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一种简单高效的小鼠胰岛分离方案

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DOI：

10.3791/57048

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2019年8月30日

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1Department of Nutrition and Food Science, Texas A&M University, 2Children's Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine

本文内容

摘要

本胰岛分离方案描述了一种新型的胶原酶注射途径，用于消化外分泌组织，并采用简化的梯度步骤从小鼠中纯化胰岛。该方法包括酶消化、梯度分离/纯化以及人工挑选胰岛。成功分离可每只小鼠获得250–350个高质量且功能完整的胰岛。

摘要

胰岛，也称为朗格汉斯岛，是一类内分泌细胞簇，可产生调节葡萄糖及其他重要生物学功能的激素。胰岛主要由五种分泌激素的细胞组成：α细胞分泌胰高血糖素，β细胞分泌胰岛素，δ细胞分泌生长抑素，ε细胞分泌饥饿素，PP细胞分泌胰多肽。胰岛中60%至80%的细胞为β细胞，是研究胰岛素分泌最重要的细胞群体。胰岛是研究离体胰岛素分泌的关键模型系统。获取高质量的胰岛对糖尿病研究至关重要。大多数胰岛分离方法需要在胶原酶注射位点进行技术难度较高的操作，涉及剧烈且复杂的消化过程，以及多次密度梯度纯化步骤。本文介绍一种操作简便、得率高的小鼠胰岛分离方法，提供详细的描述和真实演示，具体步骤如下：1）在法特壶腹（连接胰管与胆总管的一个小区域）注射胶原酶P；2）通过酶消化和机械分离法去除外分泌胰腺组织；3）单次梯度纯化步骤。该方法的优势在于利用更易接近的法特壶腹进行消化酶注射，结合酶消化与机械分离实现更彻底的组织消化，并采用更简单的单梯度纯化步骤。本方案每只小鼠可获得约250—350个胰岛，所得胰岛适用于多种离体研究。该操作可能存在的局限性包括酶消化或梯度孵育时间过长可能导致胰岛损伤，但通过谨慎控制并合理调整孵育时间，这些问题在很大程度上可以避免。

引言

文献中报道了两种常见的胰岛分离方法。一种方法需要切除胰腺，并用手术剪将其剪切成小块，然后在胶原酶溶液中进行消化1,2,3。另一种更为精确的方法是利用胰腺中存在的导管网络将消化酶引入组织。以下部位已被用于注射消化酶：胆管与胆囊管的汇合处、胆囊至胆总管，或直接注入胆总管本身1,4,5。已知胰岛在胰腺中的分布并不均匀，其中脾脏区域含有最多的胰岛6。尽管通过解剖通路递送消化酶的第二种方法能够实现对胰腺（包括脾脏区域）更完整的灌注，但该操作通常需要夹闭或缝合技术上较具挑战性的法特壶腹。在胰岛纯化方面，已采用多种密度梯度、细胞筛以及磁性分离技术来纯化胰岛3,7。使用这些梯度的方法可能耗时较长，且Ficoll梯度可能对胰岛造成毒性损伤8。

本方案基于Li等7所述方法，并结合我们及其他研究者1,4的经验进行了进一步优化。本方案最关键的步骤包括：在靠近肝脏端夹闭胆总管，通过十二指肠乳头注入胶原酶P以消化外分泌组织，随后使用摇动水浴从机械层面加速消化过程1,4,7。接着，加入“终止（STOP）”溶液以抑制胰岛的进一步消化，并使用HBSS洗涤去除残留的胶原酶P及STOP溶液。有研究报道，与使用Percoll梯度相比，采用Ficoll法纯化人胰岛时，胰岛得率提高了一倍，且功能更强（如胰岛素分泌能力）9。然而，已有研究对Ficoll梯度的使用提出质疑，因其对胰岛具有毒性作用1,10。据报道，Histopaque梯度在小鼠胰岛分离中可提供最佳的纯化动力学，能够以更简单的步骤和更低的成本获得高产量、高质量的胰岛1。在本方案中，采用Histopaque-1077对胰岛与其他残留组织进行分离纯化8,11。所获得的胰岛可培养于完全RPMI-1640培养基中，也可直接用于RNA/蛋白质定量分析。

我们的方案结合了胶原酶P消化和单梯度纯化步骤，比其他已发表的方案更为简便。本方法无需复杂的手术操作，仅包含几个简单的步骤。更重要的是，该方案能够稳定地获得较高产量的高质量功能性胰岛（每只小鼠250–350个），正如我们此前所报道的12。

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方案

本文所述所有方法均已获得德克萨斯农工大学动物护理与使用委员会（ACUC）的批准&M 大学。所需手术工具如图所示 图1 该操作流程的示意图如下所示 图2.

1. 溶液

  1. 通过将100 mL 10X HBSS（来自储备液）加入900 mL蒸馏水中，配制1 L 1X HBSS（Hank’s平衡盐溶液）。
  2. 通过将50 mL 100X胎牛血清（FBS）加入450 mL冰浴的1X HBSS中，配制STOP溶液（必须现配，并在1小时内使用）；此操作可制备500 mL STOP溶液。将STOP溶液保存在4 °C。
  3. 通过将1 mg/mL胶原酶P加入冰浴的1X HBSS中，配制胶原酶P溶液（必须在使用前1小时内新鲜配制）；每只小鼠使用6 mL。
    1. 向胶原酶P溶液中添加0.05%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）（为分离的胰岛提供营养）。例如，在6 mL胶原酶P溶液中加入3 mg BSA。保持在冰上。
    2. 计算并准备所有小鼠所需的胶原酶P总量，置于一个50 mL离心管中。
  4. 通过向含5.5 mM葡萄糖的500 mL RPMI 1640培养基中添加10% FBS、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素以及INS-1细胞补充剂（10 mM HEPES、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠和0.05 mM 2-巯基乙醇），配制完全RPMI 1640培养基，用于过夜培养和孵育。

2. 准备

  1. 准备三个50 mL离心管，每管中加入25 mL RNase抑制溶液、70%乙醇或蒸馏H2O。这些溶液将在手术前及手术过程中用于清洁外科器械。
  2. 在开始实验方案前，将器械尖端浸泡于RNase抑制溶液中30分钟，以彻底清除器械上可能存在的RNase。
  3. 预先将吸水垫裁剪为6英寸×6英寸大小，供手术期间使用。
  4. 提前配制1X HBSS溶液，并于4 °C保存。手术前配制STOP溶液，并同样置于4 °C保存。
  5. 手术前立即配制胶原酶P溶液，并置于冰上保存。
    注意：该溶液应在配制后2小时内使用完毕。
  6. 标记用于消化和纯化的50 mL离心管；每只小鼠准备两管，一管用于消化，另一管用于胰岛纯化。确保两只管上均标注动物编号。
  7. 向第一支50 mL离心管中加入3 mL胶原酶P溶液。剩余的3 mL胶原酶P溶液将用于注射。
  8. 用装有30 G ½英寸针头的3 mL注射器吸取剩余的3 mL胶原酶溶液，并将注射器置于冰上备用。

3. 实验步骤

  1. 将所有工具从RNase抑制溶液中取出后，先浸入盛有70%乙醇的试管中，再浸入装有蒸馏H₂O的试管中2然后在干净的纸巾上风干。
  2. 将小鼠放入含有0.5 mL异氟烷的麻醉舱中，直至小鼠深度麻醉。
  3. 将小鼠从舱室中取出，用镊子夹捏足垫以检查麻醉状态。深度麻醉的判断依据为呼吸变得持续缓慢，且小鼠对足部夹捏无反应。确认小鼠已深度麻醉后，采用颈椎脱臼法实施安乐死，随后将小鼠置于吸水垫上。
    1. 将麻醉后的小鼠置于俯卧位，按压颈部，并通过牵拉尾巴使脊髓与脑部分离。
  4. 将小鼠仰卧位固定于吸水垫上，用70%乙醇喷洒其体表，并擦去多余乙醇。
  5. 使用盖玻片镊子和弯头手术剪进行切口。首先在腹部区域皮肤上做一条横向切口（约3 cm），将皮肤充分拉开以暴露腹壁；然后在腹膜上做一条纵向切口（约3–4 cm），以完全暴露腹腔内的胰腺。图3).
  6. 将肝脏的叶向上推，以暴露胆管，其外观呈淡粉色管状（图3).
  7. 小心地将腹腔右腰/髂区的肠管移向右侧，暴露胆管和肝动脉（图3).
  8. 使用 Schwartz 微型止血钳小心夹闭胆总管图1尽可能靠近肝脏。
  9. 识别位于十二指肠乳头处的法特壶腹，该结构由胰管与胆总管汇合而成。在解剖显微镜下观察，法特壶腹呈现膨胀状，是胆总管的入口。图4).
    注意：调整解剖显微镜的光照强度和角度可能有助于更清晰地定位。
  10. 将含有3 mL胶原酶P溶液的注射器插入瓦特壶腹。将针头推入胆管，深度约为胆总管长度的1/4（壶腹通入胆管），如图所示。 图5.
  11. 针头进入壶腹后，应确保针头方向与胆管平行。
  12. 使用微型Adson镊子夹住针头以固定，防止其刺穿导管图5).
  13. 缓慢而稳定地将注射器中的3 mL胶原酶P溶液注入胆总管（注入至有阻力感为止），如图所示。 图6目的是产生反向压力，迫使胶原酶进入胰管。若胰腺的头部、颈部、体部和尾部区域均完全膨胀，则视为注射成功。
    注意：如果胰腺未完全膨胀，或脾脏区域未充分膨胀，胰岛产量将会很低。脾脏区域含有最多的胰岛。6可通过观察胰腺组织间出现充满液体的空隙来确认膨胀。
  14. 小心地解剖出肿大的胰腺，并将其放入含有3 mL冰冻的胶原酶P溶液的50 mL消化管中。
    1. 使用两把镊子（弯镊和显微有齿镊；参见 图1）：（从脾脏开始，将胰腺从脾脏分离，然后继续从胃部及沿十二指肠方向剥离。
      注意：无需切口。
    2. 用精细手术剪在消化管中将胰腺剪碎3–5秒，加入3 mL冰冷的胶原酶P溶液图7A).
  15. 将试管固定在37 °C水浴中的试管架上，以100–120 rpm振荡约12–13分钟。
  16. 孵育后，用手轻轻振荡试管以破碎组织，直至胶原酶P消化液变得均匀图7B）。通过观察胰腺组织是否呈现细沙状颗粒来确认匀浆的均匀性。通常轻轻手动振荡约30秒即可。将离心管置于光线下观察组织是否充分匀浆；若需要，可再振荡约15秒。
  17. 消化完成后立即将试管置于冰上，并加入40 mL预冷的终止液以终止酶消化反应。
    注意：若同时处理多只小鼠，消化管可在冰上放置最多2小时。
  18. 将试管放入摆桶式离心机中，以 300 x g 30 秒（离心机温度可调）。
    注意：使用水平转子离心机，以便组织沉淀位于50 mL离心管底部而非管壁上；这对获得更高的胰岛产量至关重要。
  19. 倾去上清液，再用 STOP 溶液重复离心 2 次，每次离心后均倾去溶液。每次后续洗涤使用 20 mL STOP 溶液。
    1. 每次离心前，将组织沉淀在50 mL离心管中的20 mL STOP溶液中轻轻振荡，以充分分散沉淀。
  20. 用40 mL预冷的HBSS重悬组织沉淀，300 x g离心 g 30 秒。
  21. 倾去上清液，使用水平转子离心机，用20 mL HBSS溶液再重复离心洗涤两次，每次离心后均倾去上清液。
    1. 每次离心前，轻轻振荡含有20 mL HBSS溶液的离心管，以重悬沉淀并使其脱离管底。
  22. 最后一次离心后，去除所有 HBSS。
  23. 然后向含有沉淀的50 mL离心管中加入5 mL室温密度梯度液。低速涡旋振荡片刻，直至混匀。
  24. 向50 mL离心管中再加入5 mL室温密度梯度液。 不要涡旋/混合。
    注意：它是一种 关键的 到 保持稳定且静止 以便形成更佳的梯度，且不造成干扰。
  25. 将10 mL室温HBSS缓冲液用移液器加入含有密度梯度的离心管中， 逐滴轻柔地 和 缓慢地 以形成梯度。使用带有10 mL移液管的移液枪逐滴加入HBSS。
  26. 使用水平转子离心机，以1700 x g 15分钟。务必将加速和减速的速度均调至最低档，以保持梯度稳定（图7C).
  27. 离心后，小心取出离心管，避免扰动密度梯度。使用预先用冷的HBSS润洗过的移液枪（将HBSS上下吸取数次），将密度梯度与HBSS之间形成的胰岛层（5–10 mL）转移至新的50 mL胰岛收集管中。
    注意：在吸取胰岛前，先用冷的HBSS润洗移液器，以防止胰岛粘附在移液器内壁上。
    1. 如果分离不完全，可在密度梯度层中观察到胰岛，此时用移液器吸出全部10 mL密度梯度液（底层）以及在界面处形成的胰岛层（仅保留约8–10 mL HBSS上层液体）。
      注意：同时收集胰岛层和密度梯度层（底层）可能会导致收集到碎片，从而延长胰岛挑选时间，但不会影响其他步骤。当胰岛层形态良好时，无需同时收集这两层。
  28. 向含有胰岛的新50 mL离心管中加入20 mL预冷的HBSS，随后以350 x g 在摆动桶式离心机中离心3分钟。
  29. 离心后，小心地用移液器吸取（不要倾倒吸出上清液（底部保留约 3 mL），注意不要扰动底部含有胰岛的沉淀物。弃去上清液。
  30. 重复洗涤和离心至少3次，每次加入20 mL HBSS，并确保每次离心前充分重悬沉淀。
  31. 将 RPMI-1640 完全培养基瓶置于 37 °C 水浴中预热后再使用。最后一次离心后，弃去全部 HBSS，向沉淀中加入 4 mL 预先配制好的含 FBS、INS-1 细胞添加剂和青霉素/链霉素的完全 RPMI-1640 培养基。
  32. 轻轻旋转离心管使沉淀物悬浮，立即将RPMI-1640培养基倒入一个100 mm的培养皿中。向离心管中再加入5 mL RPMI-1640培养基，轻轻旋转以冲洗残留的胰岛，并将此培养基也倒入同一培养皿中。
    1. 在解剖显微镜下，使用 20 µL 移液器从培养皿中挑选健康的胰岛，并将其转移至含有 10 mL 完全 RPMI 1640 培养基的新培养皿中。在解剖显微镜下观察，胰岛应呈球形或椭圆形，呈金棕色，表面光滑，与相对透明、絮状的外分泌组织相区别。
      注意：解剖显微镜的放大倍数通常设置为12.5–16倍。胰岛产量会因小鼠品系、年龄和性别等因素而有所不同。本方案通常可从4–10月龄健康的C57BL/6J小鼠获得250–350个健康的胰岛。
  33. 在无菌培养箱中，于37 °C、5% CO₂条件下孵育胰岛2 过夜用灌注液和95%加湿空气孵育，用于次日实验，或在需要时将胰岛冷冻保存以备后续分析。
    1. 胰岛一旦冻存，便无法再用于分泌实验，仅可用于RNA或蛋白质定量。为收集待冻存的细胞，需将其置于HBSS缓冲液中，收集全部胰岛于200–500 µL缓冲液内，转移至1.5 mL离心管，350 x g 静置1–2分钟，弃去上清液，残留液体不超过30–40 µL，置于-20 °C短期保存（数天）或-80 °C长期保存。

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结果

正确完成该操作需要对小鼠腹腔内的解剖结构有一定了解，以便准确识别法特壶腹并夹闭胆总管。整个操作通常需要1–2小时。同时从4–6只小鼠中分离胰岛效率更高，这样可将多个样本一起进行离心。挑取胰岛所需时间因胰岛数量和消化效率而异；从1只小鼠中挑取250–350个胰岛大约需要1小时。

本文包含多张非常逼真的图像：图3展示了小鼠的腹腔，暴露了胆总管和肝动脉。图4显示了胆总管的全长，其颜色较浅，以及瓦特壶腹（Vater ampulla），在胰腺与十二指肠交界处（即针头插入位置）附近更为膨大且有光泽。在靠近肝脏处的胆总管与肝动脉束上放置止血夹，以阻止胶原酶P流入肝脏。若胆管夹闭不准确或不够紧密，将导致泄漏，从而造成胰腺灌注不完全。图5显示针头已插入瓦特壶腹并进入胆总管。一旦针头进入胆总管，需使用镊子固定针头，防止其在注射过程中刺穿胆管。注射开始后，胰腺将从近端向远端逐渐肿胀；注入约1 mL胶原酶后，脾脏区域应开始膨胀。...

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讨论

本方案包括胶原酶灌注与消化，随后进行胰岛纯化。该方案最关键的步骤是对胰腺进行有效的注射和完全的灌注1,4,7。本方案的递送方法可使酶沿解剖路径运行，从而更有效地消化胰岛周围的外分泌组织1。此外，该技术特别适用于脾部区域的完全消化，该区域胰岛浓度最高4,6。通过严格控制消化时间并仔细执行纯化步骤，本方案可获得250–350个健康的胰岛。采用本方案分离的胰岛已成功用于离体研究葡萄糖刺激的胰岛素分泌12。根据我们的经验，在含5.5 mM葡萄糖的RPMI-1640完全培养基中过夜孵育后，高葡萄糖刺激（22.2 mM）下的胰岛素分泌量较基础水平（3.3 mM）增加4倍。胰岛在长期孵育（2–7天）条件下的存活能力/功能尚未进行测试。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们非常感谢詹妮弗·蒙圭亚女士（Ms. Jennifer Munguia）为示意图提供的艺术插图。感谢休斯顿社区公共广播电台KPFT的迈克尔·R·霍尼格先生（Mr. Michael R. Honig）在编辑方面提供的帮助。本研究得到了美国糖尿病协会项目 #1-15-BS-177（YS）以及美国国立卫生研究院 R56DK118334/R01DK118334（YS）的资助。本工作还得到了美国农业部国家食品与农业研究所Hatch项目1010840（YS）和R01 DK095118（SG）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3 mL 注射器BD309657用于盛装胶原酶 P
盖玻片镊子VWR82027-396夹持小鼠皮肤以辅助切口操作
弯头镊子Sigma-AldrichZ168696在胰腺摘除过程中夹持组织
异氟烷PiramalB13B16A手术前用于麻醉小鼠
100 mm 培养皿VWR30-2041用于胰岛培养
30 G. ½ 英寸针头BD305106用于穿刺壶腹以注入胶原酶 P —— 选用该规格是因为其可良好适配大多数胆总管
50 mL 离心管VWR89039-658用于盛装消化后的胰腺组织、胶原酶 P 及纯化的胰岛
带防水屏障的吸水垫VWR82020-845用于吸收手术过程中的血液
5810R 型离心机，配备摆动桶转子及减速功能Eppendorf5811FJ478114用于沉淀组织，沉淀物形成于锥形管底部 —— 必须使用摆动桶离心机。此外，减速功能对于形成梯度层至关重要
胶原酶 P，1 gRoche Diagnostics11249002001用于消化外分泌胰腺组织
弯头手术剪Fisher-Scientific13-804-21用于剪开小鼠腹腔
解剖显微镜OlympusSZX16用于识别关键解剖结构，以准确将胶原酶注入胰腺
Hank's 平衡盐溶液 10 倍浓缩液Corning20-023-CV用于洗涤细胞
Histopaque-1077SigmaRNBF5100用于形成密度梯度
光源LeedsLR92240增强显微镜下的可视性
RNA酶清除剂（RNaseZap）Fisher-ScientificAM9780用于去除RNA酶
不含L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基Corning15-040-CV用于胰岛培养
Schwartz 微型止血钳（微血管夹）Fine Science Tools18052-01用于夹闭胆总管和肝动脉
振荡水浴箱Boekel/Grant8R0534008对胰腺外分泌组织进行机械消化至关重要
小型手术剪VWR82027-578用于剪除附着在胰腺上的组织

参考文献

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