Het doel van het protocol is het bouwen van een inflammatoire menselijke tandvlees model in vitro. Dit weefsel model cultiveert samen drie soorten menselijke cellen, HaCaT keratinocyten, gingival fibroblasten en THP-1 macrofagen, driedimensionale omstandigheden. Dit model kan worden toegepast op het onderzoek naar parodontale ziekten, zoals gingivitis en Parodontitis.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Driedimensionale inflammatoire menselijk weefsel equivalenten van tandvlees
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Parodontale ziekten (zoals gingivitis en parodontitis) zijn de belangrijkste oorzaken van tandverlies bij volwassenen. Ontsteking in tandvlees is de fundamentele fysiopathologie van parodontale ziekten. Huidige experimentele modellen van parodontale ziekten zijn vastgesteld in verschillende soorten dieren. Echter verschilt de fysiopathologie van diermodellen van die van de mens, waardoor het moeilijk is om te analyseren van cellulaire en moleculaire mechanismen en evalueren van nieuwe geneesmiddelen voor parodontale ziekten. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de wederopbouw van menselijk weefsel van de inflammatoire equivalenten van tandvlees (iGTE) in vitro. Wij bouwen eerst menselijk weefsel equivalenten van tandvlees (GTE) door gebruik te maken van twee soorten menselijke cellen, met inbegrip van menselijke gingival fibroblasten (HGF) en menselijke huid epidermale keratinocyten (HaCaT), drie-dimensionale omstandigheden. We maken een wond-model met behulp van een weefsel perforatie om punch een gat in de GTE. Volgende, menselijke THP-1 monocyten gemengd met collageen gel worden ingespoten in het gat in de GTE. Door adimistration van 10 ng/mL phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) voor 72 uur, THP-1 cellen onderscheiden in macrofagen naar formulier inflammatoire foci in GTE (iGTE) (IGTE kunnen ook stumilated met 2 µg/mL lipopolysacchariden (LPS) voor 48 h tot ontsteking ). IGTE is de eerste in vitro model van inflammatoire tandvlees met behulp van menselijke cellen met een driedimensionale architectuur. IGTE weerspiegelt belangrijke pathologische veranderingen (immunocytes werkzaamheden, intracellulaire interacties tussen fibryoblasts, epitheliaale cellen, monocyten en macrofagen) in parodontale ziekten. GTE, gewonde GTE en iGTE kunnen worden gebruikt als veelzijdige tools om te studeren wondgenezing, weefselregeneratie, ontsteking, cel-cel interactie en scherm potentiële geneesmiddelen voor parodontale ziekten.
Inleiding
Parodontale ziekten zijn de belangrijkste oorzaak van tandverlies bij volwassenen. Gingivitis en Parodontitis zijn de meest voorkomende parodontale ziekten. Beide aanwezig biofilm-gemedieerde acute of chronische ontstekingsreactie in het tandvlees. Gingivitis wordt gekenmerkt door een acute ontsteking, overwegende dat parodontitis meestal als chronische ontsteking presenteert. Op het niveau van de histologische activeren bacteriële onderdelen de activering van immune cellen, zoals macrofagen, lymfocyten en plasmacellen mestcellen1,2. Deze immune cellen, met name in macrofagen, interactie met lokale cellen (inc....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit protocol is ontworpen om menselijke gingival weefsel equivalenten, modellen gingival wond en gingivitis modellen maken. Menselijke huid epidermale keratinocyten (HaCaT) werden vriendelijk geleverd door Professor Norbert E. Fusenig van Deutsches Krebsforschungszentrum (Heidelberg, Duitsland)7. Menselijke gingival fibroblasten (HGFs) werden geïsoleerd uit gingival weefsels volgens de eerder gepubliceerde protocollen8. Geïnformeerde toestemming vooraf was verkregen, en de studie goedgekeurd volgens de richtsnoeren van de Commissie voor ethiek, de Nippon tandheelkundige University School leven tandheelkunde in Tokyo (Aut....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
HaCaT cellen weergegeven typische Keratinocyt morfologie onder fase contrast microscopische observatie (figuur 2A). Scanner elektronen microscopische (SEM) beelden bleek dat de HaCaT cel oppervlakken werden gedekt door veel microvilli. Intercellulaire verbindingen tussen HaCaT cellen werden bemiddeld door membraanscheidingsprocessen (figuur 2B). HaCaT cellen uitgedrukt gingival epitheel marker K8/18/EG14, .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol is gebaseerd op de methoden van het creëren van gingival weefsel equivalenten en onderhuids vetweefsel equivalenten beschreven door vorige verslagen8,-21,22. Hoewel dit een eenvoudige en gemakkelijke methode is, vereist enkele stappen speciale aandacht. Het mengsel van collageen moet bijvoorbeeld op ijs worden bewaard tot gebruik om te voorkomen dat de formatie van de gel in de oplossing. Bij het toevoegen van het m.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Japan Society voor de promotie van wetenschap (JSPS) Grant-in-Aid voor wetenschappelijkonderzoek (26861689 en 17 K 11813). De auteurs bedank Mr. Nathaniel Green voor proeflezen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Collagen type I-A | Nitta Gelatin Inc | Voor het maken van dermis van GTE | |
| MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 11900073 | Celcultuurmedium |
| Cell Culture Insert (voor 24-well plaat), poriegrootte 3,0 μm | Corning, Inc. | 353096 | Voor weefselcultuur |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Celcultuurreagens |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31600034 | Celcultuurmedium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Celcultuurreagens |
| Weefselpons | Shibata system service co., LTD | SP-703 | Voor het ponsen van gaten in GTE |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 31800022 | Celcultuurmedium |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | Voor immunokleuring |
| Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain) | Thermo Fisher Scientific | R37605 | Voor het labelen van kernen |
| Fluorescentie montagemedium | Dako | Voor het monteren van monsters na immunokleuring | |
| Anti-Cytokeratin 8+18 antilichaam [5D3] | abcam | ab17139 | Voor het identificeren van epitheel |
| Scanende elektronenmicroscoop | Hitachi, Ltd. | HITACHI S-4000 | Voor het observeren van de oppervlaktetopografie en samenstelling van monsters |
| Confocale laserscanningmicroscopie | LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd. | LSM 700 | Voor het observeren van de immunofluorescentiekleuring van monsters |
| Anti-Cytokeratin 19 antilichaam | abcam | ab52625 | Voor het identificeren van epitheel |
| Anti-vimentin antilichaam | abcam | ab92547 | Voor het identificeren van fibroblasten en geactiveerde macrofagen |
| Anti-TE-7 antilichaam | Millipore | CBL271 | Voor het identificeren van fibroblasten in de dermis |
| Anti-CD68 antilichaam | Sigma-Aldrich | SAB2700244 | Voor het identificeren van macrofagen |
| Human CD14 Antilichaam | R&D Systems | MAB3832-SP | Voor het identificeren van macrofagen |
| Alexa Fluor 594-geconjugeerd secundair geitenanti-konijn antilichaam | Thermo Fisher Scientific | A11012 | Voor immunofluorescentiekleuring |
| Alexa Fluor 488-geconjugeerd secundair geitenanti-muis antilichaam | Thermo Fisher Scientific | A11001 | Voor immunofluorescentiekleuring |
| EVOS FL Celbeeldvormingssysteem | Thermo Fisher Scientific | Voor het observeren van de immunofluorescentiekleuring van het monster | |
| THP-1 cellen | Riken BRC cellbank | RCB1189 | Voor het maken van iGTE |
| PMA(Phorbol 12-myristaat 13-acetaat) | Sigma-Aldrich | P8139 | Voor het differentiëren van THP-1 cellen |
Referenties
- Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease. Periodontology 2000. 64 (1), 57-80 (2014).
- Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. Oral Inflammatory Diseases a....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
