Summary
Este artículo proporciona un acercamiento actualizado al sistema clásico de codorniz-gallina de quimera para estudiar la formación del órgano, mediante la combinación de nuevos procedimientos experimentales in vitro e in ovo .
Abstract
El embrión aviar, como un modelo experimental, ha sido de suma importancia para descubrimientos seminales en Biología del desarrollo. Entre varios enfoques, la formación de quimeras de pollo de codorniz y el uso de las membranas corioalantoideas (CAM) para sostener el desarrollo de tejidos ectópicos remontan al siglo pasado. Hoy en día, la combinación de estas técnicas clásicas con las últimas metodologías en vitro ofrece nuevas perspectivas para profundizar en la formación de órganos.
Aquí se describe un enfoque de dos pasos para estudiar y finales-inicios de la organogénesis. Brevemente, la región embrionaria que contiene el territorio presuntivo del órgano es aislada de embriones de codorniz y crecido en vitro en un sistema organotypic (hasta 48 h). Los tejidos cultivados son posteriormente injertados en la leva de un embrión de pollo. Después de 10 días de desarrollo en ovo , órganos completamente formados se obtienen de los tejidos injertados. Este método también permite la modulación de vías de señalización por la regular administración de agentes farmacológicos y la manipulación genética del tejido a lo largo de los pasos del desarrollo in vitro e in ovo . Además, el desarrollo de los tejidos puede recogerse en cualquier ventana de tiempo para analizar su perfil de expresión génica (mediante PCR cuantitativa (qPCR), microarrays, etc.) y morfología (evaluado con biopsia e histología convencional).
El procedimiento experimental descrito puede utilizarse como una herramienta para seguir la formación del órgano fuera el embrión aviar, de las primeras fases de la organogénesis completamente formado y órganos funcionales.
Introduction
Embriones aves han sido ampliamente utilizados en estudios de Biología del desarrollo seminal. Las principales ventajas del modelo aviar incluyen la posibilidad de abrir el huevo, el relativamente fácil acceso al embrión y la capacidad para realizar la micromanipulación. Algunos ejemplos incluyen el sistema clásico de codorniz-gallina de quimera para estudiar células destino1, aplicación de factores de crecimiento específicos al embrión2y el crecimiento de las estructuras celulares ectópicos en el CAM1,3, 4.
Para obtener nuevos conocimientos en distintas etapas de la formación de órganos, recientemente hemos desarrollado un método que combina técnicas de injertos en vitro la manipulación de los tejidos embrionarios5. El enfoque de dos etapas permite la discriminación y la exploración de ambos - y finales-inicios de la organogénesis, que a menudo se limitan debido a interacciones de tejido altamente dinámicos y complejos2. Por otra parte, la falta de marcadores específicos de tejido adecuados con frecuencia limita el uso de transgénicos modelos animales6. Este novedoso método del enfoque de dos pasos en gran medida supera tales limitaciones.
Para estudiar las primeras etapas de formación del órgano, en el primer paso, el territorio embrionario codorniz que comprende el rudimento de órgano prospectivo es aislado y crecido en un sistema de organotypic in vitro durante 48 h. Durante este período, modulación farmacológica de vías de señalización específicas puede realizarse mediante la adición de drogas en el medio de cultivo5,7. Además, los tejidos cultivados pueden ser recogidos en cualquier etapa de crecimiento en vitro y sondeados para expresión génica (usando métodos tales como qPCR, microarrays, etc.).
En el segundo paso, 48 tejidos h cultivadas son entonces injertados en la leva de un embrión de pollo (c) en el día embrionario (E) 8 (cE8) (Hamburger y Hamilton (HH)-etapas de 33-35)8. La cámara se comporta como un surtidor vascular de nutrientes y permite gas intercambios1,3,4 a los tejidos injertados que permite su desarrollo en ovo por períodos más largos de tiempo. Este paso experimental es especialmente idóneo para estudiar las últimas etapas de la organogénesis, como órganos completamente formados pueden obtenerse después de 10 días en ovo desarrollo5,9,10,11 . Análisis morfológico se realizan fácilmente por la histología convencional para confirmar la formación adecuada del órgano y origen del donante de las células puede ser identificado por immunohistochemistry usando los anticuerpos específicos para cada especie (es decir, MAb codorniz PeriNuclear (QCPN)). Durante el período de incubación de la CAM, injertos también ser crecidos en presencia de agentes farmacológicos y recogidos en cualquier etapa de desarrollo para evaluar la progresión de la organogénesis.
El enfoque de dos pasos, descrito aquí en profundidad, ya se ha empleado en Figueiredo et al. 5 para explorar el desarrollo de primordio común aviar paratiroides/timo. En consecuencia, las particularidades inherentes de los territorios embrionarios y etapas de desarrollo en la organogénesis de la timo y las glándulas paratiroides se presentará a continuación.
El timo y el epitelio de las glándulas paratiroides, aunque funcionalmente distintas, deriva del endodermo de las bolsas faríngeas (PP)12. En aves, los epitelios de estos órganos proceden de la tercera y cuarta PP endodermo (3/4PP)12, mientras que en los mamíferos el epitelio tímico deriva la 3PP y el epitelio de las glándulas paratiroides deriva del 3PP y 3/4PP en ratón y humano, respectivamente de13,14.
Una de las etapas más tempranas en la formación de estos órganos es la aparición de discreta timo y paratiroides dominios en el primordio común. En los pollos, estos dominios pueden identificarse por hibridación en situ , con marcadores moleculares específicos, E4.515. Medida que avanza el desarrollo, estos rudimentos de órganos individualizan y separan de la faringe, mientras que rodea una cápsula mesenquimal fina, formada por las células derivadas de la cresta neural, (en E5; HH-stage 27). Más tarde el epitelio tímico es colonizado por células progenitoras hematopoyéticas (en E6.5; HH-stage 30)12.
Como en estudios clásicos de codorniz-gallina de1,12, el enfoque de dos pasos es particularmente útil para estudiar la formación de los órganos hematopoyéticos/linfoide, es decir el timo5. Como explante de la codorniz, con el rudimento del órgano, se injerta en el embrión de pollo antes de la colonización de células progenitoras hematopoyéticas, un timo quimérico se forma con las células del progenitor transmitidas por la sangre del pollo infiltrando una contraparte epitelial tímica de codorniz. Por lo tanto, este método es una herramienta útil para explorar la contribución de las células hematopoyéticas en el desarrollo del sistema hemato/linfoide aviar.
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Protocol
Todos estos experimentos siguen el cuidado de los animales y normas eticas de la Centro Académico de Medicina de Lisboa.
1. incubación de codornices fertilizado y huevos de gallina
- Incubar codornices japonesas (japonica del coturnix Coturnix) y huevos de gallina (Gallus gallus) fertilizado durante los días 3 y 8, respectivamente.
- Colocar los huevos con la cámara de aire (extremo romo del huevo) hacia arriba en una incubadora humidificada a 38 ° C.
- Utilizar huevos de codorniz alrededor de 20 y 40 huevos de gallina para realizar este experimento.
Nota: Estos números deben doblarse cuando se establece este procedimiento por primera vez.
2. aislamiento de región embrionaria de codorniz que contiene el territorio presuntivo de rudimentos de timo y paratiroides
Nota: Ejecutar el huevo procedimientos de manipulación en condiciones estériles, utilizando una campana de flujo laminar horizontal y los instrumentos esterilizados y materiales.
- Preparar un recipiente grande de vidrio borosilicato de 3/4 lleno con solución salina fría con tampón fosfato (PBS).
- Abrir un huevo de codorniz después de 3 días de incubación golpeando la cáscara y corte una abertura circular en el lado opuesto de su extremo romo con tijeras curvas. Cuidadosamente retire los trozos de cáscara y transferir el embrión a la taza de cristal llenada de PBS frío.
- Sostener el embrión de codorniz (q) en el E3 (qE3) (la etapa de la codorniz correspondiente a la etapa de HH 21 del pollo) con la ayuda de Pinzas finas. Hacer un corte en la membrana vitelina que envuelve la yema con unas tijeras curvas. Continúan cortadas alrededor y desde el exterior a la circunferencia de los vasos extra embrionarios.
- Transferencia del embrión a un pequeño tazón 3/4 lleno con PBS frío con la ayuda de Pinzas finas. Lave muy bien el embrión de la yema restante adjunto.
- Utilizar una espumadera para transferir el embrión a una copa de 100 mm plato de Petri con base negra (véase Tabla de materiales) que contienen 10 mL de PBS frío.
- Coloque la placa de Petri bajo un estereomicroscopio.
Nota: Desde este punto hacia adelante, realice los procedimientos de microcirugía bajo un estereomicroscopio aumento progresivo. Como fuente de iluminación, se recomienda utilizar luces LED incorporadas en el estereomicroscopio o en las fibras ópticas, teniendo en cuenta la carga térmica limitada. - Mantener el embrión en la parte inferior de la placa con pernos insectos delgados. Coloque cuatro pasadores formando un cuadrado en la región extra embrionario.
- Quite las membranas extra embrionarias de la región cefálica con la ayuda de Pinzas finas y coloque un alfiler Quinta allí.
Nota: Si el embrión está correctamente colocado, entonces la vesícula ótica, el tubo del corazón y la 1st, 2ndy 3rd arcos faríngeos (PAs) deben ser visibles. - Disecar la región embrionaria de interés, es decir, elrd de 3 y 4th de región arco faríngeo (3/4PAR), usando las tijeras de ojo de Wecker.
- Comience cortando longitudinalmente y paralelo al eje del embrión, entre la zona de tubo somite/neural y el PAs.
- Retire el tubo ventral ubicado corazón cortándolo. Mantener las tijeras en la misma posición, girar la caja Petri para volver a colocar el embrión según la dirección del corte.
- Corte entre el 2y y 3rd PAs y por debajo de los 4th PA
- Separar las restantes membranas de la 3/4PAR con la ayuda de Pinzas finas.
- Aspirar los tejidos aislados (3/4PAR) y transfiera a un plato de cristal 3/4 llenan con PBS frío con una pipeta de plástico estéril de 2 mL.
Nota: En adelante, los tejidos pueden ser crecido en vitro hasta 48 horas o inmediatamente ser injertados en la leva de un embrión de pollo en E8. - Mantener el plato de cristal que contiene el aislado 3/4PAR en hielo durante la preparación de la prueba en vitro .
3. in Vitro Organotypic ensayo: cultura de la región embrionaria que contiene el territorio presuntivo de rudimentos de timo y paratiroides
- Preparar el medio de cultivo con Medio RPMI-1640 suplementado con 10% de SBF y el 1% de penicilina/estreptomicina.
Nota: Reactivos farmacológicos Soluble se pueden añadir al medio (por ejemplo, LY-411.575 (Ly) y di-benzazepine o cyclopamine y vismodegib, para inhibir la muesca y Hedgehog (Hh) señalización de vías, respectivamente. Para este ensayo, uso 50-200 nM de Ly o 5-15 μm de Di-benzazepine para inhibir la señalización de Notch en los 3 / 4PAR. Utilice 20 μm del cyclopamine o 10 μm de vismodegib para inhibir la señalización Hh 3/4PAR5. - Preparar el cultivo en vitro de explante 3/4PP en una placa de 6 pozos.
- Llenar un pocillo de la placa de la pozo de 6 con 5 mL de medio de cultivo. Coloque un 24 mm inserción de membrana de policarbonato (véase Tabla de materiales) en el pozo con la ayuda de Pinzas finas.
- Bajo el estereomicroscopio, transferir 3/4PAR explante desde el plato de vidrio a la superficie de la membrana deslizando suavemente con la ayuda de un trasplante de la cuchara (o espátula) y finas pinzas. Coloque los explantes con la parte ventral hacia arriba y el lado dorsal en contacto con la membrana. Añadir hasta siete explantes por inserción de la membrana. Continúe con el paso 3.4.
- Como alternativa, cultura explantes en flotación de filtros de membrana.
- Preparar una placa de Petri con 5 mL de medio de cultivo de 35 mm. Con la ayuda de Pinzas finas, flotador una membrana de filtro (ver Tabla de materiales) y mantener una superficie seca en contacto con el aire.
- Bajo el estereomicroscopio, transferir 3/4PAR explante desde el plato de vidrio para el filtro de membrana suave deslizamiento con la ayuda de un trasplante de la cuchara (o espátula) y finas pinzas. Coloque los explantes con la parte ventral hacia arriba y el lado dorsal en contacto con la membrana. Añadir hasta 8 explantes por filtro de membrana.
- Coloque cuidadosamente los explantes en pasos 3.2 y 3.3 en un incubador humedecido a 37 ° C con 5% CO2.
- Después de un período de incubación de 48 horas, retire la placa de 6 pozos y el plato de Petri de 35 mm de la incubadora.
- Recoger los explantes cultivados de la inserción de la membrana de la placa de la pozo 6.
- Añadir PBS a temperatura ambiente (RT) para la inserción de la membrana.
- Separar los explantes de la membrana, el lavado vigoroso con una pipeta de plástico estéril de 2 mL.
- Con la ayuda de la espátula y pinzas finas, transferencia de los explantes cultivados a un plato de cristal 3/4 llenados con PBS a TA.
- Asimismo, recoge los explantes cultivados desde el filtro de membrana flotante en el plato de Petri de 35 mm.
- Transferir el filtro de membrana con unas pinzas finas para un nuevo plato de Petri de 35 mm llenado de PBS a TA.
- Extraer los explantes del filtro de membrana de pipeteo vigoroso utilizando una pipeta de plástico estéril de 2 mL.
- Con la ayuda de Pinzas finas, descarga el filtro de membrana de explante libre después de confirmando que no explantes permanecieron unido a él.
- Con una espátula y pinzas finas, transferencia de los explantes a un plato de cristal llenado de PBS a TA.
- Recoger los explantes cultivados de la inserción de la membrana de la placa de la pozo 6.
- Transferencia de los explantes cultivados con una espátula a 1 mL de un reactivo para el aislamiento de RNA total y para estudios de expresión génica.
PRECAUCIÓN: Exposición a este agente reactivo (véase Tabla de materiales) puede ser un peligro grave para la salud. Utilizar guantes, ropa y gafas protectoras adecuadas. Siga las instrucciones de manejo y leer las hojas de datos de seguridad proporcionadas por el fabricante. - Injerto, los tejidos cultivados en CAM de embriones de pollo en E8. Siga al paso 4.
4. preparación de la CAM
- Retire los huevos de gallina con 8 días de desarrollo embrionario de la incubadora.
Nota: Los huevos fueron incubados con cámara de aire hacia arriba a 38 ° C en una incubadora humidificada. - Cubrir el extremo romo del huevo con cinta de plástico transparente para evitar que pedazos de la cáscara caiga en la cámara de aire. Toque la cáscara y cortar una abertura circular en el huevo con tijeras curvas. La cámara de aire debe ser visible.
- Retire con precaución la membrana blanca de la cámara de aire con unas pinzas finas. CAM es visible y accesible para el trasplante de tejido ectópico.
Nota: No utilice PBS para hidratar la CAM, antes o después del trasplante, ya que PBS promueve el deslizamiento y desplazamiento de los explantes. Si la membrana se seca, desechar el huevo.
5. injerto de los explantes cultivados en la CAM
- Crear pequeñas lesiones/heridas vasculares en vasos más pequeños de la CAM con un microscalpel en un soporte.
Nota: Utilice la punta de una pipeta Pasteur para eliminar sangre por capilaridad en el caso de sangrado excesivo. - Utilizar una espátula y pinzas finas para transferir el explante cultivado para el área de heridos de la CAM.
- Cortar un trozo de un papel de filtro ligeramente más grande que el explante y colóquelo en la parte superior del explante.
Nota: El papel de filtro ayuda a la localización de explante de seguimiento después de su desarrollo en la CAM. También, permite entrega diaria de la droga para el explante durante el desarrollo de ovo , si es necesario (descrito en el paso 5.6). - Sello de la ventana de huevo con cinta de plástico transparente e identificarlo utilizando un lápiz carbón.
Nota: La cinta plástica protege el embrión de la deshidratación durante el período de incubación. - Incubar el huevo manipulado durante 10 días en una incubadora humidificada a 38 ° C. Seguir al paso 6.
- Paso opcional: Drogas la administración diaria durante el período de incubación.
- Para acceder al filtro, levante parcialmente la cinta plástica. Añada 100 μl de solución de fármaco, gota a gota, sobre el papel. Volver a cerrar la ventana y volver a colocar el huevo en la incubadora humidificada a 38 ° C.
Nota: Para este ensayo, la dosis de 20 μm de cyclopamine inhiben la señalización Hh durante en ovo desarrollo5.
- Para acceder al filtro, levante parcialmente la cinta plástica. Añada 100 μl de solución de fármaco, gota a gota, sobre el papel. Volver a cerrar la ventana y volver a colocar el huevo en la incubadora humidificada a 38 ° C.
6. formación del órgano ectópico en la CAM tras 10 días de desarrollo de Ovo
- Después de 10 días de incubación, retirar el huevo de la incubadora y retirar cuidadosamente la cinta plástica.
- Corte la CAM en la región de filtro con tijeras curvas y transferencia explante derivado de CAM con papel de filtro a un vaso pequeño tazón 3/4 lleno con PBS frío.
- Con la ayuda de Pinzas finas transferencia explante derivado de CAM a una placa de Petri de 100 mm con base negra que contiene 10 mL de PBS. Retire con cuidado el papel de filtro y el exceso de membrana usando Wecker ojo tijeras y pinzas finas.
- CAM-explante de transferencia a la solución de fijación (3,7% PFA en PBS) con una espumadera. Eutanasia a los embriones de pollo sin quitarlas del huevo haciendo un corte preciso en la región del cuello del embrión con la ayuda de tijeras grandes.
- Evaluar la formación de órganos en secciones de parafina de los explantes derivados de CAM por inmunohistoquímica e histología convencional.
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Representative Results
Lo anterior describe detalles del Protocolo de un método que permite la investigación de ambos - y finales-inicios de la organogénesis, a menudo limitada por complejas interacciones celulares y moleculares.
Este método fue empleado anteriormente en Figueiredo et al. 5 para desentrañar el papel de Notch y Hh de señalización en el desarrollo de primordio común aviar paratiroides/timo.
En este documento, nuevos resultados se muestran en la figura 1 y figura 2 , utilizando el mismo modelo de la organogénesis. Figura 1A representa el diseño experimental utilizado para explorar las primeras etapas de formación de paratiroides y timo. El territorio embrionario codorniz que comprende los rudimentos de órganos posibles (3/4PAR) fue aislado y crecido en vitro por 48 h en un sistema organotypic.
Figura 1 . Resultados representativos obtienen con el ensayo de cultura organotypic: Análisis de expresión génica de la región embrionaria que contiene los territorios presuntivos del timo y paratiroides (3/4PAR) desarrollados en vitro para 48 h. Representación esquemática de la sección transversal del embrión en la región de interés y el diseño experimental (A). Brevemente, el 3/4PAR en qE3 era mecánicamente aislado y crecido en vitro para 48 h. La expresión de los genes relacionados con 3 y 4PAR Tbx1, Six1 y Bmp4, fue examinada por qRT-PCR utilizando los cebadores en la tabla (B). La expresión de Bmp4, Tbx1 y Six1 analizó recientemente aisladas (4PAR/3-0 h) y cultivo de tejidos (4PAR/3-48 h) (C). Se analizó la expresión de genes relacionados con la igualdad en los tejidos en vitro por 48 h en presencia de 200 nM Ly411575 (D) y 20 μm cyclopamine (E), que son inhibidores farmacológicos de muesca y vías de señalización de Hedgehog, respectivamente. Expresión de cada transcripción se midió como una relación contra la media de los niveles de expresión de la β-actinia e hipoxantina-guaninephosphoribosyltransferase transcripción y expresado en unidades arbitrarias (cada transcripción del control = 1). Medias y desviaciones estándar se determinaron con un software para análisis de Bioestadística y diseño gráfico científico. Barras de error representan desviaciones de la media. Dos colas desapareado del estudiante t-prueba y resultados eran considerados significativamente diferentes cuando el p-valor fue menor de 0.05 (p < 0.05). Β-actina, Actb; cyclopamine, Cyc; Hipoxantina-guaninephosphoribosyltransferase, Hprt; LY-411.575, Ly; N, Notocord; NT, tubo de los nervios; PAR, región arco faríngeo; PP, bolsa faríngea. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La expresión de genes que se sabe para ser implicado en la formación de estructuras PAR (genes relacionados con la igualdad), es decir, Tbx116,17, Six118y Bmp415,17, fue evaluada durante el normal desarrollo. Tiempo real cuantitativo PCR (qRT-PCR) se realizó como se describió anteriormente5 (cebadores aparecen en la figura 1B). Las transcripciones de los tres genes fueron detectadas recientemente aislada (4PAR/3-0 h) y en 48 h cultivo de tejidos (4PAR/3-48 h) (figura 1). Sólo niveles de expresión de Bmp4 fueron disminuidos perceptiblemente después de 48 h de cultivo.
Para evaluar el papel de Notch y vías de señalización en las primeras etapas de timo y paratiroides desarrollo Hh, inhibidores farmacológicos fueron agregados al medio de cultivo durante el desarrollo en vitro . Dosis de inhibidor se describen en Figueiredo et al. 5 los niveles de expresión de tres genes analizados se redujeron significativamente en las 3/4PAR crecido en presencia de inhibidor de la muesca, en comparación con las condiciones de control (sin drogas) (figura 1). Por el contrario, sólo Bmp4 transcripciones se redujeron significativamente en los tejidos cultivados h 48 cuando Hg señalización fue bloqueado (Figura 1E).
Para estudiar las últimas etapas de timo y paratiroides glándula organogénesis, los tejidos cultivados fueron injertados en CAMs y permitió desarrollar durante 10 días (véase el diseño experimental en la figura 2A).
Figura 2 . Resultados representativos de la de ovo ensayo: análisis morfológico de los injertos para 10 días en membranas corioalantoideas. Representación esquemática de 48 h cultivadas PAR injertado en la CAM y desarrollado durante 10 días (A). Secciones seriadas de los explantes derivados de CAM (B–) portaobjetos teñidos con H & E (B, C, Fy G), immunodetected con QCPN (D y E) y anti-Pan CK (H y yo) los anticuerpos y counterstained con hematoxilina de Gill. Cabezas de la flecha negra indican fuerte inmunotinción para QCPN (E) y CK Pan (). Una sección transversal de un timo quimérica células epiteliales tímicas derivados de codorniz con señales fuertes de QCPN+ (flecha negra) y células linfoides de host origen (E). Señales de fuerte Pan CK+ (flecha negra) en el epitelio del timo y glándulas paratiroides (). Imágenes fueron recogidas usando proyección de imagen de software y un microscopio con una cámara (véase Tabla de materiales). CA, cartílago; CAM, membranas corioalantoideas; EPI, epitelio; PAR, región arco faríngeo; PT, las glándulas paratiroides; MOS, músculo liso; 10 d, 10 días. Barras de escala, 50 μm (B, D, Fy H) y 100 (C, E, Gy). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Análisis morfológico de los órganos en los explantes derivados de CAM fue realizado por histología convencional e inmunohistoquímica (figura 2B–), como se describió anteriormente5. Los explantes derivados de CAM demostraron timo quimérica completamente formado (figura 2B–E) con derivados de codorniz (QCPN+) timo epitelio colonizado por las células progenitoras linfoides del origen dispensador de (pollo) (figuras 2D, E). Secciones seriadas de los explantes derivados de CAM la tramitación para inmunocitoquímica con anti-bandeja citoqueratina (CK de la cacerola) anticuerpos (un marcador de células epiteliales), mostró epitelio tímico y paratiroides con características morfológicas normales (figura 2 H I). Las células epiteliales tímicas visualizadas una arquitectura reticular paratiroides células parenquimatosas son globulares, dispuestas en racimos y rodeado por numerosos capilares. Además, se pudieran observar otras estructuras PAR derivados del aparato respiratorio en los injertos. Cartílago, epitelio respiratorio y músculo liso asociado a la mucosa se distinguen fácilmente en la figura 2B.
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Discussion
Un aspecto crucial para el éxito de este método es la calidad del pollo y codornices huevos. Teniendo en cuenta los períodos de incubación, especialmente durante el ensayo en ovo , una buena calidad de huevos de gallina mejora viabilidad precios (hasta un 90%) al final del procedimiento. Para lograr esto, prueba de huevos de diferentes proveedores. Incubar los huevos unmanipulated durante largos períodos (hasta 16-17 días) y comprobar su desarrollo. Para ser considerado un lote de buena calidad, más del 80% de los embriones deben presentar un desarrollo normal. También es importante asegurarse de que cada paso de incubación proporciona reproducibles etapas desarrollo sincrónicas para garantizar confianza y resultados verdaderamente representativos del final. Debido a la porosidad de la cáscara del huevo, mantener un ambiente humidificado en la incubadora para los pasos de incubación del huevo. Para evitar la contaminación ambiental, pueden añadirse antibióticos a las soluciones de PBS en el procedimiento (paso opcional).
Este método comienza por aislar rudimentos de órganos de codornices y cultivo en un sistema organotypic durante 48 h. Este primer paso, ya utilizado para el estudio de timo y paratiroides desarrollo temprano5, puede aplicarse también a otros órganos si las limitaciones del ensayo se toman en cuenta. Explantes pequeños de rudimentos de órganos (menos de 3 mm) y períodos cortos de incubación in vitro (hasta 48 h) se recomienda para prevenir la ineficiente difusión de nutrientes y secado de los tejidos, que ocurre generalmente cuando los explantes a dimensiones más grandes.
Este método también permite la modulación de vías de señalización, que omite la compleja manipulación genética por el uso de reactivos solubles, tales como inhibidores farmacológicos5,7. Para este procedimiento, dosis crecientes de la droga prueba para identificar las condiciones fisiológicas, tóxico cultura. Las acciones inhibitorias pueden medirse por el análisis de expresión génica de los señalización vía-genes de la blanco.
En el paso dos de este procedimiento, los tejidos cultivados son injertados en la leva para estudiar las últimas etapas de la formación de órganos. El análisis de la CAM se ha utilizado en otros contextos de la organogénesis como desarrollo del esqueleto y la formación de la pluma por injerto directo de los rudimentos de órganos en el CAM9,10,11. Además, engraftment CAM fue aplicado también con éxito en ratones en pollo xenoinjertos para el estudio de la maduración de los testículos19. Aunque el ensayo de CAM es una herramienta potente para estudiar las últimas etapas de la formación de órganos, es importante ser consciente de sus limitaciones. Uno de los pasos más críticos del protocolo es la preparación de la CAM para injertar. Es importante apuntar sólo los buques más pequeños para lesiones vasculares. Sin embargo, si sólo algunos de los lesionados, la respuesta angiogénica posterior puede no ser suficiente para promover la invasión de los tejidos injertados por nuevos vasos procedentes de la CAM. En consecuencia, los tejidos trasplantados no tendrá suficientes nutrientes o intercambios de gases para sostener el crecimiento. Por otro lado, si está comprometida la integridad de grandes vasos durante la preparación de la zona herida, el embrión debe ser desechado.
Una limitación importante en ovo desarrollo través de la CAM es el desplazamiento anatómico de los órganos formados, debido a la restricción tridimensional de cultivo de los explantes. Esto a menudo resulta en la separación incompleta de la timo y las glándulas paratiroides (figura 2F–) y en la inadecuada segmentación tímica, con reducción de la cantidad normal de órganos formados5.
Otra limitación del sistema CAM puede ser una accesibilidad óptima de reactivos farmacológico5, incluso con la administración diaria de drogas, limitando el análisis del desarrollo de etapa tardía del explante. Por ejemplo, estudios anteriores mostraron que cyclopamine con éxito inhibir Hh en ovo, mientras Notch signaling inhibidor, Ly411575, demostró no propiedades inhibitorias de ovo5.
Más allá de estas limitaciones, este método proporciona importantes aproximaciones experimentales para investigar las primeras - y finales-etapas de formación del órgano usando el modelo aviar. Además, desarrollo de los tejidos puede ser manipulado y cosechada en cualquier ventana de tiempo del desarrollo lo que el método también es adecuado para estudios longitudinales en organogénesis in vitro e in ovo .
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores están agradecidos con António Cidadão, Isabel Alcobia y Leonor Parreira para la lectura crítica del manuscrito, a Padma Akkapeddi para la narración del video, y a Vitor Proa desde el servicio de histología del Instituto de Histologia e Biologia Desarrollo, Facultad de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, para el soporte técnico. Estamos particularmente agradecidos a Paulo Caeiro y Hugo Silva de la unidad de audiovisuales (equipo Audiovisual), Facultad de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa por su compromiso excepcional con la producción de este video. Reconocemos Leica Microsystems para proporcionar amablemente un estereoscopio equipado con sistema de video y Interaves - Sociedade Agro-pecuaria, S.A. para contribuir con codorniz huevos fertilizados. Este trabajo fue apoyado por la Facultad de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Polycarbonate Membrane Insert | Corning | 3412 | 24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| 6-well culture plates | Nunc, Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| Pyrex bowls | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | normax | 5426015 | |
| Whatman qualitative filter paper | Sigma-Aldrich | WHA1001090 | Filter paper |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Cyclopamine hydrate | Sigma-Aldrich | C4116 | Pharmacological inhibitor of Hh signalling |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Stemolecule LY411575 | Stemgent | 04-0054 | Pharmacological inhibitor of Notch signalling |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Reagent for total RNA isolation |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 |
References
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