Мышей представляют собой бесценный в vivo модель для изучения инфекции и заболеваний, вызванных желудочно-кишечные микроорганизмы. Здесь мы описываем методы, используемые для изучения бактериальной колонизации и гистопатологические изменения в моделях мыши Helicobacter pylori-связанных заболеваний.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Модели мыши инфекции Helicobacter и патологий желудка
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Helicobacter pylori это желудка возбудителя, который присутствует в половину мирового населения и является существенной причиной заболеваемости и смертности в организме человека. Несколько моделей мыши желудочной инфекции Helicobacter были разработаны для изучения молекулярных и клеточных механизмов, whereby H. пилори бактерий колонизировать желудок человека хостов и вызывают болезни. Здесь, мы описываем протоколы: 1) подготовить бактериальных суспензий для инфекции в vivo мышей через внутрижелудочного кормления; 2) определяет уровень бактериальной колонизации в мыши желудка тканях, полимеразной цепной реакции (ПЦР) и жизнеспособной подсчета; и 3) оценки патологических изменений, по гистологии. Установить HelicobactЭр инфекции в мышей, конкретного возбудителя бесплатно (SPF) животных сначала прививанным с суспензий (содержащие ≥105 колонии формирование подразделения, CFUs) мыши колонизировать штаммов либо Helicobacter pylori или другие желудка Helicobacter spp. от животных, таких как Helicobacter felis. В соответствующие моменты времени после инфекции желудков подакцизным и расчлененный sagittally на два равных ткани фрагменты, каждое в составе области гайморовых и тела. Затем один из этих фрагментов используется для жизнеспособных подсчета или экстракции ДНК, в то время как другой подвергается гистологической обработки. Бактериальной колонизации и гистопатологические изменения в желудке может оцениваться регулярно в разделах ткани желудка, окрашенных с Warthin-звездное, Гимзы или гематоксилин и эозином (H & E) пятна, в случае необходимости. Дополнительные иммунологические анализы могут также осуществляться иммуногистохимия или иммунофлюоресценции на разделах желудка ткани мыши. Протоколы, описанные ниже предназначены специально для проведения оценки в мышах патологии желудка, напоминающие те в связанных с человека Helicobacter pylori заболеваний, включая воспаление, атрофия железы и формирования лимфоидных фолликулов. Подготовка посевным материалом и внутрижелудочного затравки протоколы могут быть адаптированы для изучения патогенеза других кишечных патогенов человека, которые колонизировали мышей, например Salmonella Typhimurium или Citrobacter rodentium.
Введение
Helicobacter pylori это спираль образная, грамотрицательных, человеческого желудка патогена присутствуют в всех групп населения во всем мире, с заболеваемости в развивающихся странах, по оценкам, составляют порядка 80%1. Хотя большинство Helicobacter pylori-инфицированных протекает бессимптомно, некоторые развивать более тяжелых заболеваний, начиная от пептических язв желудка рак2. H. pylori-связанных рака характеризуются широко злокачественные изменения эпителиальных клеток (GECs) или формирования экстра узловой лимфоидной ткани в желудке, приводит к аденокарцинома желудка или слизистой оболоч....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. рост и подготовка бактериальный инокуляты
- Оттепель запасы глицерина15 Helicobacter pylori или H. felisот-80 ° C и субкультуры на лошади пластины крови агар (HBA) состоит из: кровь агар основания №2 (см. Таблицу материалы); изменение «Скирроу антибиотик селективного дополнение» (состоящий из ванкомицин, 10 мкг/мл; полимиксин, 25 нг/мл; триметоприм, 5 мкг/мл; амфотерицин в, 2,5 мкг/мл); и 5 – 10% (v/v) лошади крови15,16. Бактерии растут хорошо в microaerobic условиях в 2,5 или 3,5 Л анаэробных баночки, содержащий соответствующий газ пакетов ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этот протокол описывает метод пероральная затравка для достижения внутрижелудочного инфекция с Helicobacter pylori или H. felis в мышиных мыши модели (рис. 1). После эвтаназии желудки удалены, взвешиваются и разделен на 2 равные половины, включающий антрального, тело и не железистой регионов желудка тканей (рис. 2). Не железистой региона удаляется перед выполнением каких-либо анализов.
Успешной колонизации животных о.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол описывает использование модели мыши в естественных условиях для инфекции Helicobacter . Важнейшие шаги процедуры являются: 1) подготовка Helicobacter инокуляты, содержащие жизнеспособные и подвижные бактерий; 2) доставки соответствующего числа бактерий к мыши через внутрижелудочного кормления; 3) обнаружение бактериальной инфекции путем подсчета колонии и/или ПЦР; и 4) обработка желудка тканей для включения оценки гистопатология в инфицированных желудков. Дальнейшие предложения по.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить г-жа A. де Паоли и г-жа Джорджи Рей-McCann для оказания технической помощи. Авторы признают, что использование средств и технической помощи Монаш гистология платформы, кафедра анатомии и биологии развития, Университет Монаш. Лаборатория поддерживает финансирование от национального здравоохранения и медицинских исследований Совета (NHMRC) RLF (APP1079930, APP1107930). RLF поддерживается старший стипендия исследований NHMRC (APP1079904). KD и MC поддерживаются в Монаш выпускник стипендии. KD также поддерживается центром врожденного иммунитета и инфекционные заболевания, Гудзоновский институт медицинских исследований, в то время как MC имее....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>Бактериологические реактивы | |||
| оксоидная кровь Агар Основание No2 | Thermo Fischer Scientific | CM0271B | Растворить в деинонизированной воде перед стерилизацией |
| Премиальная дефибринированная лошадиная кровь | Австралийские этические биологические препараты | PDHB100 | |
| Bacto Brain Heart Infusion Broth | BD Bioscience | 237500 | Растворить в деинонизированной воде перед стерилизацией |
| CampyGen в газовых пакетах | Thermo Fischer Scientific | CN0035A/CN0025A | |
| >Гистологические реагенты | |||
| Формалин, нейтральный буферный, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Абсолютный спирт, 100% денатурированный | ChemSupply | AL048-20L-P | |
| Изопропанол (2-пропанол) | Merck | 100995 | |
| ксилол (без серы) | ChemSupply | XT003-20L | |
| Mayer's Haematoxylin | Amber Scientific | MH-1L | Filter перед использованием |
| Eosin, водное окрашивание | Amber Scientific | EOCA-1L | Filter перед использованием |
| Wright-Giemsa Stain, модифицированный | Sigma Aldrich | WG80-2.5L | Разбавить перед применением (20% Гимзы, 80% деионизированной воды) |
| Гистолен | Грале Scientific | 11031/5 | |
| DPX Монтажная среда | VWR | 1.00579.0500 | |
| Реагенты для молекулярной биологии | |||
| Qubit dsDNA BR Набор для анализа | Thermo Fischer Scientific | Q32850 | |
| Олигонуклеотиды | Sigma Aldrich | Температура отжига грунтов ureB, использованных в данном исследовании, составляет 61 °°; C | |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | Kit включает в себя 10x ПЦР-буфер и хлорид магния |
| dNTP | Bioline | BIO-39028 | развести до 10 мМ в стерильной воде, не содержащей нуклеаз, перед использованием |
| Молекулярный агарозный | биолайн | BIO-41025 | |
| Гидрокарбонат натрия | Univar (Ajax Fine Chemicals) | A475-500G | |
| Магний Сульфатный гептагидрат | Chem-Supply | MA048-500G | |
| <стронг>Антибиотики | |||
| ванкомицин | Sigma Aldrich | V2002-1G | Растворить в деионизированной воде |
| Polymyxin B | Sigma Aldrich | P4932-5MU | Растворить в деионизированной воде |
| Trimethoprim (≥ 98% ВЭЖХ) | Sigma Aldrich | T7883 | Растворить в 100% (абсолютном) этаноле |
| Амфотерицин | Amresco (Astral Scientific) | E437-100MG | Растворить в деионизированной воде |
| Бацитрацин из Bacillus licheniformis | Sigma | Aldrich B0125 | Растворить в деионизированной воде |
| Naladixic acid | Sigma Aldrich | N8878 | Растворить в деионизированной воде |
| <сильно>Другие реагенты | |||
| Метоксифлуран (Пентрокс) | Медикал Девелопментс Интернэшнл | Неприменимо | |
| Парафин | Воск Парапласт Плюс, Leica Biosystems | 39601006 | |
| <сильно>Оборудование и пластиковая посуда | |||
| Оксоидные анаэробные банки | Thermo Fischer Scientific | HP0011/HP0031 | |
| КОПАН Пастер-пипетки | Interpath Services | 200CS01 | |
| Eppendorf 5810R | Сбор бактериальных гранул путем центрифугирования при 2 200 об/мин в течение 10 минут при 4 °°; C | ||
| 23 г прецизионная скользящая игла | BD Bioscience | 301805 | |
| Parafilm M | Bemis, VWR | PM996 | |
| Portex тонкокалиберная полиэтиленовая трубка | Smiths Medical | 800/100/200 | |
| Пластиковые катетеры для кормления | Instech Laboratories | FTP20-30 | |
| 1 мл одноразовые шприцы туберкулина luer slip | BD Bioscience | 302100 | |
| Eppendorf микропестик для пробирок 1,2 - 2 мл | Sigma Aldrich | Z317314 | автоклавируемые полипропиленовые пестики для гомогенизации желудка |
| GentleMACs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Используйте предустановленные программы gentleMACS для тканей желудка мышей |
| Трубки M (оранжевый колпачок) | Miltenyi Biotec | 30-093-236 | |
| Кубитный флуориметр | Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Стерильная пластиковая петля | LabServ | LBSLP7202 | |
| Cold Plate, Leica EG1160 Встраиваемая система | Leica Biosystems | Не применимо | |
| Ткань-Тек Базовая Формовая Система, Базовая Форма 38 x 25 x 6 | Сакура, Альфен ан ден Рейн | 4124 | |
| Tissue-Tek III Uni-Casette System | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4170 | |
| Microtome, Leica RM2235 | Leica Biosystems | ||
| Заряженные стеклоподъемники SuperFrost Plus | Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific | 4951PLUS4 |
Ссылки
- Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications. Helicobacter. 16, Suppl 1. 1-9 (2011).
- Montecucco, C., Rappuoli, R. Living dangerously: how Helicobacter pylori su....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
