Summary
Zebrafisch wurden vor kurzem als in Vivo Modellsystem verwendet, um DNA-Replikation Timing während der Entwicklung zu studieren. Hier wird detailliert die Protokolle für die Verwendung von Zebrafisch-Embryonen Profil Replikation Timing. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um Replikation Timing in einzelnen Zelltypen, Mutanten, Krankheitsmodelle und andere Arten zu studieren.
Abstract
DNA-Replikation Timing ist eine wichtige zelluläre Eigenschaft, wichtige Beziehungen mit Chromatinstruktur, Transkription und DNA Mutationsraten ausstellen. Änderungen im Zeitplan der Replikation auftreten während der Entwicklung und in der Krebstherapie, aber die Rolle Replikation Timing spielt in der Entwicklung und Krankheit ist nicht bekannt. Zebrafisch entstanden vor kurzem als in Vivo Modellsystem Replikation Timing zu studieren. Hier wird detailliert die Protokolle für die Verwendung der Zebrabärbling zur DNA-Replikation Zeitpunkt bestimmen. Nach der Sortierung der Zellen aus Embryonen und Erwachsenen Zebrafisch, können hochauflösende genomweite DNA Replikation Zeitverzögerungsmuster konstruiert werden, durch die Bestimmung der Veränderungen der DNA-Kopienzahl durch Analyse der nächsten Generation Sequencing-Daten. Der Zebrafisch-Modell-System ermöglicht eine Auswertung der Replikation Timing Veränderungen, die auftreten, während der gesamten Entwicklung in vivo, und kann auch zu Veränderungen in einzelnen Zelltypen, Krankheitsmodelle oder mutierten Linien verwendet werden. Diese Methoden ermöglichen es Studien untersuchen die Mechanismen und Determinanten der Replikation Timing Aufbau und die Pflege während der Entwicklung, die Rolle Replikation Timing spielt in Mutationen und Tumorgenese und die Auswirkungen der erkunden Replikation Timing auf Entwicklung und Krankheit.
Introduction
Für die Zellen sich zu teilen erfolgreich müssen sie zuerst genau und treu ihre gesamte Genom repliziert werden. Genom Verdoppelung tritt in einem reproduzierbaren Muster, bekannt als der DNA-Replikation Timing Programm1. DNA-Replikation Timing korreliert mit Chromatin Organisation, epigenetischen Markierungen und Gen Ausdruck2,3. Änderungen im Timing der Replikation treten während der gesamten Entwicklung und sind deutlich Bezug auf transkriptioneller Programme und Änderungen zum Chromatin Marken und Organisation4,5. Darüber hinaus Replikation Timing ist korreliert mit mutagenen Frequenzen, und Änderungen im Timing in verschiedenen Arten von Krebs6,7,8eingehalten werden. Trotz dieser Beobachtungen die Mechanismen und Determinanten der Replikation Timing Errichtung und Ordnung sind noch weitgehend unbekannt, und es spielt die Rolle in der Entwicklung und Krankheit ist unbestimmt. Darüber hinaus hatte bis vor kurzem die genomweite Replikation timing während der vertebrate Entwicklung auftretende Änderungen nur in Kultur zellmodellen untersucht worden.
Zebrafisch, Danio Rerio, eignen sich gut, Replikation Timing in Vivo während der Entwicklung zu studieren wie ein einzelnes Paarung paar Hunderter von Embryonen, die entwickeln sich rasch mit vielen Ähnlichkeiten zu Säugetier-Entwicklung9hervorbringen kann, 10. Darüber hinaus gibt es während der gesamten Entwicklung der Zebrafisch, Änderungen in den Zellzyklus, Chromatin Organisation und transkriptionelle Programmen, die Beziehungen mit DNA-Replikation Timing11teilen. Zebrafisch sind auch ein hervorragendes genetisches Modell, wie sie sind besonders offen für Manipulation durch Transgenese, Mutagenese und gezielte Mutationen und genetischen Bildschirme haben viele Gene, die erforderlich für vertebrate Entwicklung12identifiziert. Daher kann Zebrafisch, Replikation Timing Aufbau und die Pflege beteiligten Gene zu identifizieren und um die Auswirkungen der Deregulierung Replikation Timing auf vertebrate Entwicklung beobachten verwendet werden. Transgene Linien können auch zur Replikation Timing von einzelnen Zelltypen isoliert an verschiedenen Zeitpunkten Entwicklungsstörungen oder Krankheiten zu beurteilen. Wichtig ist, gibt es verschiedene Zebrafisch Modelle menschlicher Erkrankungen, die verwendet werden, um die Rolle der Replikation Zeitmessung in Krankheit Entstehung und Progression9,13,14zu untersuchen.
Vor kurzem wurden die erste Replikation Timing Profile von Zebrafisch als Modellsystem Replikation timing in Vivo15studieren generiert. Um dies zu erreichen, wurden die Zellen von Zebrafisch-Embryonen in mehrere Phasen der Unternehmensentwicklung und in einem Zelltyp isoliert von Erwachsenen Zebrafisch gesammelt. Zellen wurden dann sortiert nach FACS, die anhand der DNA-Gehalt (Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung), G1 und der S-Phase-Bevölkerung zu isolieren. Kopieren Sie mithilfe der G1-Probe als eine Nummer Kopiersteuerung Nummer Variationen in S-Phase Populationen wurden ermittelt und verwendet, um relative Replikation Timing16ableiten. Änderungen im Zeitplan der Replikation können dann direkt zwischen verschiedenen Entwicklungsstörungen Proben und Zelltypen verglichen werden, und dies wurde verwendet, um Änderungen im Timing der Replikation zu ermitteln, die in Vivo in vertebrate Entwicklung auftreten. Diese Methode bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen genomischen Methoden, vor allem, dass es keine Kennzeichnung mit Thymidin-Analoga oder Immunopräzipitation DNA4,6.
Hier wird detailliert die Protokolle zum Profil genomweite DNA Replikation Timing bei hochauflösenden im Zebrafisch. Diese Protokolle wurden zur Beziehungen mit genomischen und epigenetische Features in das Zebrafish Genom, sowie die Profilierung Änderungen in diesen Beziehungen, die auftreten, während der Entwicklung zu bestimmen. Diese Protokolle sind auch leicht angepasst, um Veränderungen in Replikation Timing im mutierten Zebrafisch-Stämme und in Krankheitsmodellen zu studieren. Darüber hinaus bieten diese Methoden eine Stiftung, die Replikation Timing in bestimmten Zelltypen zu studieren, durch erste Aussortieren der einzelnen Zelltypen aus dem Zebrafisch erweitert werden kann. Der Zebrabärbling dient als eine ausgezeichnete in Vivo Modellsystem zu Replikation Timing zu studieren und letztlich die biologischen Funktionen von dieser wichtige epigenetische Eigenschaft offenbaren.
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Protocol
Alle Tiere wurden in strikter Übereinstimmung mit Protokollen, die durch die Oklahoma Medical Research Foundation institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt behandelt.
1. Einrichten von Erwachsenen Zebrafisch für die Zucht
- Eine große Kohorte von erwachsenen männlichen und weiblichen Zebrafisch eines einzigen Stammes zur Zucht zu verwenden. Es gibt kleine Unterschiede in der genetischen Zusammensetzung der Zebrafisch sogar eines einzelnen Stammes, eine große Kohorte zu verwenden, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse repräsentativ für die genetische Variabilität der Bevölkerung und nicht beschränkt auf einen kleinen Teil der Bevölkerung sind.
- Am Vorabend Embryonen gesammelt werden, Dutzende von Zucht Erwachsene in Zucht Panzer, verwenden Sie etwa gleicher Anzahl von Männchen und Weibchen zu. Je nach dem Experiment verwenden Sie eine der folgenden Zuchtstrategien.
- Zucht-Strategie 1: Legen Sie ein paar männliche und weibliche Zebrafisch in einzelnen Zucht Panzer, die Männchen von den Weibchen mit einem Raumteiler trennen. Wenn dieser Ansatz verwendet wird, viele verschiedene Zucht Panzer setup und bündeln die Embryonen aus jedem um sicherzustellen, dass die biologische Variabilität ist repräsentativ für die Bevölkerung.
- Zucht von Strategie 2: Dutzende von männlichen und weiblichen Zebrafisch in einem großen Zucht-Tank zu kombinieren. Diese Strategie verwenden, solange gibt es eine ausreichend große Anzahl von Embryonen, ist es vernünftig anzunehmen, sie kamen aus einer Vielzahl von Gründern und sind daher genetisch repräsentativ für die Bevölkerung.
(2) zeitlich Paarungen - Sammlung, Sortierung und Gehäuse Zebrafisch-Embryonen für Experimente
- Durchführen Sie zeitgesteuerte Paarungen beginnen, sobald das Licht Zyklen morgens. Entsorgen Sie alle Embryonen erzeugt über Nacht.
- Erlauben Sie Fische zu züchten in seichtem Wasser (3-5 cm) für einen Zeitraum von 10 min, mit doppeltem Boden für Embryonen durch zu entkommen.
- Nach 10 Minuten sammeln Sie Embryonen durch durch ein Sieb Gießen und in einem 10-cm-Platte mit einer Waschflasche spülen. Pool alle Embryonen zum gleichen Zeitpunkt gesammelt markieren sie mit der Sammlung und Stelle sofort in einem Inkubator bei 28,5 ° C.
- Hunderte von Embryonen können von einem einzigen Paarung Paar an einem Tag zu rechnen. Können Sie Erwachsene, in 10 min zu züchten Zyklen, bis die Anzahl der Embryonen gewonnen, die weniger als 20 ist.
- Ca. 1-1,5 h nach der Entnahme, Art Embryonen, Tote und unbefruchtete Embryonen zu entfernen. Zum Sortieren von Embryonen Inkubator entnehmen und unter dem sezierenden Mikroskop beobachten.
- Anzahl der Embryonen und Ort bei einer Dichte von 100 Embryonen pro 10 cm Platte.
- Frisches E3-Medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4) hinzufügen und Embryonen in den Inkubator 28,5 ° C zurück.
(3) Dechorionate, deyolk und Zebrafisch-Embryonen zu beheben
Hinweis: Dieser Abschnitt des Protokolls richtet sich an Embryonen vor 48 h Post Düngung (hpf). Besteht keine Notwendigkeit, die Chorions Embryonen in einem späteren Stadium der Entwicklung zu entfernen (nach 48 hpf), da sie oft natürlich abfallen. Es gibt keine Notwendigkeit, deyolk oder Entfernen des Chorions Fische älteren post 5 Tage Düngung (Dpf).
- Wenn Embryonen gewünschte Entwicklungsalter erreicht haben, überprüfen Sie entsprechenden Entwicklungsstand morphologisch unter einem Lichtmikroskop nach "Stadien der embryonalen Entwicklung der Zebrafisch"17.
- Übertragen Sie bis zu 1500 inszenierte Embryonen auf eine 15 mL konische Rohr und waschen Sie mehrmals mit E3.
- Fügen Sie 1 mL der E3 und 20 µL Pronase-Lösung (30 mg/mL) für jeden 100 Embryonen und Schwenken Sie sanft. Dechorionated in einer einzigen Röhre mit 15 mL E3 können bis zu 1500 Embryonen werden.
- Legen Sie Rohr auf die Seite und ordnen Sie Embryonen in einer gleichmäßigen Schicht auf maximale Oberfläche, Volumen-Verhältnis zu gewährleisten. Schütteln Sie sanft Rohr alle 2-3 Minuten bis alle Chorions gesunken Weg von der Embryonen. Die gesamten Dechorionation Zeit variiert je nach Pronase Aktivität.
- Entfernen Sie überstand und spülen Sie sanft Embryonen 3 Mal mit 10 mL der E3. Embryonen auf Eis für den Rest dieses Abschnitts des Protokolls zu platzieren.
- E3 zu entfernen und waschen Embryonen mit frisch zubereiteten eiskalte Deyolking Puffer (0,5 x Ginzburg Fisch Ringer-Lösung, ohne Calcium: 55 mM NaCl, 1,8 mM KCl, 1,25 mM Nahco33).
- Fügen Sie 1 mL eiskaltes Deyolking Puffer für bis zu 500 Embryonen.
- Mit einem P1000 sanft pipette Embryonen nach oben und unten 5 - 10 mal Eigelb Sack zu stören.
- Übertragen Sie 1 mL auf eine 1,5 mL Microfuge Rohr- und Zentrifuge bei 4 ° C und 500 X g für 5 min.
- Entfernen Sie überstand und waschen Pellet mit 1 mL eiskaltes 1 X PBS (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,0), Ringer Lösung zu entfernen. Zentrifuge bei 4 ° C und 500 X g für 5 Minuten.
- Sorgfältig entfernen Sie überstand und aufzuwirbeln Sie Zellen in 1 mL 1 X PBS. Legen Sie Rohr auf Eis.
- Eine 15 mL konische Rohr 3 mL eiskaltes Ethanol (EtOH) hinzufügen. Wirbelröhre von EtOH sanft auf Einstellung "niedrig".
- Verwenden sanft ein P1000, langsam (1 Tropfen pro Sekunde) Tropf Zebrafish Embryos Zellsuspension in EtOH beim aufschütteln.
- Fügen Sie eine Gesamtmenge von 1 mL der Embryo Zellsuspension für eine endgültige Fixierung-Lösung von 75 % EtOH.
- Nach 1 mL der Zelle wurde Aussetzung hinzugefügt, sanft Wirbel Rohr zu mischen und bei-20 ° C für mindestens 1 h. Es empfiehlt sich, legen Sie die Rohre auf ihrer Seite zu gewährleisten maximale Fläche zum Volumenverhältnis und reduzieren Sie die Anzahl der Embryonen und Zellen, die aneinander kleben. Speichern Sie embryonaler Stammzellen bei-20 ° C für ca. 2-3 Wochen.
(4) Färbung der DNA und FACS Sortierung Embryonen
Hinweis: Dieser Abschnitt des Protokolls richtet sich an Embryonen im 1 Dpf.
- EtOH-feste embryonaler Stammzellen von-20 ° C und Zentrifuge bei 4 ° C 1500 X g für 5 min zu entfernen.
- Legen Sie Rohr auf Eis und sorgfältig entfernen überstand. Mit einem P1000, sanft Aufschwemmen Sie Zellen in 1 mL frisch zubereiteten kalten PBS-BSA (1 X PBS, 1 % Rinderserumalbumin).
- Zentrifugieren Sie Zellen bei 4 ° C und 1500 X g für 5 min und auf Eis.
- Für jede 1000 Embryonen verwenden entfernen überstand und Aufschwemmen Zellen in Propidium Jodid (PI) Färbelösung (50 µg/mL PI, 100 µg/mL RNase A, PBS, pH 7,0), 200 µL.
- Können Sie Zellen in PI-Lösung für 30 min auf Eis, sanft mischen alle 5 min inkubieren.
- Legen Sie ein 40 µm Nylon Zelle Sieb auf eine 50 mL konische Rohr auf Eis. Pipette vorsichtig Zellen zu mischen und durch das Gitter zu filtern.
Hinweis: Wenn mehrere Röhren von Embryonen aus der gleichen Timepoint in Abschnitt 3 des Protokolls gesammelt wurden, kombinieren Sie diese Embryonen an dieser Stelle, dass sie alle zusammen sortiert werden. - Nutzung der Wohnung im inneren Ende ein Spritzenkolben, sanft stören Sie alle restlichen Klumpen von Zellen auf dem Netz.
- Spülen Sie Zellen durch den Filter mit 500 µL kaltem PBS-BSA für jede 1000 Embryonen.
- Platzieren Sie ein 40-µm-Netz über eine 15 mL konische Rohr auf Eis und Filtern Sie die Zellsuspension aus dem 50 mL konische Röhrchen ein zweites Mal in die 15-mL-Tube.
- Legen Sie mithilfe einer entsprechenden Zelle Sortieren Instrument die Laseranregung auf 561 nm und Emission Detection 610/20 Propidium Jodid zu erkennen.
- Mix 15-mL-Tube von gefärbten Zellen kurz durch aufschütteln und Platz im Instrument bei 4 ° C.
- Führen Sie Zellen bei einer langsamen Flow rate, idealerweise 1,0 mL/min, um eine saubere Zellzyklus-Profil zu erhalten und zu vermeiden, mischen G1 oder G2/M-Zellen mit dem S phase Bevölkerung.
- Erstes Tor für FSC-A X SSC-A (forward Scatter-Bereich durch Streuung Seitenbereich), Schmutz (Abbildung 1A).
Hinweis: Zellen aus Embryonen können Größen je nach Stadium und Zelle unterschiedlich. Die Graufilter (ND) kann zwischen 1.0 und 1.5 abhängig von der Größe der Zellen vorhanden gewechselt werden müssen. Tor, ein großes Gebiet zu sammeln die meisten Zellen und Schmutz zu entfernen. - Zweite, Tor für SSC-Bereich (SSC-A) von PI-Bereich (PI-A), um Schmutz und Zelle Dubletten (Abbildung 1 b) zu entfernen.
- Drittens: Tor für SSC-A von SSC-W (Breite), alle restlichen Zelle Dubletten (Abbildung 1) zu entfernen.
- Anzeigen der gated Populationen auf ein Histogramm mit Handynummer (Anzahl) auf der y-Achse und Propidium Jodid-Bereich (PI-A) auf der x-Achse. Dies sollte für 24 hpf Embryonen eine stereotype Zellzyklus-Profil wie in Abbildung 1geben.
- Um die Bevölkerung der Phase zu sortieren, setzen Sie das Tor von der rechten Seite des G1 Peak auf der linken Seite der G2 Spitze, darunter nur eine minimale Menge an der G1 und G2 Bevölkerung. Für 24 hpf Embryonen wird dies in der Regel ca. 10-15 % der gated Bevölkerung umfassen (siehe Abbildung 1).
- Um die G1-Bevölkerung zu sortieren, legen Sie das Tor auf der linken Seite der G1 Spitze, der Gipfel des Berges nicht übergeben. Passen Sie die Breite des G1 Tores so schmal wie möglich (siehe Abbildung 1).
- Tor der G1 und S Phase Bevölkerungen zu den richtigen ersten gating (Abbildung 1E) sorgen zurück.
- Sortieren Sie die G1 und S Phase Populationen in 15 mL konische Röhrchen mit 3 mL PBS-BSA. Das Ziel sollte sein, um zwischen 500.000 und 1 Million oder mehr sortierten Zellen pro angebrochene (G1 und S-Phase) zu erhalten.
- Nach Sortierung abgeschlossen ist, Röhren Zentrifuge bei 1500 x g und 4 ° C für 10 Minuten.
Hinweis: Das kleinzellige Pellet wird schwierig sein, zu sehen und es ist wichtig, nicht zu stören, dass es, so verwenden Sie am besten einen schwingende Eimer Rotor über einen festen Winkel-Rotor. - Sorgfältig entfernen Sie überstand und aufzuwirbeln Sie Pellet mit 1 mL 1 X PBS. Übertragen Sie Zellen auf einem 1,5 mL Microfuge Rohr- und Zentrifuge bei 6.000 x g und 4 ° C für 5 min.
- Sorgfältig entfernen Sie alle Flüssigkeit aus Rohr und frieren Sie trocken Pellet bei-20 ° C ein. Speichern Sie die Pellets bei-20 ° C für ca. 2-3 Wochen.
(5) DNA-Isolierung, RNase-Behandlung und DNA-Reinigung
- Entfernen Sie Zelle Pellet aus-20 ° C und auf Eis.
- Fügen Sie 400 µL SDS Puffers (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,5 % SDS), Pellets und erneut hinzu.
- Eine Endkonzentration von 0,2 mg/mL Proteinase K hinzu und durch Vortexen kurz mixen.
- Inkubieren Sie Proben bei 56 ° C für 2 h, Wirbel alle 15 min.
- Durchführen Sie nach 2 h Phenol-Chloroform Extraktion durch Hinzufügen von 400 µL Phenol-Chloroform (Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol 25:24:1, gesättigt mit 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA).
- Vortex für 20 s und Zentrifuge Probe bei 16.000 x g für 5 min, Phasen zu trennen.
- Entfernen Sie vorsichtig die obere wässrige Phase (400 µL) und Übertragung auf einen 1,5 mL-Tube.
- Durchführen Sie EtOH Niederschlag durch Hinzufügen von 40 µL 3M Natriumacetat (pH 5,2), 2 µL von Glykogen und 1 mL EtOH.
- Vortex mischen und bei-20 ° C über Nacht, DNA auszufällen. Probe kann auch bei-80 ° C oder auf Trockeneis für 1 h ausgefällt werden.
- Zentrifuge Probe bei 4 ° C und 16.000 x g für 30 min an der Pellet-DNA.
- Ablagestapel überstand und waschen Pellet mit 1 mL 70 % EtOH. Zentrifuge bei 4 ° C und 16.000 x g für 5 Minuten.
- Überstand und an der Luft trocknen Pellet bei Umgebungstemperatur für 2-3 min zu verwerfen.
- Lösen Sie Pellets in 96 µL autoklaviert Wasser auf, und fügen Sie 4 µL RNase A (2 mg/mL).
- Mischen Sie gut durch aufschütteln und Inkubation bei 37 ° C für 1 h.
- Durchführen Sie Phenol-Chloroform Extraktion durch Zugabe von 100 µL Phenol-Chloroform und folgt in Schritten 5.2.1 - 5.2.2.
- Durchführen Sie EtOH Niederschlag durch Hinzufügen von 10 µL 3M Natriumacetat, 1 µL Glykogen und 250 µL EtOH und nach dem Eingriff in Schritten 5.3.1 - 5.3.5.
- Aufschwemmen Sie Pellet in 60 µL TE-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA (pH8.0)) und bestimmen Sie DNA-Konzentration mit einer quantitativen Fluoreszenz basierende Methode zu. Shop DNA bei-20 ° C.
Hinweis: Es ist wichtig, DNA mit Hilfe von Fluoreszenz-basierte DNA-bindende Farbstoffe oder auf andere Weise zuverlässiger als UV-Spektrometer-basierte Methoden zu quantifizieren.
6. Vorbereitung der DNA-Bibliotheken und Sequenzierung der nächsten generation
Hinweis: Ein G1 Kopie Nummer Rückstellmuster für jede biologische Quelle ist erforderlich für jeden Lauf Sequenzierung (d.h. WT, mutierten, Transgene, Zell-Linie, etc.). Vergleichen Sie alle S-Phase-Proben aus der gleichen biologischen Quelle in der gleichen Sequenzierung ausgeführt, um die gleiche G1-Referenz. Führen Sie mindestens zwei biologische Wiederholungen jeder Probe zur Sicherstellung der Konsistenz zwischen Proben.
- Verdünnen Sie 1 µg DNA zu einem Endvolumen von 50 µL und Transfer zu einem spezialisierten Schlauch für Beschallung.
- Scheren Sie genomischen DNA für ein Ziel von 250-300 bp in einem fokussierten Ultrasonicator nach Hersteller Vorgaben und Protokoll.
- Qualität und Größe der geschert genomischer DNA, die eine automatisierte Elektrophorese maschinenbenutzung nach Vorgaben und Protokoll des Herstellers zu überprüfen. Stellen Sie sicher, es gibt eine große Spitze von ~ 250-300 bp für die sheared genomischer DNA.
- Bereiten Sie Sequenzierung Bibliotheken mit einer DNA-Bibliothek vorbereitungssatz mit Multiplex-Oligos für Sequenzierung auf Illumina-Plattform vor, laut Protokoll des Herstellers.
- Qualität der Bibliothek Prep automatisierte Elektrophorese-Automaten, laut Protokoll des Herstellers zu überprüfen. Stellen Sie sicher, es gibt eine große Spitze von ~ 400-450 bp, und es gibt minimale Spitzen für Grundierung Dimere (80-85 bp) und Adapter Dimere (~ 120 bp).
- Bibliotheken mit den DNA-Bibliothek Quantifizierung Kit für DNA-Sequenzierung der nächsten Generation, laut Protokoll des Herstellers zu quantifizieren.
- Verdünnte 15 µL der Bibliothek zu einer Konzentration von 5 nM und kombinieren gemultiplext Bibliotheken, wie erforderlich, um zu erzielen gewünscht eindeutig Zuordnung lesen zählt pro Probe.
Hinweis: Die Anzahl der eindeutigen Zuordnung Lesevorgänge pro Probe wird die Auflösung zu bestimmen. Verwendung so wenig wie 5 Millionen abgebildet liest Replikation Timing für das Zebrafish Genom zu beurteilen. Es wird empfohlen, die beginnen mit 10 Millionen mal gelesen. - Führen Sie gepaart-End 100 bp ganze DNA-Sequenzierung des Genoms von Proben auf ein next Generation Sequencing-Plattform gemäß Anweisungen des Herstellers.
7. Analyse der Sequenzierungsdaten
Hinweis: Die Anweisungen in diesem Abschnitt sollen als Richtlinie für die Analyse. Verwenden Sie zusätzliche Methoden zur Sequenzierung Ausrichtung, Filterung, Verarbeitung usw.. In diesem Abschnitt des Protokolls wird die bevorzugte Methode der Analyse in dieser Arbeit behandelt. Wenn zusätzliche Methoden verwendet werden, passen Sie die Parameter und Funktionen für diese Zwecke. Die folgenden Befehle werden in Ubutnu oder Mac terminal, mit die entsprechenden Pakete installiert eingetragen.
- Erhalten Sie die neuesten Versionen des Zebrafisch-Genoms (danRer10, ab wann dieses Protokoll geschrieben wurde) von UCSC Genom Browser mit den folgenden Befehlen:
Wget ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/danRer10/bigZips/danRer10.fa.gz-O danRer10.fa.gz- Dekomprimieren Sie die Datei fa.gz mit dem folgenden Befehl:
Gunzip danRer10.fa.gz - Richtet die Sequenzierungsdaten zum Genom mit BWA-Mem mit den folgenden Befehlen:
BWA Mem -t 8 danRer10.fa read_1.fastq read_2.fastq > output.sam
- Dekomprimieren Sie die Datei fa.gz mit dem folgenden Befehl:
- .Bam-Datei mit Samtools mit dem folgenden Befehl umwandeln Sie .sam Datei:
Samtools anzeigen -bS input.sam > output.bam- Sortieren Sie die ausgerichteten Sequenzierung Dateien mithilfe von Samtools mit dem folgenden Befehl:
Samtools sortieren output.bam > output_sorted.bam - Indizieren Sie die .bam-Datei mit Samtools mit den folgenden Befehl:
Samtools Index output.bam
- Sortieren Sie die ausgerichteten Sequenzierung Dateien mithilfe von Samtools mit dem folgenden Befehl:
- Mark PCR Duplikate mit Picard mit den folgenden Befehlen:
Java-Xmx2g-jar picard.jar MarkDuplicates \
Input=Input.BAM
Output=Output.BAM
REMOVE_DUPLICATES = False
METRICS_FILE=output_metrics.txt - Generieren Sie Textdateien (.txt) liest für jedes Chromosom mit dem folgenden Befehl:
für i in {1.25}; tun CHROM = "chr" $i; Echo $CHROM; Samtools anzeigen input.bam $CHROM | Schneiden -f 2,4,5,7,8,9 > ReadsChr$ {i} .txt; fertig
Hinweis: Die Spalten in der resultierenden .txt-Datei sind Flagge, Standort, MapQ, koppeln chr, paar Lage und Fragmentgröße, beziehungsweise. - Matlab (oder andere ähnliche Software) über die Textscan Funktion gelesen Sie txt-Dateien ein.
- Niedrige Abbildung Qualität liest durch Festlegen einer MapQ Schwellenwerts von 30 herausfiltern.
- Entfernen Sie liest mit Fahnen für nicht primäre Ausrichtung, PCR Duplikate oder paar-Mapping auf einem anderen Chromosom.
- Jeder liest mit ihren paar jenseits der Schwelle eine Entfernung von 2000 bp herausfiltern.
- Bewerten Sie Statistiken des daraus resultierenden lautet, Anzahl lesen Sie Statistiken, Abdeckung, Plattengröße und Qualität (Abbildung 2) zu bestimmen.
- Lesen Sie Berichte auf 100 bp behoben Windows für jede Probe durch zählen der Anzahl der Lesevorgänge in 100 bp Intervallen über die Länge jedes Chromosoms zu bestimmen.
- Berechnen Sie der Median Anzahl für alle Fenster zu lesen.
- Regionen der hohen Abdeckung durch Entfernen von Windows, die größer als 5 Standardabweichungen vom Medianwert herausfiltern.
- Regionen für die Analyse in der G1-Referenzproben zu definieren, mit 200 liest mit Schiebefenster Segmente entlang jedes Chromosom zu finden.
- Bestimmen Sie lesen Sie Tiefe in jeder S-Phase-Probe durch zählen der Anzahl der S-Phase-Lesevorgänge im Fenster 200 lesende Graf für die begleitenden G1 Referenz definiert.
- Glätten Sie die raw-Daten über die Csaps-Funktion in die Software mit einem Interpolationsfaktor (p) von 10-16.
- Geglättete Daten zu Z-Score mit einem Mittelwert von 0 und Standardabweichung von 1 zu normalisieren.
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Representative Results
Verwendung von veröffentlichten Replikation Zeiterfassungsdaten, repräsentative Replikation Timing Profile und Qualitätssicherungsmaßnahmen15angeboten. Die ersten Schritte der Verarbeitung beinhalten Ausrichten der Sequenzierungsdaten, das Genom, Berechnung lesen Sie Länge und Genom Abdeckung Statistiken und geringe Filterqualität ungepaarte, und PCR-doppelte liest. Lesen Sie Statistiken für eine typische Zebrafisch Sequenzierung Probe werden in Abbildung 2gezeigt. Nach dem Filtern, sind Lesen Sie zählt in variabler Größe Windows und die Daten bestimmt sind geglättet und normalisiert. Typische geglättet/normalisiert Replikation Timing Profile eines repräsentativen Zebrafisch-Chromosoms für biologische Replikate sind in Abbildung 3Adargestellt. Die Profile für biologische und experimentelle Wiederholungen sollten optisch sehr ähnlich (siehe Abbildung 3A) und auch hohe Korrelation entlang der Länge des Chromosoms (Abb. 3 b) anzeigen. Sie sollten auch hohe Korrelation zwischen Taktwerte genomweite (Abbildung 3) angezeigt. Autokorrelation, eine Methode, um Muster Kontinuität zu beurteilen sollte verwendet werden, um den Grad der Struktur in den Daten (Abbildung 3D) zu bewerten. Die Autokorrelation für strukturierte Reife Timing Programme sollten hoch auf kurze Distanzen und verringern Sie allmählich zunehmender Entfernung. Beispiele, die zeigen, hohen Reproduzierbarkeit zwischen biologischen und experimentelle repliziert und einer starken Autokorrelation Signal gilt als qualitativ hochwertige Proben und kann kombiniert werden, um eine höhere Abdeckung Probe zu erhalten.
Abbildung 1: Sortieren von Zebrafisch-Embryonen für Replikation Timing-Analyse. (A) Gated Bevölkerung aller Zellen für forward Scatter Bereich sortiert (FSC-A) durch Streuung Seitenbereich (SSC-A). Die Farben zeigen die Dichte der Lagerplätze in der Dot-Plot mit hoch-zu-niedrige Dichte vertreten durch Farben von rot, grün oder blau. (B) Gated Bevölkerung der FSC X SSC geschlossene Zellen sortiert für SSC-A durch Propidium Jodid Fläche (PI-A). (C) Gated Bevölkerung des SSC x PI gated Zellen sortiert für SSC-A von Side Scatter Breite (SSC-W). (D) Histogramm der alle geschlossenen Populationen eine stereotype Zellzyklus Profil anzeigen. Art-Tore boxed für Zellen in G1 und S-Phase durch das grau schattiert angezeigt werden mit schwarzen Linien. (E) Backgated G1 und S Phase Populationen zeigen, dass den Großteil der Zellen der ersten Anspritzung erfasst werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Sequenzierung Statistiken für eine typische Zebrafisch-Probe lesen. (A) Reap mapping-Qualität aus der Statistik der MapQ-Werte. (B) Histogramm der Verteilung der einfügen-Größen für alle Sequenzierung liest. (C) lesen Sie Statistiken für insgesamt zugeordneten liest, liest mit niedriger Qualität Flagge, liest mit Paaren, die Zuordnung zu einem anderen Chromosom (Paar Diff chr), liest mit paar jenseits Entfernung Threshold (Ferne Paar) und PCR Duplikate. (D) repräsentative Anzahl von insgesamt zugeordnet, nicht zugeordnete und ungepaarten liest, Abdeckung, und Auflösung für eine typische Abfolge Ausführen einer Zebrafisch-Probe zu lesen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Vertreter Zebrafish replikationsergebnisse Timing und Qualitätssicherungsmaßnahmen. (A) Replikation timing entlang der Länge eines Vertreters Chromosom für zwei biologische Wiederholungen von 28 hpf Embryonen (Siefert, 2017). (B) Korrelation zwischen Replikation Timing Werte unter 2 Mb Windows entlang der Länge eines repräsentativen Chromosoms für die biologischen repliziert 28 hpf-Embryonen gezeigt in der Abbildung 3A. (C) genomweite Korrelation zwischen Replikation Taktwerte für biologische (rep1 und rep2) und experimentellen (rep3) Wiederholungen von 28 hpf-Embryonen. Die Farbkarte stellt Pearsons Korrelationskoeffizient. (D) Autokorrelation für eine strukturierte Reife Zeitprogramm zeigt hohen Autokorrelation im Nahbereich, die allmählich immer größere Entfernungen abnimmt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Zebrafisch bieten ein neues und einzigartiges in Vivo Modell, DNA-Replikation Timing zu studieren. Wenn zeitliche Verpaarungen erfolgen als detailliert in diesem experimentellen Protokoll, Tausende von Embryonen können gesammelt werden, an einem einzigen Tag für Experimente. Diese Embryonen entwickeln sich synchron durch präzise getimten und deutlich zeichnet sich Phasen der Entwicklung. Zebrafisch kann leicht und präzise durch Morphologie mit einem Stereomikroskop wie Zebrafisch-Embryonen entwickeln sich nach außen und sind optisch klar inszeniert werden. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Zebrafisch-Embryonen Replikation Timing während der vertebrate Entwicklung zu studieren.
Das Protokoll, das Probleme darstellen können umfassen eine synchrone Entwicklung der Zebrafisch-Embryonen, Verlust von Zellen während der Vorbereitung, FACS sortieren und Bibliothek Vorbereitung. Das Timing der Zebrafisch Entwicklung ist temperaturabhängig, daher Einsatz Zebrafisch, hell/dunkel-Zyklen angepasst und bei 28,5 ° C für Experimente untergebracht. Um synchrone Entwicklung, präzise getimte Verpaarungen durchführen, und sammeln Sie Embryonen in sehr kleinen Zeitfenstern (10 min oder weniger). Es ist entscheidend für die Embryonen bei 28,5 ° C zu erhalten und sicherzustellen, dass sie minimale Zeit bei Umgebungstemperatur. Das Timing der Zebrafisch-Entwicklung ist auch stark abhängig von der Dichte der Embryonen in einem bestimmten Gebiet. Ist es wichtig, nicht Haus Embryonen bei einer höheren Dichte als 100 Embryonen pro 10 cm Platte, oder sie werden nicht richtig entwickeln. Der optimale Zeitpunkt für tot und unbefruchteten Embryonen zu entfernen ist, wenn sie Fortschritte, die 4-16-Zell-Stadium gemacht haben und leicht als befruchtete (Nutzung "Stadien der embryonalen Entwicklung der Zebrafisch"17 als Leitfaden) identifiziert werden können. Toten Embryonen in der Regel erscheinen als schwarze Kugeln und unbefruchtete Embryonen als 1-Zelle angezeigt. Arbeiten Sie so schnell wie möglich die Zeit bei Umgebungstemperatur zu reduzieren.
Wann Dechorionating Embryonen, ist es wichtig sicherzustellen, dass alle Chorions aus Embryonen entfernt werden. Halten Sie Embryonen in Pronase Lösung, bis die meisten Chorions gekommen sind, aus. Alle restlichen Embryonen mit Chorions intakt zu verwerfen oder ihre Chorions mit Zange entfernen. Pipette Embryonen mit einer langsamen und glatte Bewegung. Pipette nicht schnell, wie es die Zellen zu unnötigen Stress und führen zu Verlust von Zellen zu unterwerfen. Es ist auch wichtig, nicht zu einem P200 zu verwenden, da dies erhöhte Schubspannung führen kann, der Bruch der Zellen führt. Umgekehrt haben ein Kunststoff transferpipette nicht genug eine kleine Bohrung oder bieten genügend Schubspannung um ausreichend stören der Eigelb-Plünderung und disaggregieren der Zellen. Alternative Pipetten genutzt werden, sofern die Bohrung und Scherung wäre gleichbedeutend mit der optimalen P1000.
Bei der Sortierung 28 FACS hpf, wenn eine stereotype Zelle Zyklus Profil nicht erhalten wird, ist die Spannung auf der PI-Laser so einstellen, dass die G1 Spitze rund 50 K zentriert ist. Die Gewinne für die FSC und SSC müssen auch angepasst werden, so dass die Anspritzung und Zelle Bevölkerungen ähnlich Abbildung 1angezeigt. Wenn es noch Schwierigkeiten immer, der ND-Filter geschaltet werden soll, und die FSC und SSC Spannungen so angepasst, dass um den Großteil der Zellen zu gewährleisten sind in das Tor. Es sollte offensichtlich sei PI Färbung, so werden ein Sortiment, das Doppel für die PI-A. nähert sich sein Das Histogramm sollte zwei klare Höhen, ein großer Peak bei 2N DNA für die G1-Zellen und einen kleineren Gipfel im Doppel die Intensität für die 4N DNA Inhalte der G2/M-Zellen angezeigt werden. Wenn dies noch nicht erreicht ist es möglicherweise entweder niedrige Zahl von intakten Zellen, Probleme mit dem PI Beflecken oder Probleme mit Fixierung und das Protokoll müssen entsprechend zu optimieren.
Zellen aus frühen Embryo (vor 10 hpf) nicht typische Zellzyklus Profile zu geben, da ein hoher Prozentsatz dieser Zellen sind in der S-Phase. Diese Beispiele können als S Phase Proben behandelt, und im Vergleich zu einer G1-Referenz von 24 hpf-Embryonen. Embryonen zwischen 10 hpf und 24 hpf kann zwischen Zellzyklus Profile geben und können sortiert werden, falls gewünscht. Die S-Phase Bevölkerung kann auch identifiziert und sortiert in kurzen Pulsen vor der Fixierung durch den Einbau von Thymidin-Analoga wie EDU (5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine) oder BrdU (Bromodeoxyuridine), dies ist jedoch nicht notwendig für die korrekte Ermittlung der Replikation Timing.
Im Idealfall sollte die Bibliothek Vorbereitung mit 1 µg DNA begonnen werden. Theoretisch würde ~ 300.000 sortierte Zellen liefern ca. 1 µg DNA (Schätzung ~3.3 Pg/Kern), jedoch gibt es immer Verlust im gesamten Protokoll. 500.000 bis 1 Million sortierte Zellen sollte mehr als 1 µg DNA geben. Eine typische 24 hpf Embryo haben etwa 18.000 Zellen, von denen 10-15 % in der S-Phase werden. Embryonen in früheren Stadien der Entwicklung werden erheblich weniger Zellen, aber höhere Prozentsätze von Zellen in der S-Phase müssen.
Durchführung von präzise Reinigung und Größenauswahl mit magnetischen Beads ist zur Beseitigung unerwünschter Elemente aus der Bibliothek Vorbereitung entscheidend. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers sorgfältig und weitere Optimierung erforderlich sein. Eine kleine Menge des PCR-Dimere ist in der Regel kein großes Problem, aber Adapter Dimere werden sehr effizient Sequenz, so dass sie unterschätzt werden sollte. Dies kann erreicht werden durch Anpassung des erste Adapters DNA-Verhältnis, und genaue Größenauswahl bei Bibliothek Vorbereitung durchführen.
Einend-Sequenzierung kann auch für verschiedene experimentelle Bedürfnisse geeignet sein. Einend-ist billiger und bietet die meisten erforderlichen Informationen, da dieser Ansatz stützt sich auf zählen liest; gepaart-End bietet eine höhere Fähigkeit, PCR und optische Duplikate entfernen und Bereiche der repetitiven Sequenzen und andere strukturelle Veränderungen (die häufig in den Zebrafish Genom) beizulegen. Bereich Analyse beschäftigen sich nur mit gepaart-End Sequenzierung mal gelesen. Kürzere Sequenzierung Lesevorgänge können auch geeignet sein. Dieses versieht eine höhere Anzahl von Lesevorgängen zu einem niedrigeren Preis, aber das liest möglicherweise schwieriger zuordnen. Bereich Analyse ist für 100 bp Lesevorgänge optimiert, und Anpassungen können erforderlich sein, wenn lesen Sie kürzer verwendet wird.
Dieses Protokoll kann auch problemlos für Weitere Verwendungen von Zebrafisch-Modell angepasst werden. Es wurde bereits verwendet für Analyse der Zebrafisch Heckflosse Fibroblasten (ZTF Zellen), eine Primärzelle Kultur Linie von Erwachsenen Zebrafisch Heckflosse isoliert. Um isolierte Zelltypen von Zebrafisch zu studieren, können transgene Marker zu identifizieren und zu isolieren einzelner Zelltypen vor Fleckenbildung und Sortierung für DNA-Gehalt verwendet werden. Eine mögliche Strategie wäre eine transgene Linie mit dem Ausdruck eines fluoreszierenden Markers, angetrieben von einem gewebespezifischen Promoter und erste verwenden Zellen durch FACS sortieren, gefolgt von Fixierung und Sortierung für DNA-Gehalt isoliert. Darüber hinaus kann die Verwendung der Zelle durchlässig DNA-Farbstoffe für simultane Isolation der einzelnen Zelltypen sowie G1 und S Phase Populationen ermöglichen. Diese Anpassungen zu diesem Protokoll könnte auch Replikation Timing Studien in anderen in-Vivo -Modelle.
Eine spannende Möglichkeit für die künftige Nutzung dieses Protokolls ist, die Rolle der Replikation Timing bei der Krankheit zu studieren. Es gibt verschiedene Modelle der Krebs im Zebrafisch, einige spontane und andere induzierbaren, die verwendet werden können, um festzustellen, wenn Replikation Timing während Onkogenese Farbveränderungen. Dies ermöglicht, Bewertung der Rolle Replikation Zeitmessung spielt bei Tumorgenese und Krankheit Fortschreiten. Darüber hinaus Zebrafisch sind ein hervorragendes Modell für Wirkstoff-Screening und kann verwendet werden, um Medikamente, die Replikation Timing Verordnung beeinflussen zu identifizieren, die das Potenzial für den Einsatz in der Krebstherapie haben.
Der Zebrabärbling ist eine vielversprechende neue Modell zur Replikation Timing. Dieses Protokoll wird u.a. die Möglichkeit, dieses Modell bei der Untersuchung der Rolle der Replikation Zeitmessung in Entwicklung und Krankheit nutzen leisten. Dieses Protokoll kann für die Verwendung mit anderen in-Vivo Entwicklungsstörungen Modellsysteme, wie Drosophila Melanogaster Xenopus Laevisund freuen uns auf zukünftige Ergebnisse Blick aus diesen und anderen Organismen angepasst werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt vom National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health durch gewährt, 5P20GM103636-02 (einschließlich Flow Cytometry-Core-Support) und 1R01GM121703, sowie Auszeichnungen aus dem Oklahoma-Center für die adulten Stammzellen Forschung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 | EMD Millipore | MMX00701 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | protease solution |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D1408 | |
| Ethanol (EtOH) | KOPTEC | V1016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647-100G | |
| Propidium Iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| EDTA | Sigma | E9844 | |
| SDS | Santa Cruz | sc-24950 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:Chloroform | Sigma | P3803-100ML | |
| Sodium acetate | J.T.Baker | 3470 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| RNase A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| Quanit-iT | Invitrogen | Q33130 | Reagents for fluorescence-based DNA quantification |
| Covaris AFA microTUBE | Covaris | 520045 | specialized tube for sonication |
| Covaris E220 Sonicator | Covaris | E220 | focused ultrasonicator |
| Agilent 4200 Tapestation | Agilent | G2991AA | automated electrophoresis machine |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | Reagents for automated electrophoresis machine |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | Cat#E7370L | DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1) | NEB | Cat#E7335S | multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2) | NEB | Cat#E7500S | additional multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Library Quant Kit for Illumina | NEB | E7630L | quantification kit for library preparation |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | magnetic beads |
| Illumina HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | next generation DNA sequencing platform |
| 40 µm Falcon Nylon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm | VWR | 89107-632 | |
| 6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100 | VWR | 89078-446 | |
| Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color | Denville Scientific | C2170 (1001002) | Dnase/Rnase free |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash Bottles | VWR | 16650-022 | Low-Density Polyethylene, Wide Mouth |
| Strainer | VWR | 470092-440 | 6.9 cm, fine mesh |
| Corssing tank | Aquaneering | ZHCT100 | individual breeding tank |
| iSpawn | Techniplast | N/A | large breeding tank |
| FACSAria II | BD biosciences | N/A | cell sorting machine |
| Wild M5a steromicroscope | Wild Heerbrugg | N/A | dissecting microscope |
| Qubit 3 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration |
| Matlab | Mathworks | version 2017a | |
| Matlab Statistics Toolbox | Mathworks | version 11.1 | |
| Matlab Curve Fitting Toolbox | Mathworks | version 3.5.5 |
References
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