 'start'-knappen av programvaran anpassning att börja automatiserade justeringsprocessen. När programmet är igång, programvaran skriva och läsa data i filen beskrivs i steg 4.4.4.
Obs: Anpassningen tar mellan 30 min och 3 h beroende inledningsskedet position i steg 4,3- och programvarukonfiguration som angavs i steg 4,4.
FÖRSIKTIGHET: Scenen controller konsolerna är fortfarande aktiv under justeringsprocessen - använder inte dem under justeringsprocessen eftersom det kommer att störa justeringen. - När anpassningen är klar, kommer att lysa grönt ljus rutan 'Justering slutförd' på justering programvara (från steg 4.4). När detta inträffar klickar du på knappen 'Stopp' på användarens gränssnitt för att avsluta justeringsprocessen.
- Inspektera grafer i mallen kalkylbladsfilen för en korrelation mellan inspelade datapunkter och den linjen som passar som genereras av programvaran. Se representativa resultat för exempel på en bra korrelation, med typiska R2 värden på > 0,99. Om justeringen misslyckas ersätta sonden matrisen med en nyligen beredd array (steg 2) och upprepa justeringen (steg 4.4).
- Flytta stadiet uppåt i z-axeln med hjälp av scenen controller konsolen för axeln. Scenen bör flyttas i 500 nm steg tills kontakt kan observeras från ovanifrån kameran av AFM. Kontakt mellan matris och substrat kan observeras som en 'vit prick' av hög kontrast vid spetsen av enskilda sonden pyramiderna.
- Vid denna punkt, klicka på 'stop' knappen på AFM kontroll programvara att stoppa programmet spektroskopi från steg 4,5. Detta kommer att dra tillbaka matrisen genom 10 µm, därför lämnar 10 µm z som möjligt-förlängning. Kolla på bilden från ovanifrån kameran av AFM att säkerställa att sonderna inte är i kontakt med substratet.
5. polymer penna litografi (PPL)
- Navigera till komponenten litografi av programvaran kontroll genom att klicka på knappen 'litografi' styrprogram. Välj z-modulering driftsättet och importera en raster (bitmap) eller vektor bild som ska användas som litografi mönstret. För att skapa de funktioner som visas i de representativa resultat, använda en bitmapp som bestående 20 x 20 svart pixlar (se kompletterande material), motsvarande en litografi av ett rutnät med 20 x 20 punkter per sonden på PPL matrisen.
- Ange parametrarna litografi i fönstret 'Pixel grafiska Import' av AFM kontrollermjukvaran.
- Konfigurera den 'storleken' mönstret ska genereras, t.ex., 40 µm i längd och bredd. Dessa parametrar anger bredd och längd som skalas bilden i bitmappen. Generera funktioner visas i de representativa resultat, Använd en bredd och längd 40 µm i båda dimensionerna.
- Ange 'Ursprung' mönstret ska genereras vid 25 µm på både x - och y -axeln. Dessa parametrar avgör mitten av bilden i förhållande till centrum av AFM x/y-axlar. Ange dessa parametrar för att undvika regionen i ytan var sonderna var i kontakt under justeringsprocessen.
- Ställ in utskrift 'Parametrar'. Dessa värden bestämmer hur sonderna kommer att förlängas (dvs kom i kontakt med ytan) som svar på varje pixel i bitmappsbilden.
- Välj från droppa-ned menyn 'Modulering Abs Z Pos' och 'Förenkla till' två lager. Detta läge instruerar AFM att förlänga sonderna av en absolut avstånd bestäms av bara två resultat, antingen 'Svart (0)' eller 'Vit (1)' fält.
- Ange värden i 'Svart (0)' och 'White (1)' fält till 5 och -5 µm, respektive. Dessa värden bestämma avståndet sonderna ska flyttas som svar på en svart eller vit pixel på bitmappsbilden och är vanligtvis mellan 3 och 5 µm för 'Svart' (dvsförlänga sonder nedåt av det avståndet i förhållande till nollpunkten för axeln) och -3 till-5 µm för 'Vit' (dvs.dra tillbaka sonderna uppåt av 3 till 5 µm i förhållande till nollpunkten).
Obs: Dessa representativa avstånd antar att tillägget 5 µm resulterar i sonderna kommer i kontakt med ytan och därmed generationen av en funktion, medan ett µm 5 uttag lyfter sonderna bort från ytan vilket resulterar i ingen kontakt. Z-förlängning påverkar funktionen storlek genom att bestämma omfattningen av sonden kontakt med ytan, större förlängningar resultatet i sonderna pressas ytterligare in i ytan, vilket resulterar i större funktioner. 10 - Klicka på knappen 'OK' för att tillämpa inställningarna och stänga fönstret.
- Ange 'pausa tiden' i fönstret litografi av AFM kontroll mjukvaran, vanligtvis 1 s. Inställningen avgör längden på sonderna förbli i den utöka 'Svart' ståndpunkten som anges normalt mellan 0,1 och 10 s.
Notera: Längre paus gånger resultera i större funktionen storlekar på grund av den större mängden MHA transporteras till guld ytan. Ytterligare information om kontrollera storleken på funktioner som genereras kan hittas i andra rapporter. 20 - Förbereda den atmosfäriska kontroll inhägnad.
- Lägre atmosfäriska isolering kammaren på AFM och öppna/köra programvaran tillverkaren atmosfäriska kontroll (MHG_control.exe).
- Ange den atmosfäriska kontroll programvaran för att upprätthålla en relativ luftfuktighet på 45%, en temperatur på 25 ° C och en atmosfär exchange 'Flow rate' 500 ml genom att ange dessa värden i programvaran. Klicka på 'Använd' för att genomföra inställningarna. Den atmosfäriska modulen börjar sedan att pumpa fuktad luft in i kammaren.
Notera: Högre luftfuktighet resultera i större funktionen storlekar på grund av bildandet av en större vatten menisk genereras mellan penna matriser och yta. 21 detta värde ligger vanligtvis mellan 40 och 60%. Det flöde som anges normalt mellan 300 och 500 mL. Större flöden tillåta den önska fuktighetsnivån nås snabbare men är mindre exakt. De representativa resultat använd en flödeshastighet av 500 mL för första generation av luftfuktighet och minskas till 300 mL när du når önskad luftfuktighet, för att bibehålla en noggrann och stabil nivå under litografi.
- När önskad luftfuktighet erhålls, börja litografiska sekvensen genom att trycka på 'start'-knappen på programvarugränssnitt.
- Efter slutförandet av litografin, använda z-scenen controller konsolen för att flytta substratet bort från arrayen av Upprullningskraften scenen av 500 µm. Ta sedan bort den atmosfäriska isolering kammaren från sitt fäste.
- Växla scenen frigöringsspaken för att låsa prov scenen och avaktivera de kraft, som indikeras av AFM tillverkarens instruktioner och ta sedan bort substratet från scenen.
6. mönster visualisering
- Mönster kan visualiseras med hjälp av en av följande metoder, lateral kraft skanning sonden mikroskopi eller kemisk etsning.
- Skanna den mönstrade ytan på AFM med sidokraft läge använda kontakt läge fribärande för att undersöka funktioner icke-förstörande.
Obs: Lateral kraft mikroskopi kan användas som en icke-förstörande metod för visar de funktioner som produceras av polymer penna litografi; men kan med den här metoden endast ett relativt litet område vara visualiserade (vanligtvis 100 x 100 µm). - Eftersom den deponerade MHA kan fungera som en etch motstå, användas kemisk etsning ta bort guld från de icke-mönstrad områdena. De resulterande unetched områdena kan sedan visualiseras med hjälp av optisk mikroskopi, vilket innebär ett stort område kan ses på en gång. 18
Obs: Substrat som etsas på detta sätt inte kan sedan användas för efterföljande cell kultur experiment beskrivs nedan.- Separat, förbereda aqueous lösningar av 40 mM tiourea, 27 mM järn nitrat och 100 mM saltsyra. Förbered etsmedlet genom att blanda 5 mL av varje av dessa tre lösningar. Färsk blandas före varje användning. 22
FÖRSIKTIGHET: tiourea, järn nitrat och saltsyra är giftiga. Läs MSDS innan du arbetar med denna lösning. Säkerhetsutrustning skall användas vid hantering av kemikalien. - Överföra mönstrade substratet i en petriskål och pipett tillräcklig etsmedlet lösning i skålen att täcka ytan av substratet (vanligtvis 10 mL). Hålla substratet under vatten i 4-5 min till etch 15 nm guld (med en ungefärlig hastighet på 3 nm/min).
- När etsning är klar, ta bort substratet och skölj med vatten och torka med en kväveström.
Obs: Fullbordandet av etsning process bestäms av tjockleken på guld ytan erhålls (steg 3.1) är associerad med etsning ränta anges (steg 6.2.2). - Inspektera de etsade guldiga funktionerna under ljusa fält optisk mikroskopi. De återstående guldiga funktioner som förblir bör visas motsvarande till mönstret som trycktes (från steg 5.2). Om hela ytan visas homogena, indikerar detta att en betydande mängd guld finns kvar och steget etsning (följande steg 6.2.2) bör upprepas 1-2 min.
- Separat, förbereda aqueous lösningar av 40 mM tiourea, 27 mM järn nitrat och 100 mM saltsyra. Förbered etsmedlet genom att blanda 5 mL av varje av dessa tre lösningar. Färsk blandas före varje användning. 22
7. mönster funktionalisering med Fibronektin
- Fördjupa de mönstrade substratesna i en lösning av 1 mM (11-mercaptoundecyl) hexa(ethylene glycol) lösning i etanol för 1 h. Tvätta underlaget tre gånger med etanol och torka noggrant under en ström av kväve. Detta steg passiverar omönstrade guld områdena.
Varning: (11-mercaptoundecyl) hexa(ethylene glycol) är giftiga. Läs MSDS innan du arbetar med denna lösning. Säkerhetsutrustning skall användas vid hantering av kemikalien. - Sänk substratesna i en 10 mM Co (nr3)2 vattenlösning för 5 min. Nästa, ta bort substratesna från lösningen, tvätta tre gånger med ultrarent vatten och torrt under en ström av torrt kväve.
Varning: Co (nr3)2 är giftiga. Läs MSDS innan du arbetar med denna lösning. Säkerhetsutrustning skall användas vid hantering av kemikalien. - Fördjupa substratet i en 50 µg/mL lösning av Fibronektin i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och inkubera vid 4 ° C för 16 h. Tvätta underlaget tre gånger med PBS och sedan torka substratet under en ström av torrt kväve.
Obs: Fibronektin är bunden till MHA-functionalized områden genom kelering av Co(II) av terminal karboxylsyra grupper på MHA. Fibronektin binder sedan till Co(II) via dess kollagen-bindande domän. 23 - Om du vill visualisera den ytan-bundna Fibronektin genom märkning det med fluorescerande antikroppar:
- Tillämpa en 2 mL lösning av 1: 100 okonjugerat kanin anti-Fibronektin primär antikropp i 5% (w/v) av bovint serumalbumin (BSA) i PBS till ytan och inkubera vid 4 ° C för 16 h. Aspirera supernatanten och tvätta tre gånger med PBS.
- Dränka substratet i en 2 mL lösning av fluorescently konjugerad anti-kanin sekundär antikropp (på tillverkarens angivna utspädning, 2 droppar/mL) i 5% (w/v) av BSA i PBS, täcka i aluminiumfolie och inkubera vid rumstemperatur under 1 h. aspirera på supernatanten och tvätta tre gånger med PBS.
- Spela in epifluorescence mikroskopi bilder funktioner med fluorescens Mikroskop enligt tillverkarens instruktioner, med en excitationsfilter inställt med 594 nm.
8. cellkultur på nanofabricerade ytor
- Bered en suspension av väl karakteriserade hMSCs mellan den 4: e och 6: e passage. 24
- Avbryta en konfluenta kolv av celler genom att skölja en gång med 10 mL PBS, dissociera klibbade celler genom att tillsätta 5 mL av trypsin/EDTA i T75 vävnadsodling kolven och inkubera kolven i en fuktig kammare vid 37 ° C kompletteras med 5% CO2 för upp till 5 min till 90% o f celler är fristående från ytan.
- Därefter tillsätt 6 mL färsk kultur media som innehåller 10% fetalt kalvserum (FCS) i kolven och kort skölj kolven med media lagt till. Överföra cellsuspension i en 15 mL centrifugrör och centrifugera vid 400 g vid 25 ° C i 5 min.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 3 mL färsk kultur media.
- Räkna cell densiteten med hjälp av en hemocytometer25 och justera densiteten av cellsuspensionen till 2 x 104 celler/mL genom tillsats av en lämplig volym av kultur media.
- Utsäde cellerna på substrat med en täthet av 104 celler/cm2.
- Skär substratet i 1 x 1 cm2 med diamond scribe och placera den i en brunn i 12-väl vävnadsodling plattan.
- Överför med pipett 2 mL cellsuspension i kultur media (från steg 8.1.4) till brunnen och inkubera i en fuktig kammare vid 37 ° C kompletteras med 5% CO2 för 24 h.
- Efter celltillväxt på mönster, analysera omfattningen av cell fastsättning och sprider sig genom immunofluorescens:
- Ta bort media och tvätta substrat en gång med PBS. Fixa celler med 2 mL av en lösning av 4% PARAFORMALDEHYD i PBS (pre värmas till 37 ° C) i 20 min i dragskåp och tvätta tre gånger med PBS.
Varning: PARAFORMALDEHYD är giftiga. Läs MSDS innan du arbetar med denna lösning. Säkerhetsutrustning skall användas vid hantering av kemikalien. - Permeabilize cellerna med 2 mL av en lösning av 0,5% tvättmedel (se Tabell för material) i PBS för 15 min och sedan tvätta tre gånger med PBS.
- Dränka substratet i 2 mL av en lösning av okonjugerat kanin anti-Fibronektin primär antikropp vid spädning på 1: 100 med 5% (w/v) BSA i PBS och inkubera vid 4 ° C för 16 h, sedan tvätta tre gånger med 0,1% (v/v) Tween-20 i PBS (PBST).
- Därefter dränka substratet i 2 mL av en lösning av fluorescently konjugerad anti-kanin sekundär antikropp (utspädd med 5% (w/v) BSA i PBS på tillverkarens angivna utspädning, 2 droppar/mL), täcka i aluminiumfolie och inkubera i rumstemperatur i 1 h, sedan tvätta tre gånger med 0,1% PBST.
- Etikettera aktin filament, dränka 2 mL fluorescently konjugerade phalloidin vid en spädningsgrad av 1: 250 i PBS, täcka i aluminiumfolie och inkubera vid 4 ° C i 30 min och sedan tvätta tre gånger med PBS.
- Samtidigt fläcken cellkärnor och montera substratet genom att tillämpa en droppe montering medium innehållande DAPI och täck med ett täckglas.
- Ta bort media och tvätta substrat en gång med PBS. Fixa celler med 2 mL av en lösning av 4% PARAFORMALDEHYD i PBS (pre värmas till 37 ° C) i 20 min i dragskåp och tvätta tre gånger med PBS.
- Visualisera cellerna med fluorescens Mikroskop enligt tillverkarens instruktioner, med excitation filter med 365 nm för kärnor (DAPI), 488 nm för F-aktin och 594 nm för Fibronektin.
Representative Results
För att kontrollera om den automatiska justeringen hade varit framgångsrik, undersöktes grafer ritas från justering data (i kalkylbladet från steg 4,8). Om justeringsprocessen hade varit framgångsrik i två tomter, motsvarande den vinkel som provet scenen har varit lutas längs θ och φ axlarna, visade en serie av stigande och fallande datapunkter. I varje av tomterna, två linjära anfall av datapunkterna visade en väldefinierad intersect ”peak” som anger den maximala z-tillägg och motsvarande vinkel där anpassningen var uppnått (figur 4A och 4B). Denna process är upprepad fyra gånger (dvs.två gånger för varje axel) och ritas som en uppsättning av fyra koordinater. Skärningspunkten mellan varje par av koordinater visar alltså de övergripande optimala vinklarna (figur 4 c). 13 i fall där anpassningen inte var framgångsrika, det kan påpekas att deras motsvarande θ och φ vinkel tomter inte ger god kvalitet linjär passar eller skär inte (figur 5). Sådana misslyckade linjeföring är vanligtvis till följd av de arrayer som felaktigt klippta eller monterad på sondhållaren (steg 1.7, 1.8 och 2.2). I dessa fall arrayer kasseras och en ny förberett och monteras (steg 1 och 2), och justeringsprocessen upprepas (steg 4).
Efter framgångsrika anpassningen och litografi med MHA av PPL, var mönstrad guld substrat sedan avbildas med sidokraft mikroskopi för att undersöka om nedfall hade ägt rum. Ett större område undersökning av tryckta ytor utfördes också av optisk mikroskopi av substratesna efter etsning av guld inte skyddas av den insatta tiol (figur 6 och figur 7). Dock de etsade mönsterna kan inte användas för ytterligare funktionalisering och bör endast användas för att bekräfta mallning av representativa stickprov av ett parti av tryckta ytan substrat. Om de etsade mönsterna visar tomma områden motsvarar enskilda pennor (figur 8), visar detta resultat att produktionen av sonden matriser inte har gjorts framgångsrikt, och att vissa sonder är skadad eller saknas. Detta inhomogenitet av sonderna kan bero på användningen av en gammal mästare där perfluorerade beläggningen har nöts bort (steg 1.3), vilket resulterar i vissa sonder som slits bort när matrisen är skild från master. I dessa fall bör en ny master användas. Resultatet kan också bero på förekomsten av luft bubblor fångade mellan glaset bakningen och master (steg 1,5), eller om probe matrisen inte rent avskildes från master efter härdning (steg 1,8).
Fluorescerande mikroskopi bilder av Fibronektin functionalized ytor ruvade hMSCs var också samlas in (figur 9). I allmänhet, alla substrat var stabila inom in vitro- kultur miljö och cellerna följs och anpassade deras morfologi till de tryckta mönsterna vid mindre isolerade 20 x 20 mängd funktioner.
Figur 1. Schematisk framställning av polymer penna litografi visar molekylära ink transport via en vatten menisk på probspetsen. (A) side se och b ovanifrån av polymer penna matrisen anger att när den sonden array och ytan substrat är fullt inriktade, alla sonderna kommer i kontakt med ytan samtidigt, vilket resulterar i parallelliserad litografi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Schematisk bild av polymer penna litografi ställa upp (A) utökade sidovy av experimentella inrättats där arrayen beredda sonden är kopplad till probe innehavaren och monteras på AFM scanner. Substratet är placerad på scenen, nedanför som ligger tre kraft sensorer. (B) en representation av sammansatta instrument, visar AFM genomsökningen huvudet i förhållande till provet scenen. (C) underifrån som visar kraft sensor läge. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Schematisk bild föreställande programmet spektroskopi för förfarandet för justering. AFM skannern är inställd att flytta sonderna mot prov med ett avstånd av 10 µm inom 100 ms, höll på position för 250 ms, följt av en indragning av 10 µm inom 100 ms, och sedan höll för 250 ms vid infällt position. Förslaget upprepas sedan under justeringsprocessen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Diagram som illustrerar en framgångsrik anpassning. Grafer av z position mot tilt vinklar a θ och b φ för en framgångsrik anpassning, där ● visar de faktiska värdena som uppmätts och + anger bäst passform med minsta-kvadratmetoden. (C) grafen av φ mot θ utrustade vinklar med fyra punkter där den maximala z-ståndpunkten nåddes. Skärningspunkten markeras är den slutlig optimala lutningsvinkel över båda axlarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Diagram som illustrerar en misslyckad anpassning. Grafer av z position mot tilt vinklar a θ och b φ för en misslyckad anpassning, där ● visar de faktiska värdena som uppmätts och + anger bäst passform med minsta-kvadratmetoden. (C) grafen av φ mot θ utrustade vinklar med fyra punkter där den maximala z-ståndpunkten nåddes. Ingen tydlig optima eller skärningspunkten observeras och därför optimal justering vinklarna inte är lösta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Belysande optisk mikroskopi och atomic force microscopy bilder av guld substrat som mönstrad med MHA av de justerade PPL-arrayer och sedan etsade. (A) och (B) är sekventiellt förstorade optisk mikroskopi bilder av de etsade mönster; (C) är en AFM topografi bild av ett enda rutnät med mönster. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Belysande optisk mikroskopi bilder av guld substrat som mönstrad med MHA av de justerade PPL-arrayer och sedan etsade. (A) och (B) är sekventiellt förstorade optisk mikroskopi bilder av etsade mönster och (C) är en lägre förstoring-bild som visar stort område homogent mönster. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8. Belysande optisk mikroskopi bilden av ett guld substrat som var ojämnt mönstrad med MHA och sedan etsade. De avsedda mönster (visas i infällt) upprepande nät av 20 dot rader ordnade i 20 linjer, med varje två linjer som produceras genom att öka z-axeln förlängning av 1 µm (allt från 5 till-5 µm). Det kan ses att i vissa områden utan mönster genereras, på grund av saknade sonder på dessa platser. I områden där endast två linjerna av punkter produceras, detta resultat indikerar att en sond är närvarande men det är inte av samma höjd som de fullt fungerande sonderna, så enda insättning har när matrisen är utsträckt till hela z-axeln avstånd. Denna bild, har kontrasten avsiktligt ändrats för att möjliggöra observation av de delvis utskrivna områdena. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9. Epifluorescence mikroskopi bilder av hMSCs odlade på de Fibronektin matriserna mallade av PPL. (A) och (B) är hög förstoring bilder visar enskilda celler. (C) visar ett exempel mönster av Fibronektin matrisen utan Blåbandsförbund cell och (D) är ett brett fält bild av de celler i ett rutnät arrangemang (en schematisk bild av det tryckta mönstret visas även i inlagan). Cellerna är färgade för att Visa Fibronektin (röd), F-aktin (grön) och cell atomkärnor (blå). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Detta protokoll syftar till att förse användare med en bekväm metod att snabbt genomföra nanolithographic mönstring med hög jämnhet och kontrollerbar funktionen storlek över stora områden (cm2). Substrat som bär dessa stort område nanopatterns kan sedan vidareutvecklas för en mängd tillämpningar. En större tillämpning av denna teknik är i generationen av nanofabricerade ytor för cellytan interaktionsstudier. Den här rapporten visar några belysande exempel på cellkultur på dessa material, visar kontroll av hMSC morfologi av nanofabricerade substrat.
En viktig faktor i detta protokoll är automatisering av förfarandet för justering (steg 4) som tillåter mycket enhetlig och hög genomströmning produktion av funktioner på ytor, ner till nanoskala upplösning, vilket gör den snabb omsättningen av cell kultur experiment. Den polymer penna litografi utförs med denna justering algoritm är kunna generera nanoskala funktioner inom ca 30 min. Den reproducerbarhet och noggrannhet på automatisk justering, och således likformigheten av de mönstrade funktionerna, är emellertid kritiskt beroende på kvaliteten på de sond arrayer som produceras (steg 1 och 2). Eventuella brister i deras förberedelser som resulterar i trubbiga, trasiga eller saknas sonder; såsom instängd luft kan bubblor (steg 1,5) eller felaktig separation av sonderna från master (steg 1,8) resultera i felaktig justering och dålig kvalitet litografi.
Detta rapporterade metod aktier en begränsning i likhet med andra metoder för anpassning som förlitar sig på force feedback. Korrekt bestämning av när sonderna är i kontakt med ytan begränsas av behovet av att redogöra för bakgrunden vibrationer som orsakas av den omgivande miljön och rörlighet för provet scenen. I allmänhet sensorerna har en kraft känslighet i den µN regimen (2 µN i detta fall), men anpassningen algoritmen är utformad för att endast registrera en styrka av minst 490 µN som slutgiltig kontakt mellan sonderna och ytan, för att undvika eventuella 'falska positiva' resul terande från bakgrundsljud. 13 således denna metod tenderar att producera stora funktioner (1-2 µm) eftersom sonderna måste förlängas ett stort avstånd på z-axeln (med en åtföljande högre kraft) för att registrera kontakt. För att kompensera, mindre funktioner kan genereras genom att minska z-axeln avstånd reste under litografi steg (t.ex., att ange inställningen 'Svart' i steg 5.2.3.2 som 3 µm istället för 5 µm).
Även med denna begränsning, automation algoritmen ändå kunna hantera en kritisk aspekt i tillämpningen av parallelliserad sonden litografi skanningsmetoderna, eftersom anpassningen var tidigare den mest krävande och oprecisa tidssteg i den genomförandet av dessa tekniker. Detta automation nu skiftar det hastighetsbegränsande steget i tillverkningsprocessen från justeringen till den litografiska skriva själv. Medan detta protokoll visar tillämpningen av proceduren justering på PPL, skulle ramen kunna tillämpas på ett antal SPL tekniker såsom lipid-DPN26 och matrix-assisted litografi27 samt potentiella framtida katalytisk sonden system. 28
Disclosures
Den justering algoritm programvara har utvecklats av och tillhör, University of Manchester. Det är tillgänglig för nedladdning på http://www.click2go.umip.com/.
Acknowledgments
Författarna erkänner finansiellt stöd från en mängd källor inklusive UK Engineering och Physical Sciences Research Council (bevilja refs. EP/K011685/1, EP/K024485/1) och en graduate UNIVERSITETSSTIPENDIUM för JH; Leverhulme förtroende (RPG-2014-292); Wellcome Trust institutionella strategiskt stödfonden (105610/Z/14/Z); British Council (216196834); och University of Manchester för en University of Manchester Research Institute (UMRI pump priming fond) och en Presidential doktorand stipendium till SW. tekniskt stöd av Dr. Andreas Lieb (Nanosurf AG) erkänns också tacksamt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| FlexAFM mounted on a motorised 5-axis (XYZΘΦ) translation and goniometer stage | NanoSurf | P40008 | |
| AFM control software | NanoSurf | C3000 | |
| Engraving pen | Sigma-Aldrich | Z225568 | |
| Plasma Cleaner | Harrick plasma | PDC-32G-2 | |
| PlasmaFlo | Harrick plasma | PDC-FMG-2 | |
| Economy Dry Oxygen Service Pump | Harrick plasma | PDC-OPE-2 | |
| Tube Rotator | Stuart | SB3 | |
| Vacuum Desiccator | Thermo Fisher Scientific | 5311-0250 | |
| Milli-Q Water Purification System | Merck Millipore | ZRXQ015WW | |
| Modular Humidity Generator | proUmid | MHG32 | |
| Proline Plus Pipette 100-1000 µL | Sartorius | 728070 | |
| Silicon masters | NIL Technology | custom-made | |
| Upright snapshot fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Microscope objectives | Olympus | 10x and 60x UPlan FLN ∞/-/FN 26.5 | |
| Upright bright field microscope | Leica | DM 2500M | |
| Ultrasonicator | Ultrawave Ltd. | U95 | |
| Spreadsheet for recording and intepreting automated alignment results | Microsoft | Excel | |
| Reagent | |||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 34863 | FLAMMABLE |
| Microscope Sildes, Clear, Ground | Thermo Fisher Scientific | 451000 | |
| (7–8% vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxy-terminated | Gelest | VDT-731 | |
| 1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane | Gelest | SIT7900.0 | |
| Platinum(0)-1,3-divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane complex solution | Sigma-Aldrich | 479527 | HARMFUL, TOXIC |
| (25–35% methylhydrosiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxane-terminated | Gelest | HMS-301 | |
| Weigh Boat 100 mL | Scientific Laboratory Supplies | BALI828 | |
| Pasteur pipette | Appleton Woods | KS230 | |
| Petri dish | SARSTEDT | 82.1473 | |
| Razor blade | Thermo Fisher Scientific | ST10-031T | |
| Adhesive Carbon Tape | Agar scientific | AGG3939 | |
| 16-Mercaptohexadecanoic acid | Sigma-Aldrich | 448303-1G | HARMFUL, TOXIC |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 34852 | FLAMMABLE |
| Gold coated microscope slide | Sigma-Aldrich | 643203 | Once opened gold will remain reactive to thiols for at least 1 month |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | HARMFUL, TOXIC |
| Iron(III) nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | 529303 | HARMFUL, TOXIC |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 84415 | HARMFUL, TOXIC |
| (11-Mercaptoundecyl)hexa(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 675105 | HARMFUL, TOXIC |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Cobalt(II) nitrate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 203106 | HARMFUL, TOXIC |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium | Lonza UK | PT-3001 | |
| Human Mesenchymal Stem Cells | Lonza UK | PT-2501 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Heraeus Multifuge X1 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004210 | |
| CELLSTAR Centrifuge Tubes | Greiner Bio-One | 188261 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | P/0840/53 | HARMFUL, TOXIC |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | "Detergent" in manuscript |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Rabbit anti-fibronectin antibody | Abcam | ab2413 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | R37117 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| 12-well plate | Thermo Fisher Scientific | 10253041 | |
| T75 tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10790113 | |
| cantilever | BudgetSensor | ContAl-G |
References
- Saavedra, H. M., et al. Hybrid Strategies in Nanolithography. Rep. Prog. Phys. 73, 036501 (2010).
- Gates, B. D., et al. New Approaches to Nanofabrication: Molding, Printing, and Other Techniques. Chem. Rev. 105, 1171-1196 (2005).
- Garcia, R., Knoll, A. W., Riedo, E. Advanced Scanning Probe Lithography. Nat. Nanotechnol. 9, 577-587 (2014).
- Piner, R. D., Zhu, J., Xu, F., Hong, S., Mirkin, C. A. "Dip-Pen" Nanolithography. Science. 283, 661-663 (1999).
- Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. Applications of Dip-Pen Nanolithography. Nat. Nanotechnol. 2, 145-155 (2007).
- Lewis, A., et al. Fountain Pen Nanochemistry: Atomic Force Control of Chrome Etching. Appl. Phys. Lett. 75, 2689-2691 (1999).
- Kim, K. -H., Moldovan, N., Espinosa, H. D. A Nanofountain Probe with Sub-100 Molecular Writing Resolution. Small. 1, 632-635 (2005).
- Gruter, R. R., Voros, J., Zambelli, T. FluidFM as a Lithography Tool in Liquid: Spatially Controlled Deposition of Fluorescent Nanoparticles. Nanoscale. 5, 1097-1104 (2013).
- Salaita, K., et al. Massively Parallel Dip-Pen Nanolithography with 55 000-Pen Two-Dimensional Arrays. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7220-7223 (2006).
- Huo, F., et al. Polymer Pen Lithography. Science. 321, 1658-1660 (2008).
- Shim, W., et al. Hard-Tip, Soft-Spring Lithography. Nature. 469, 516-520 (2011).
- Liao, X., Braunschweig, A. B., Mirkin, C. A. "Force-Feedback" Leveling of Massively Parallel Arrays in Polymer Pen Lithography. Nano Lett. 10, 1335-1340 (2010).
- Wang, S., Hosford, J., Heath, W. P., Wong, L. S. Large-Area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment of Probe Arrays. RSC Adv. 5, 61402-61409 (2015).
- Noh, H., et al. "Multipoint Force Feedback" Leveling of Massively Parallel Tip Arrays in Scanning Probe Lithography. Small. 11, 4526-4531 (2015).
- Dalby, M. J., et al. The Control of Human Mesenchymal Cell Differentiation Using Nanoscale Symmetry and Disorder. Nat. Mater. 6, 997-1003 (2007).
- Connell, C. D., Higgins, M. J., Moulton, S. E., Wallace, G. G. Nano-Bioelectronics via Dip-Pen Nanolithography. J. Mater. Chem. C. 3, 6431-6444 (2015).
- Giam, L. R., et al. Scanning Probe-Enabled Nanocombinatorics Define the Relationship Between Fibronectin Feature Size and Stem Cell Fate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 4377-4382 (2012).
- Eichelsdoerfer, D. J., et al. Large-Area Molecular Patterning with Polymer Pen Lithography. Nat. Protoc. 8, 2548-2560 (2013).
- Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. Irreversible, Direct Bonding of Nanoporous Polymer Membranes to PDMS or Glass Microdevices. Lab Chip. 10, 548-552 (2010).
- Liao, X., Braunschweig, A. B., Zheng, Z., Mirkin, C. A. Force- and Time-Dependent Feature Size and Shape Control in Molecular Printing via Polymer-Pen Lithography. Small. 6, 1082-1086 (2010).
- Sheehan, P. E., Whitman, L. J. Thiol Diffusion and The Role of Humidity in "Dip Pen Nanolithography". Phys. Rev. Lett. 88, 156104 (2002).
- Geissler, M., et al. Fabrication of Metal Nanowires Using Microcontact Printing. Langmuir. 19, 6301-6311 (2003).
- Gmeiner, B., Leibl, H., Zerlauth, G., Seelos, C. Affinity Binding of Distinct Functional Fibronectin Domains to Immobilized Metal Chelates. Arch. Biochem. Biophys. 321, 40-42 (1995).
- Curran, J. M., et al. Introducing Dip Pen Nanolithography as a Tool for Controlling Stem Cell Behaviour: Unlocking the Potential of the Next Generation of Smart Materials in Regenerative Medicine. Lab Chip. 10, 1662-1670 (2010).
- Davey, M. R., Anthony, P. Plant Cell Culture: Essential Methods. , John Wiley & Sons. 153-172 (2010).
- Brinkmann, F., et al. Interdigitated Multicolored Bioink Micropatterns by Multiplexed Polymer Pen Lithography. Small. 9, 3266-3275 (2013).
- Senesi, A. J., Rozkiewicz, D. I., Reinhoudt, D. N., Mirkin, C. A. Agarose-Assisted Dip-Pen Nanolithography of Oligonucleotides and Proteins. ACS Nano. 3, 2394-2402 (2009).
- Carnally, S. A. M., Wong, L. S. Harnessing Catalysis to Enhance Scanning Probe Nanolithography. Nanoscale. 6, 4998-5007 (2014).
