بروتوكول بسيط عالي الكفاءة لعزل الجزيرة البنكرياسية عن الفئران

ملخص

وصف بروتوكول عزل الجزيرة هذا مسارًا جديدًا لحقن الكولاجين لهضم الأنسجة الخارجية وإجراء تدرج مبسط لتنقية الجزر من الفئران. وهو ينطوي على الهضم الأنزيمي، فصل التدرج / تنقية، ومجموعة انتقاء اليد. يمكن أن ينتج عن العزل الناجح 250-350 جزيرة عالية الجودة وكاملة التشغيل لكل ماوس.

الملخص

جزر البنكرياس، وتسمى أيضا الجزر من Langerhans، هي مجموعة من خلايا الغدد الصماء التي تنتج الهرمونات لتنظيم الجلوكوز وغيرها من الوظائف البيولوجية الهامة. الجزر تتكون في المقام الأول من خمسة أنواع من الخلايا التي تفرز الهرمونات: خلايا α تفرز الجلوكاجون، خلايا بيتا تفرز الأنسولين، خلايا δ تفرز سوماتوستاتين، خلايا تفرز غريلين، وخلايا PP تفرز ببتيد البنكرياس. 60 إلى 80٪ من الخلايا في الجزر هي خلايا بيتا، والتي هي أهم خلية السكان لدراسة إفراز الأنسولين. جزر البنكرياس هي نظام نموذج حاسم لدراسة إفراز الأنسولين في الجسم الحي السابق. الحصول على جزر عالية الجودة هو ذو أهمية كبيرة لبحوث مرض السكري. تتطلب معظم إجراءات عزل الجزيرة صعوبة تقنية في الوصول إلى موقع حقن الكولاجين، وإجراءات الهضم القاسية والمعقدة، وخطوات تنقية التدرج المتعددة الكثافة. تتميز هذه الورقة بطريقة بسيطة عالية الإنتاجية لعزل جزيرة الماوس مع أوصاف مفصلة ومظاهرات واقعية، وتبين الخطوات المحددة التالية: 1) حقن الكولاجين P في أمبولة فاتر، وهي منطقة صغيرة تنضم إلى قناة البنكرياس و القناة الصفراوية المشتركة، 2) الهضم الأنزيمي والفصل الميكانيكي للالبنكرياس exocrine، و 3) خطوة تنقية التدرج واحد. مزايا هذه الطريقة هي حقن إنزيم الجهاز الهضمي باستخدام أمبولة أكثر سهولة من Vater، والهضم أكثر اكتمالا باستخدام مزيج من النهج الأنزيمية والميكانيكية، وأبسط خطوة تنقية التدرج واحد. ينتج هذا البروتوكول ما يقرب من 250-350 جزيرة لكل ماوس; والجزر الصغيرة هي مناسبة لمختلف الدراسات في الجسم الحي السابق. المحاذير المحتملة من هذا الإجراء يحتمل أن تكون مصحوبة بأضرار الجزر بسبب الهضم الأنزيمي و / أو حضانة التدرج لفترات طويلة، وكلها يمكن تجنبها إلى حد كبير عن طريق تبرير الإعلان الدقيق لوقت الحضانة.

المقدمة

هناك طريقتان شائعتان في الأدب لعزل الجزيرة البنكرياسية. واحد يتطلب استئصال البنكرياس وتقطيعه إلى قطع صغيرة باستخدام مقص الجراحية، ومن ثمهضمه في محلول الكولاجين 1،^2،3. طريقة أخرى أكثر دقة هو استخدام شبكة من القنوات الموجودة في البنكرياس لإدخال إنزيم الجهاز الهضمي. وقد استخدمت المواقع التالية لحقن الإنزيم الهضمي: تقاطع القناة الصفراوية والكيسي، المرارة في القناةالصفراوية المشتركة، أو القناة الصفراوية المشتركة نفسها 1،^4،5. ومن المعروف أن الجزر لا توزع بالتساوي في البنكرياس. منطقة الطحال....

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها (ACUC) من جامعة تكساس A & M. تظهر الأدوات الجراحية اللازمة في الشكل 1 ويظهر الرسم التخطيطي للإجراء في الشكل 2.

1- الحلول

1. إعداد حل الملح المتوازن هانك (HBSS) عن طريق إضافة 100 مل من 10X HBSS (من المخزون) إلى 900 مل من الماء المقطر لجعل 1 L HBSS (1X).
2. إعداد حل STOP (يجب أن تكون طازجة وينبغي استخدامها في غضون 1 ح) عن طريق إضافة 50 مل من 100X المصل البقري الجنيني (FBS) إلى 450 مل من الجليد البارد 1X HBSS؛ هذا يجعل 500 مل إيقاف الحل. حافظ على حل STOP عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.
3. ....

النتائج

إكمال هذا الإجراء بشكل صحيح يتطلب بعض الفهم لتشريح الماوس في تجويف البطن. وهذا يسمح لتحديد السليم من أمبولة من Vater ولقط من القناة الصفراوية المشتركة. يستغرق الإجراء بأكمله عادة 1-2 ساعة. ومن الأكثر كفاءة عزل الجزر الصغيرة من 4-6 فئران في نفس الوقت، لذلك يمكن طرد العديد من العينات معاً. ويختلف وقت قطف الجزر، حسب عدد الجزر وكفاءة الهضم؛ قد يستغرق الأمر حوالي ساعة لاختيار 250-350 جزيرة صغيرة من فأر واحد.

في هذه الورقة، يتم تضمين عدد من الصور واقعية جدا: الشكل 3 يظه.......

المناقشة

ويشمل هذا البروتوكول التسريب الكولاجينوووووووالهضم، تليها تنقية الجزر. الخطوات الأكثر أهمية من هذا البروتوكول هي الحقن الفعال والتسريب الكامل من البنكرياس^1،4،7. طريقة التسليم من هذا البروتوكول يسمح للإنزيم لاجتياز الطرق التشريحية لهضم أفضل الأنسجة exocrine المحيطة الجزر¹. وبالإضافة إلى ذلك، هذه التقنية هي مناسبة تماما للهضم الكامل للمنطقة الطحال، والتي لديها أعلى تركيز من الجزر⁴

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
3 مل حقنة	BD	309657	Hoding collagenase P
Coverglass ملقط	VWR	82027-396	عقد جلد الفأر للمساعدة في إجراء الشق
ملقط منحني	Z168696		الأنسجة أثناء إزالة البنكرياس
B13B16A الأيزوفلوران	بيرامال		لتخدير الفئران قبل الجراحة
أطباق بتري 100 مم	VWR	30-2041	يستخدم لثقافة الجزر
الصغيرة 30 G. ½ بوصة إبرة	BD	305106	لاختراق أمبولا من فيتر لتوصيل الكولاجيناز P - يتم استخدام هذا المقياس لأنه يناسب بشكل جيد معظم أنابيب CBDs
50 مل	VWR	89039-658	عقد أنسجة البنكرياس المهضومة ، والكولاجيناز P ، والجزر المنقاة
وسادات ماصة مع حاجز رطوبة مقاوم للماء	VWR	82020-845	لامتصاص الدم من العمليات السيورجية
الطرد المركزي 5810R مع دلو التأرجح والقدرة على التباطؤ	Eppendorf	5811FJ478114	تستخدم لأنسجة تكوير الأنسجة ، يتم تشكيل الحبيبات في الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي - هناك حاجة إلى جهاز طرد مركزي دلو متأرجح. كما أن ميزة التباطؤ مهمة لتشكيل طبقات التدرج.
كولاجيناز P- 1g	Roche Diagnostics	11249002001	لهضم البنكرياس الإفرازي
مقص جراحي منحني	فيشر سيانتيفيك	13-804-21	لقطع بطن الفأر المفتوح
مجهر تشريح	أوليمبوس	SZX16	يستخدم لتحديد الهياكل التشريحية الرئيسية لتوصيل الكولاجيناز بدقة إلى البنكرياس
محلول الملح المتوازن من هانك 10x	Corning	20-023-CV	خلايا
الغسيل Histopaque-1077	Sigma	RNBF5100	لتكوين التدرج
مصدر الضوء	ليدز	LR92240	تعزيز رؤية المجهر
RNaseZap	Fisher-Scientific	AM9780	لإزالة وسائط RNase
RPMI-1640 بدون L-Glutamine	Corning	15-040-CV	الاستزراع
شوارتز ميكرو سيرفينات (مشبك الأوعية الدموية الدقيقة)	أدوات العلوم الدقيقة	18052-01	لقط القناة الصفراوية المشتركة والشريان الكبدي
اهتزاز حمام مائي	Boekel / Grant	8R0534008	مهم للهضم الميكانيكي للأنسجة الخارجية
مقص جراحي صغير	VWR	82027-578	أنسجة Cuttitng التي تنتشر إلى البنكرياس

عقد جهاز جزر