小鼠脂肪组织采集与RNA分析前处理

摘要

本文的目的是介绍一种从小鼠体内采集不同白色脂肪组织、处理脂肪样本并提取RNA的逐步操作流程。

摘要

与其他组织相比，白色脂肪组织含有较少的RNA和蛋白质，因此在进行实时PCR和Western Blot等下游应用时面临挑战，因其主要成分为脂质。从脂肪组织样本中提取RNA也较为困难，需要额外步骤以避免脂质干扰。本文介绍了一种从小鼠中采集三种解剖位置不同的白色脂肪组织、处理样本并进行RNA提取的实验方法。我们进一步描述了cDNA的合成以及利用实时PCR进行基因表达分析的实验步骤。本方案可有效减少采集过程中动物毛发和血液对脂肪组织的污染，以及不同脂肪组织之间的交叉污染。该方法经过优化，能够确保提取RNA的数量和质量满足要求。本方案可广泛应用于各类需要获取小鼠脂肪组织样本进行常规实验（如实时PCR）的动物模型，但不适用于原代脂肪细胞培养中的RNA提取。

引言

肥胖是一种全球性流行病，可能导致2型糖尿病等并发症¹。饮食诱导的肥胖动物模型和基因修饰动物模型常被用于肥胖及其相关并发症的研究。传统上，白色脂肪组织被认为是储存多余能量的场所，主要由脂质构成，而棕色脂肪组织则将能量转化为热量^2,3。脂肪组织具有动态特性，其体积会随着食物摄入量和体力活动等多种因素的变化而发生扩张或收缩。因此，为了确定导致这些变化的影响因素，必须进行充分的脂肪组织采集与处理⁴。

在白色脂肪组织中，皮下脂肪库和内脏脂肪库具有不同的特性（如解剖定位和功能）是普遍公认的^2,5。因此，为了避免出现相互矛盾的结果或较大的变异性，在采集脂肪垫时需注意避免不同脂肪库之间的交叉污染。

此外，从小鼠白色脂肪组织中分离RNA或蛋白质时存在三个主要挑战。首先，在肥胖小鼠中收集脂肪垫并非易事，因为不同白色脂肪储存部位之间的边界并不总是清晰可辨，这与其他器官（如肾脏和心脏）不同。⁶第二，由于脂肪组织含有较高的脂质，在提取RNA或蛋白质时，脂质会在上层形成一层漂浮物，阻碍对样本的直接接触。第三，与棕色脂肪组织或其他组织相比，白色脂肪组织的RNA和蛋白质含量显著较低，这在使用幼龄小鼠、饲喂正常（N）饮食的小鼠以及预期脂肪质量较低的小鼠时尤为突出，成为主要关注问题。即 基因敲除模型、药物处理、运动训练等^7,8.

因此，选择合适的方法从脂肪组织中分离RNA至关重要。除酚/氯仿抽提法外，另一种方法是使用商业化试剂盒。这类试剂盒通常基于初始的酚抽提步骤，随后通过离心柱进行RNA纯化⁹。然而，这些试剂盒通常成本较高，获得的RNA得率较低，且RNA质量可能不稳定，但操作更省时。相比之下，本文所述酚溶液/氯仿抽提法最大的优势在于可从同一样本中同时分离RNA、DNA和蛋白质¹⁰。由于小鼠脂肪垫通常体积较小，提取的RNA和蛋白质量较少（尤其是在瘦型小鼠模型中），这些方案能够最大限度地从少量样本中获取更多数据。

本文的目的是详细描述一种方法，以确保从小鼠的三个白色脂肪组织库中充分采集样本，并获得高质量和足量的RNA。按照本方案获得的RNA可用于进行实时PCR检测。本方案不适用于从原代培养的脂肪细胞中分离RNA。

方案

实验中使用的小鼠护理遵循加拿大动物保护委员会制定的实验动物护理和使用标准。所有实验程序均获得CHUM研究中心大学动物护理与使用委员会的批准。

1. 雄性小鼠的尸检与脂肪组织采集

1. 根据研究目的设置实验分组。本研究中，样本采集自两组C57Bl/6背景的雄性小鼠（每组n=12-14）。确保所用小鼠年龄为12至15周，在12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养，并分别提供普通饮食（N）或高脂饮食（HF）及饮水 随意摄取 持续10周¹¹.
2. 通过将小鼠置于密闭容器中并暴露于6% CO环境中实施安乐死₂ 10 分钟内
3. 通过将装有26G 1/2英寸针头的1 mL注射器缓慢插入动物胸骨左侧稍偏位置，进行心脏穿刺，并缓慢回抽活塞以采集动物大部分血液。确保注射器与动物身体保持平行。若血液未进入注射器，可在缓慢回抽活塞的同时轻轻旋转注射器。
   注意： 成功的心脏穿刺（采血量在0.8至1.0 mL之间）可减少血液对脂肪组织的污染。
4. 将小鼠仰卧放置，使用22G针头如图所示将每只爪子固定在垫板上 图1.
5. 用纱布蘸取酒精，从颈部开始，沿单一方向朝生殖器官方向反复擦拭小鼠皮肤，此操作可使毛发紧贴皮肤，减少毛发对脂肪组织样本的污染，且无需去除毛发。
6. 使用洁净但非无菌的镊子和手术剪，提起靠近生殖器官的中央皮肤，做一个约0.3 mm的小切口。
7. 将剪刀水平插入已打开的切口，分离腹部皮肤与腹壁。
   注意： 通过在皮肤与腹壁之间的间隙进行钝性分离来完成，而非切断该间隙中存在的膜状结构。
8. 使用镊子提起开口附近中央的皮肤，并剪开其上方的皮肤 白线 直到接近肋骨区域（约4厘米，具体取决于小鼠体型）。
   注意： 避免切割腹肌，因为这可能会使内脏脂肪组织暴露于空气中，导致脂肪垫干燥，从而影响组织及其内容物的完整性。
9. 从胸廓中部开始，沿皮肤向右前肢方向切开约2 cm。从靠近生殖器官处开始，沿右后肢上方皮肤切开约2 cm。
10. 拉伸已切开皮肤的一个角，使用22G针头将其固定在垫上。对另一角重复此操作。
    注意： 暴露在皮肤下的脂肪组织是腹部皮下脂肪（SCF）图1A).
11. 使用手术剪尽可能贴近皮肤表面，以钝性分离的方式将皮下脂肪组织从皮肤上剪下并收集。收集后，将皮下脂肪组织置于预先标记好的铝箔上。
    注意： 收集脂肪组织时若混入皮肤或毛发，会因RNase污染而影响样本质量和RNA得率。若花费过多时间采集脂肪组织，样本可能因干燥而影响其质量。
12. 重复步骤1.9至1.11，操作动物左侧。将左右两侧的脂肪垫合并置于铝箔中，并用液氮速冻样本。
13. 为获取内脏脂肪组织，使用洁净但非无菌的手术剪和镊子沿腹肌切开 白线，于 约4厘米，具体长度根据小鼠体型从生殖器至肋骨 cage。然后从生殖器向小鼠背部方向在腹部肌肉上做一长约2.5厘米的切口，以暴露腹腔器官侧面。
14. 生殖器官周围的脂肪为性腺周围脂肪（PGF）图1B）。由于PGF附着于附睾、睾丸和 输精管小心地将左侧脂肪垫从这些结构上分离，并置于预先标记的铝箔上。右侧同样操作。待两侧PGF收集完毕后，将样本置于液氮中冷冻。
15. 从左侧开始，将肠道移向右侧腹腔，以暴露肾脏。包围肾脏周围的脂肪组织为肾周脂肪（peri-renal fat, PRF）。图1C）。PRF 还包绕着肾上腺（图1D).
16. 在采集PRF之前，分离并去除肾上腺。此步骤可能较为繁琐，因为肾上腺颜色仅略深于脂肪组织。
    注意： 此步骤中不应移除肾脏，因为血液可能污染脂肪组织，从而增加在此脂肪垫中辨认肾上腺的难度。
17. 从背部肌肉壁上分离出PRF，切断输尿管、肾动脉和肾静脉，使PRF和肾脏与身体其余部分分离。通过剪除并移除肾包膜，将PRF从肾脏上分离。PRF仍附着于包膜上。
18. 重复步骤1.15和1.17处理右侧。将两份PRF用铝箔包裹后，置于液氮中冷冻样品。
19. 对所有待采集的小鼠重复执行步骤 1.2 至 1.18 的操作。
20. 此时，可继续进行脂肪组织研磨，或将样品保存于 -80 °C 超低温冰箱中以备后续提取。样品在 -80 °C 条件下可稳定保存数年。⁴.

2. 用于RNA提取的白色脂肪组织研磨制备

注意：每个步骤均需佩戴手套，因为皮肤含有RNase，可促进RNA降解，从而影响样本质量和分离后的RNA得率。

1. 为每只小鼠准备并标记三个无RNase的1.5 mL锥形螺口离心管，每种白色脂肪组织各使用一管，并将离心管放置于离心管架上。
   注意：肥胖动物可能需要额外的离心管，因其脂肪质量较大。特别是皮下脂肪（SCF），一只小鼠最多可能需要7个离心管。
2. 使用70%乙醇清洁实验台，并在台面上铺上干净且全新的实验台纸。
3. 无论脂肪组织是从小鼠新鲜采集，还是先前已保存于-80 °C冰箱中，均应将所有样本集中存放于一个盛有液氮的容器中，直至开始实验操作。
4. 将研钵、研杵和刮勺放入液氮容器中进行冷冻。当液氮停止“沸腾”时，即可开始研磨脂肪组织。
   注意：从本步骤起，研钵、刮勺、离心管和脂肪组织在整个操作过程中必须始终保持低温。任何热量都会导致脂肪组织融化，从而增加RNA提取难度。此外，若使用陶瓷研钵和研杵，可使用干冰和/或液氮维持其低温状态。
5. 将步骤2.2中准备好的所有无RNase的1.5 mL锥形螺口离心管置于干冰上，使其充分冷却。
6. 为避免手部冻伤，使用数层牛皮纸包裹，将研钵从液氮中取出并放置于工作台面上。
7. 使用镊子从液氮中取出一份脂肪组织样本，放入研钵中。迅速揭开铝箔，将样本置于研钵中央。
   注意：若脂肪组织样本过大（如肥胖小鼠的情况），可在铝箔内用拇指将其分割为较小部分，并分别进行研磨。
8. 使用数层牛皮纸包裹，将研杵从液氮中取出并插入研钵中。在用牛皮纸握住研杵的同时，用锤子轻击研杵顶部一至两次。通过旋转并向下施压的方式研磨样本，直至形成细粉状。
   注意：此步骤对获得充分的RNA分离至关重要。较大组织碎片的存在将阻碍RNA提取，并降低得率。
9. 待样本研磨成细粉后，取出研杵，从液氮中取出刮勺，将粉末转移至对应的预冷1.5 mL锥形离心管中。
   注意：应定期将刮勺重新浸入液氮中，以防止样本融化。同时，始终将离心管置于干冰中，防止样本解冻。为获得足够的RNA产量和数量，每个离心管中应装入约2/3体积（约1 mL）的研磨样本。
10. 当离心管装入约1 mL样本后，盖紧管盖，并将其放入另一个盛有液氮的容器中。
    注意：多余样本可分装至其他预冷的无RNase 1.5 mL锥形离心管中，保存于-80 °C冰箱以备后续使用。
11. 使用牛皮纸清洁研钵、研杵和刮勺，以避免样本交叉污染。将研杵和刮勺重新放回液氮中冷却。尽管牛皮纸并非无RNase，但每天进行RNA提取时均使用新开封的牛皮纸包装。
12. 对下一个样本重复执行步骤2.4至2.11。
13. 所有样本处理完毕后，可立即开始RNA提取，或将其保存于-80 °C冰箱中以备后续使用。
    注意：为防止离心管破裂，可将样本盒完全浸入液氮中进行冷冻。当样本盒充分冷却后，倒出多余的液氮，使其漂浮于液氮液面上。将样本有序放入样本盒中，并转移至-80 °C冰箱保存。

3. 从研磨的脂肪组织中分离RNA

注意：苯酚溶液对皮肤有害。请穿戴实验服、手套和护目镜，并在通风橱内操作。分步流程图见图2。

1. 准备并标识两组无RNase的1.5 mL离心管，并将其放入管架中。
2. 无论脂肪组织是新鲜研磨还是预先储存在-80 °C冰箱中，均应将所有样品收集于装有液氮的容器中，直至开始实验操作（实验主要在室温下进行）。
3. 使用镊子从液氮中取出一份研磨好的脂肪组织样品，并放入管架中。每管应含有约1 mL粉末，相当于约100 mg组织粉末。
4. 缓慢打开管盖。
   注意：将密闭的离心管置于室温或过快打开管盖可能导致样品损失或受伤，因为氮气压力倾向于从管中迅速释放。
5. 向样品中加入500 µL酚溶液（酚溶液与组织粉末的体积比为1:2）。
6. 盖紧管盖，以最大速度涡旋震荡约5秒。然后缓慢而小心地打开管盖以释放氮气压力（可听到气体从管中逸出的声音）。
7. 重复步骤3.5和3.6。最终加入样品中的酚溶液体积为1 mL。
8. 重复步骤3.6，直至样品完全溶解。
   注意：在继续下一步操作前，必须彻底释放管内所有压力，以防离心管爆裂。
9. 让样品在室温下静置，同时对后续样品重复步骤3.4至3.8。
10. 所有样品处理完毕后，短暂以最大速度涡旋震荡，并在室温下孵育5分钟。
11. 在4 °C条件下以12 000 x g离心10分钟，然后将离心管恢复至室温。
    注意：离心后会出现三个相层，如图2所示：脂肪（上层）、RNA（中间层）和沉淀（底层）。
12. 对于每个样品，使用P1000移液器配合滤芯吸头，尽可能多地将RNA（中间粉红色层）转移至对应的第一组离心管中。每次更换样品时均需更换吸头。
13. 为尽量减少脂质（上层）对RNA（中间层）的污染，应将吸头从管壁附近刺入上层相。将RNA转移至新的离心管时，避免触碰新管内壁，以防将可能附着在吸头外表面的脂质带入。
14. 向每个样品中加入200 µL纯氯仿，颠倒混匀15秒。室温孵育10分钟。
15. 在4 °C条件下以12 000 x g离心15分钟，然后将离心管恢复至室温。
    注意：离心后出现三个相层：RNA（上层）、含有DNA的中间相（中层）以及含有蛋白质的红色酚-氯仿相（底层）。
16. 对于每个样品，使用滤芯吸头的P1000移液器，尽可能多地将含RNA的无色水相（上层）转移至对应的第二组离心管中。每次更换样品时均需更换吸头。
    注意：中间相较为脆弱，若吸取速度过快可能扰动并污染上层相。作为替代方案，可使用P200移液器以降低扰动中间相的风险。
17. 向每个样品中加入500 µL 100%异丙醇，颠倒混匀15秒。
18. 室温孵育10分钟。
19. 在4 °C条件下以12 000 x g离心10分钟，然后将离心管恢复至室温。通过倒置离心管弃去异丙醇。
    注意：通常可见少量白色RNA沉淀，但有时可能不可见。
20. 向每个样品中加入1 mL 75%乙醇（由100%乙醇与无RNase水配制而成），并以最大速度短暂涡旋震荡每管。
21. 在4 °C条件下以7 500 x g离心5分钟，然后将离心管恢复至室温。
22. 通过倒置离心管弃去75%乙醇，并轻敲于棕色纸上以去除残留液体。
    注意：如有需要，可使用滤芯吸头去除靠近RNA沉淀处的乙醇。每次更换样品时均需更换吸头。
23. 保持管盖打开，将RNA沉淀在空气中干燥约15–20分钟。
    注意：在此过程中，RNA沉淀可能变得半透明。
24. 由于RNA从沉淀中的溶解具有大小依赖性，应评估沉淀大小以确定用于溶解RNA的无RNase水体积。记录每个样品所需的体积（10至25 µL）。
    注意：此步骤仅为定性判断。若无法观察到RNA沉淀，则向样品中加入10 µL无RNase水。
25. 向每个样品中加入10–25 µL无RNase水（根据步骤3.24预先确定的体积）。
26. 将样品置于60 °C金属浴中孵育5分钟。短暂涡旋震荡各管。
27. 在相同60 °C金属浴中再孵育5分钟。
28. 将所有样品在小型迷你离心机中快速离心，并立即置于冰上。
29. 测定RNA浓度和纯度。进行逆转录（RT）以获得cDNA，或将样品储存于-80 °C冰箱中以备后续使用。
    注意：避免反复冻融，以免降解RNA样品。

4. 脂肪组织RNA浓度与纯度的测定

1. 无论脂肪组织RNA样本是 freshly 提取并溶解的，还是预先储存在-80 °C冰箱中的，均需收集所有样本，并在冰上解冻至实验开始前。此步骤应在下一步开始前或RNA提取结束时立即进行，以避免多次冻融循环。
2. 准备并标记两组无RNase的1.5 mL离心管，并将其放入试管架中。
3. 当所有RNA样本完全解冻后，涡旋震荡样本1秒，然后放回冰上。
4. 在第一组无RNase的1.5 mL离心管中，使用过滤的无RNase枪头将RNA用1x TE溶液稀释100倍（向管中加入99 µL 1x TE溶液和1 µL RNA）。
5. 对每个样本重复上述步骤。
   注意： 不同分光光度计因所用比色皿不同，所需体积可能有所差异。
6. 所有样本处理完毕后，涡旋震荡每个稀释后的RNA样本。
7. 按照分光光度计的操作说明，使用空白对照（1x TE）校准仪器，然后再测定稀释后的RNA样本。
8. 将稀释后的RNA样本转移至石英比色皿中，测定其在260 nm处的吸光度以确定浓度。
   注意： 若分光光度计无法直接提供最终RNA浓度，可使用以下公式计算：RNA (µg/µL) = OD₂₆₀ × 稀释倍数 × (40 µg RNA/1 000 µL)。
9. 通过计算OD₂₆₀/OD₂₈₀比值来评估每个样本的RNA纯度。
   注意： OD₂₆₀/OD₂₈₀比值约为2.0时，通常认为RNA较纯¹²。强烈建议验证RNA质量。为此，取1 µg RNA上样于含1%次氯酸钠溶液的1%琼脂糖凝胶（使用1x TBE缓冲液配制，含89 mM Tris碱、89 mM硼酸和2 mM EDTA，pH 8.0）进行电泳¹³（图3）。高质量RNA应清晰显示28S和18S rRNA条带，且28S条带强度应高于18S。当两个rRNA条带强度相近时，RNA质量可接受；若18S条带强于28S，或出现弥散条带（smear），则提示RNA已降解，质量不佳。
10. 对于每个样本，在第二组无RNase的1.5 mL离心管中，使用无RNase水将RNA储备液稀释，制备10 µL、浓度为0.5 µg/µL的RNA溶液。这些样本将用于逆转录（RT）以合成cDNA。
11. 所有样本处理完成后，立即开始逆转录反应，或将其储存于-80 °C冰箱中以备后续使用。

5. 逆转录（RT）

1. 无论脂肪组织RNA样本是 freshly稀释至0.5 µg/µL，还是预先储存在-80 °C冰箱中，均需收集所有样本和试剂，并将其置于冰上解冻，直至开始实验操作。
2. 将PCR管条架放在冰上。待其充分冷却后，准备并标识一组无RNase的PCR管条，放置于架上，需包含一个空白对照管。
3. 配制RNA的DNase处理反应液：按所需样本数加1个样本量配制总反应体系（单个样本用量如下）：使用滤芯吸头加入1 µL 10X反应缓冲液（含MgCl₂）、0.5 µL DNase I（1 U/µL）和7.5 µL无RNase水。每管分装9 µL。
4. 向每管中分别加入1 µL浓度为0.5 µg/µL的RNA样本，盖紧管盖，将各管条在小型离心机中瞬时离心，使液体沉至管底。空白对照管中加入1 µL无RNA酶的水。
5. 将所有PCR管条置于PCR仪或加热块中，在37 °C孵育30分钟。孵育结束后将管条放回冰上的管架中。
6. 向每管中加入1 µL EDTA（50 mM），将所有管条置于PCR仪或加热块中，在65 °C孵育10分钟。孵育结束后将管条放回冰上的管架中。
7. 按所需样本数加1个样本量配制总反应体系（单个样本用量如下）：使用滤芯吸头加入1 µL随机六聚体引物（0.2 µg/µL）和1 µL dNTP混合液（含四种脱氧核苷酸，每种浓度为10 mM）。每管分装2 µL总反应液，每处理一个样本更换新的吸头。
8. 将所有PCR管条置于PCR仪或加热块中，在65 °C孵育5分钟。孵育结束后将管条放回冰上的管架中。
9. 按所需样本数加1个样本量配制总反应体系（单个样本用量如下）：使用滤芯吸头加入4 µL 5x反转录缓冲液、1 µL RNase抑制剂（20 U/µL）、0.25 µL反转录酶（200 U/µL）和1.75 µL无核酸酶水。每管分装7 µL，每处理一个样本更换新的吸头。
10. 在PCR仪中进行反转录反应，程序设置如下：25 °C孵育10分钟，50 °C孵育30分钟，85 °C孵育5分钟。反应结束后将管条放回冰上的管架中。
11. 准备并标识另一组无RNase的PCR管条，放置于冰上管架中。
12. 对于每个样本，使用超纯水在新的PCR管条中将cDNA原液按1:5比例稀释，配制所需体积。稀释后的cDNA样本将用于实时定量PCR。
13. 所有样本处理完成后，可立即开始实时定量PCR，或将样本（包括原液和稀释液）储存于-20 °C冰箱中以备后续使用。

6. 脂肪组织中基因表达的实时 PCR 检测

注意：避免将荧光染料暴露于光线下。以下方案描述了参考基因 s16¹⁴ 的扩增过程。引物和 PCR 条件应根据目标基因进行相应调整。

1. 无论cDNA样品是 freshly diluted 1:5 还是预先储存在-20 °C冰箱中，均需收集所有样品和试剂，并将其置于冰上融化，直至开始实验操作。
2. 将实时PCR管条的支架放在冰上。待其充分冷却后，准备并标记一组实时PCR管条，并将其放置在支架上。每个样品及空白对照均需设置复孔。
3. 配制主混合液（按所需样品数加1个样品的总量计算，以下为单个样品用量）：1.9 µL超纯水、5 µL荧光染料（如SYBR Green）、0.3 µL上游引物和0.3 µL下游引物。每管中加入7.5 µL主混合液。
4. 向每管中加入2.5 µL来自各样品的1:5稀释cDNA；空白对照管中加入2.5 µL超纯水。盖紧各管条的管盖。
5. 按照仪器制造商的说明，在实时PCR仪上设置以下程序：95 °C孵育10分钟，随后进行40个循环，每个循环包括50 °C 15秒、60 °C 30秒、70 °C 30秒。将样品管条放入实时PCR仪的转子中，启动程序。
   注意：热循环条件可能因所用仪器和目标基因的不同而有所调整。在图3中展示的mRNA表达结果，是以参考基因S16的mRNA扩增为基准进行标准化的leptin mRNA扩增结果^14,15。

结果

在完成解剖程序后，从两组小鼠（正常饮食组和高脂饮食组）中采集了三种白色脂肪组织并称重。与正常饮食组小鼠相比，高脂饮食组小鼠的最终体重和体重增加均显著升高（表1）。此外，肥胖小鼠的前列腺周围脂肪（PGF）、肾周脂肪（PRF）和皮下脂肪（SCF）重量较正常饮食组增加了两倍以上。

在进行任何涉及分离RNA的实验之前，需按照步骤4.9所述评估其纯度。对于每份白色脂肪组织，采用酚溶液法提取的RNA样品质量均达到可接受水平，其OD260/OD280比值约为2.0，符合RNA纯度标准（表2）。实时PCR结果显示，与正常饮食（N饮食）小鼠相比，肥胖小鼠的PGF、PRF和SCF中瘦素（leptin）mRNA表达水平显著升高（图4A）。事实上，两组小鼠之间leptin mRNA表达的差异并非源于用于结果标准化的参...

讨论

高脂饮食喂养后，与正常饮食喂养的小鼠相比，肥胖小鼠的体重和白色脂肪组织重量均增加。使用苯酚溶液提取的RNA具有良好的纯度。瘦素（leptin）是一种主要由脂肪组织产生的脂肪因子，已知其与脂肪质量呈正相关¹⁶。正如预期，随着脂肪质量的增加，肥胖小鼠中瘦素mRNA的表达也相应升高。

该方法包含若干关键步骤。其中最主要的一步是避免不同白色脂肪组织储存部位之间的交叉污染，因为已知不同的脂肪组织储存部位具有不同的功能^2,5。污染可能导致后续应用中产生误导性结果。此外，由于脂肪暴露于空气中后容易干燥，因此若需称重，建议在不同小鼠之间以规律且一致的速度收集白色脂肪组织，否则脂肪垫的总重量可能不准确。为了获得高质量和高得率的RNA，遵循近期发表的MIQE指南具有重要意义¹⁷。特别是，在研磨过程中将样品制成极细的粉末，有助于最大化得率，从而在RNA提取过程中增加组织粉末与苯酚溶液之间的接触...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 注射器
1X TE 溶液（10 mM Tris-HCl 和 1 mM EDTA•Na2，pH 8.0）
22 G 针头
26 G 针头
75% 乙醇
金属浴（干式加热器）
氯仿	Sigma	C2432-500mL
dATP	Thermo scientific	R0141
dCTP	Thermo scientific	R0151
dGTP	Thermo scientific	R0161
DNase I（1 U/µl）	Thermo scientific	EN0521
dTTP	Thermo scientific	R0171
Faststart Universal SYBR green Master (Rox)	Roche	4913922001
Faststart universal SYBR green master (Rox) 荧光染料	Roche	4913914001
滤芯吸头
镊子	Instrumentarium	HB275
纱布
锤子
高脂啮齿类动物饲料	Bio-Serv, Frenchtown, NJ	F3282
异丙醇	Laboratoire MAT	IH-0101
瘦素正向PCR引物（5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’）10 uM
瘦素反向PCR引物（5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’）10 uM
液氮
Maxima 逆转录酶（酶及5x缓冲液）	Thermo scientific	EP0742
纳米纯水（即超纯水）
丁腈检查手套
丁腈手套
正常啮齿类动物饲料	Harlan Laboratories, Madison, WI	Harlan 2018
P1000 移液器
P2 移液器
P20 移液器
P200 移液器
苯酚溶液（TRIzol）	Ambion Life Technologies	15598018
预先标记的铝箔
石英分光光度计比色皿
PCR管条架
RT-PCR管条架
随机六聚体	Invitrogen	58875
实时PCR Rotor Gene系统	Corbett research	RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler
带制冷功能的台式离心机
RiboLock RNase抑制剂	Thermo scientific	EO0381
无RNase的1.5 mL离心管
无RNase的1.5 mL螺口管
无RNase的PCR管条（0.2 mL）及管盖
无RNase水	Hyclone	SH30538.02
RT-PCR仪	Qiagen	Rotor-Gene Corbett 3000
RT-PCR管条（0.1 mL）及管盖
S16正向PCR引物（5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’）10 uM
S16反向PCR引物（5’-ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’）10 uM
分光光度计	Biochrom	Ultrospec 3100 pro
不锈钢研钵和研杵
手术垫	自制，由泡沫板包裹一次性吸水垫制成
手术剪	Intrumentarium	130.450.11
热循环仪
热循环仪	Biometra	Thermocycler
涡旋混合器
药匙