Enquête de synthèse de l’ARN à l’aide de 5-Bromouridine étiquetage et immunoprécipitation

Résumé

Cette méthode peut être utilisée pour mesurer la synthèse de l’ARN. 5-Bromouridine est ajouté aux cellules et incorporé dans l’ARN synthétisé. Synthèse de l’ARN est mesurée par l’extraction de l’ARN immédiatement après marquage, suivi par immunoprécipitation 5-Bromouridine-ciblées d’étiquetés RNA et analyse par transcription inverse et la PCR quantitative.

Résumé

Lorsque les niveaux de l’état stationnaire RNA sont comparées entre deux conditions, il n’est pas possible de distinguer si les changements sont causés par des modifications de la production ou la dégradation de l’ARN. Ce protocole décrit une méthode pour la mesure de la production d’ARN, à l’aide de 5-Bromouridine étiquetage d’ARN suivie d’immunoprécipitation, qui permet l’investigation de l’ARN synthétisé dans un court délai (par exemple, 1 h). L’avantage de 5-Bromouridine-étiquetage et immunoprécipitation sur l’utilisation d’inhibiteurs de transcriptional toxiques, tels que le α-amanitine et l’actinomycine D, est qu’il n’y aucune ou très peu d’effets sur la viabilité cellulaire lors d’une utilisation à court terme. Cependant, parce que le 5-Bromouridine-immunoprécipitation capte seulement RNA produites dans le court délai d’étiquetage, produit lentement comme rapidement dégradés RNA peut être difficile à mesurer par cette méthode. L’ARN 5-Bromouridine-marqué capturé par 5-Bromouridine-immunoprécipitation peut être analysé par transcription inverse, quantitative PCR et séquençage de la génération suivant. Tous les types d’ARN peuvent être l’objet d’une enquête, et la méthode n’est pas limitée à la mesure des ARNm est présenté dans cet exemple.

Introduction

5-Bromouridine (BrU) immunoprécipitation (IP) permet l’étude de la production d’ARN dans les cellules avec no ou des effets très limités sur cellulaire physiologie au cours de la brève période^1,2d’étiquetage. La méthode repose sur l’incorporation du dérivé synthétique de l’uridine BrU en ARN nouvellement synthétisé suivi par IP d’ARN marqué à l’aide d’anticorps anti-BrU (Figure 1).

On sait depuis des décennies que la synthèse de protéine peut être réglée de transcription, et l’existence de facteurs de transcription a émis l’hypothèse il y a plus de 50 a....

Protocole

Remarque : Exécutez toutes les étapes à la température ambiante, sauf indication contraire et garder les tampons sur la glace ou dans le réfrigérateur (à l’exception de l’élution de la mémoire tampon contenant du SDS). Le protocole est divisé en 5 sections : échantillons de la préparation de l’ARN ; préparation des perles de la propriété intellectuelle ; liaison de l’ARN marqué BrU de perles ; élution et la purification d’ARN de BrU-étiqueté lié par extraction de 3 étapes de phénol-phénol/chloroforme-chloroforme ; analyse de l’ARN (dans cet exemple à l’aide de la RT-qPCR)

1. préparation des échantillons d’ARN

1. Cellules HEK293T comt....

Résultats

Nos premiers tests de temps de BrU-étiquetage ont été effectuées dans les cellules CPIRA-1. Les cellules ont été traitées avec BrU 0, 1, 2 et 4,5 h, suivie par l’extraction de l’ARN totale et BrU-IP. GAS5 et GAPDH ont été mesurés dans l’ARN BrU-IP, ce qui démontre que l’étiquetage 1 h est suffisant pour atteindre un changement environ 9 et 44 fois comparé à fond (0 h) pour GAPDH et GAS5, respectivement.

BrU-propriété intellectue.......

Discussion

Ce protocole décrit l’utilisation de BrU-IP pour la détermination de la production d’ARN par étiquetage des nouvellement produites RNA pendant 1 h avec BrU, suivie d’extraction de l’ARN immédiate et immunoprécipitation d’ARN marqué BrU. Cette méthode a déjà été décrit dans référence¹⁶, et cet article comprend quelques étapes supplémentaires pour augmenter la spécificité de la propriété intellectuelle et de la pureté de RNA, par prétraitement des billes avec de faibles concentrations de BrU, mais a.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Inhibiteur de la Rnase Ribolock	ThermoFisher	EO0381
Dynabeads M-280 Mouton anti-souris IgG	Life Technologies	11202D
&alpha ;-Bromodeoxyuridine	souris anticorps BD Bioscience	555627
Nanodrop 1000	Thermo Fisher		Spectrophotométrie ultraviolette-visible
Phénol saturé en eau pH 6,6	ThermoFisher	AM9712
Phénol :Chloroforme :IAA 25:24:1 pH 6.6	ThermoFisher	AM9732
Kit d’isolement d’ARN hautement pur	Roche	11828665001
Taqman Fast Advanced Master Mix	ThermoFisher	4444557	qPCR Master Mix
Sondes d’ARN Taqman	ThermoFisher	SNCA : Hs01103383_m1, 18sRNA : Hs03928985_g1, ACTB : Hs01060665_g1, HMBS : Hs00609296, NADH : Hs01072843_m1	Sondes flurogéniques
7500 Système de PCR rapide en temps réel	Applied Biosystems
HEK293T lignée cellulaire	ATCC
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Lonza	BE12-604F
Sérum de veau fœtal	Biochrom	S0115
Pénicilline/Streptomycine	Biochrom	A2213
		de Hank	5,3 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,2 mM Na2HPO4 et 136,8 mM NaCl pH 6,77, autoclave.
DEPC-H2O			0,1 % de diéthylpyrocarbonate traité H2O
2xBrU-IP Tampon			40 mM Tris-HCl pH 7,5 et 500 mM NaCl dans DEPC H2O
2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibiteur			2xBrU-IP tampon complété par 1 &mu ; g/&mu ; L BSA et 80 U/mL Ribolock
BrU-IP+ 1 mg/mL d’héparine			2xBrU-IP tampon 1:1 DEPC-H2O et complété par 1mg/mL d’héparine
1xBrU-IP			tampon 2xBrU-IP dilué 1:1 dans du DEPC-H2O et complété par 0,5 &mu ; g/&mu ; L BSA et 20 U/mL Tampon
		d’élution	0,1 % SDS dans H2O sans ARNASE

Kit de transcription inverse d’ADNc haute capacité ThermoFisher 4368814 Tampon Ribolock