Dimensions des tissus inflammatoires humaines équivalents de la gencive

Résumé

L’objectif du protocole est de construire un modèle d’inflammatoire gencive humaine in vitro. Ce modèle de tissu co cultive trois types de cellules humaines, HaCaT kératinocytes, fibroblastes gingivaux et macrophages THP-1, dans des conditions en trois dimensions. Ce modèle peut être appliqué à une enquête sur les maladies parodontales, telles que la gingivite et la parodontite.

Résumé

Les maladies parodontales (telles que la gingivite et la parodontite) sont les principales causes de la perte des dents chez les adultes. Inflammation de la gencive est la fondamentale physiopathologie des maladies parodontales. Les modèles expérimentaux actuels des maladies parodontales ont été créés dans différents types d’animaux. Toutefois, la physiopathologie des modèles animaux est différente de celle des humains, il est difficile d’analyser les mécanismes cellulaires et moléculaires et d’évaluer les nouveaux médicaments pour les maladies parodontales. Nous présentons ici un protocole détaillé pour reconstruire les équivalents humains inflammatoires des tissus de la gencive (iGTE) in vitro. Nous avons tout d’abord créer des équivalents de tissus humains de la gencive (GTE) en utilisant deux types de cellules humaines, y compris les fibroblastes gingivaux humains (HGF) et les kératinocytes épidermiques de la peau humaine (HaCaT), dans des conditions en trois dimensions. Nous créons un modèle de la plaie à l’aide d’un perforateur de tissu pour percer un trou dans le GTE. Ensuite, humaines monocytes THP-1 mélangés avec du gel de collagène sont injectées dans le trou dans le GTE. Par adimistration de 10 ng/mL phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) pendant 72 h, THP-1 cellules se différencient en macrophages aux foyers inflammatoires de la forme en GTE (iGTE) (IGTE peut également être stumilated avec 2 µg/mL de lipopolysaccharides (LPS) pendant 48 h initier l’inflammation ). IGTE est le premier modèle in vitro de la gencive inflammatoire utilisant des cellules humaines avec une architecture en trois dimensions. IGTE reflète des changements pathologiques principaux (immunocytes activition, interactions intracellulaires chez les fibryoblasts, les cellules épithéliales, les monocytes et les macrophages) dans les maladies parodontales. GTE, GTE blessé et iGTE utilisable comme outils polyvalents pour étudier la cicatrisation, régénération des tissus, l’inflammation, interaction cellule-cellule et médicaments potentiels écran des maladies parodontales.

Introduction

Les maladies parodontales sont la principale cause de la perte des dents chez les adultes. La gingivite et la parodontite est des maladies parodontales les plus courantes. Les deux induite par le biofilm aiguës ou chroniques inflammatoires changements actuels dans la gencive. La gingivite est caractérisée par une inflammation aiguë, tandis que la parodontite se présente généralement comme une inflammation chronique. Sur le plan histologique, les composantes bactériennes déclenchent l’activation des cellules immunitaires, tels que les macrophages, lymphocytes, plasmocytes et mastocytes^1,2. Ces cellules immunita....

Protocole

Ce protocole est conçu pour créer des tissus gingivaux humains équivalents, blessure gingivale modèles et modèles de gingivite. Kératinocytes épidermiques de la peau humaine (HaCaT) ont été gracieusement fournis du professeur Norbert E. Fusenig de Deutsches Krebsforschungszentrum (Heidelberg, Allemagne)⁷. Les fibroblastes gingivaux humains (HGFs) ont été isolés des tissus gingivaux selon les protocoles publiés précédemment⁸. Le consentement éclairé a été obtenu au préalable et l’étude a été approuvée selon les lignes directrices établies par le Comité d’éthique, l’Université dentaire Nippon School of Life Dentistry à Tok....

Résultats

Cellules HaCaT affichent la morphologie typique de kératinocytes sous observation au microscope à contraste de phase (Figure 2 a). Images de scanner électronique microscopiques (SEM) ont montré que les surfaces de cellules HaCaT étaient couverts de nombreuses microvillosités. Liens intercellulaires entre les cellules HaCaT ont été véhiculées par des procédés à membranes (Figure 2 b). HaCaT cellules expriment l’épithélium gingival.......

Discussion

Ce protocole est basé sur les méthodes de création d’équivalents de tissu gingival et les équivalents de-le tissu adipeux sous-cutané décrits par les précédents rapports^8,21,22. Bien qu’il s’agit d’une méthode simple et facile, certaines étapes nécessitent une attention particulière. Par exemple, le mélange collagène doit être maintenu sur la glace jusqu'à l’utilisation afin d’éviter la formation de gel dans la solution. Lorsque.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Collagène de type I-A	Nitta Gelatin Inc		Pour la fabrication du derme de GTE
MEM-alpha	Thermo Fisher Scientific	11900073	Milieu de culture cellulaire
Insert de culture cellulaire (pour plaque de 24 puits), taille des pores 3,0 &mu ; m	Corning, Inc.	353096	Pour la culture tissulaire
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061	Réactif de culture cellulaire
DMEM	Thermo Fisher Scientific	31600034	Milieu de culture cellulaire
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828028	Réactif de culture cellulaire
Perforateur de tissus	Shibata system service co., LTD	SP-703	Pour perforation de trous dans GTE
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	31800022	Milieu de culture cellulaire
BSA	Sigma-Aldrich	A3294	Pour l’immunomarquage
Hoechst 33342 (coloration NucBlue Live Cell)	Thermo Fisher Scientific	R37605	Pour le marquage des noyaux
Milieu de montage par fluorescence	Dako		Pour le montage d’échantillons après immunomarquage
Anticorps anti-cytokératine 8+18 [5D3]	abcam	ab17139	Pour l’identification de l’épithélium
Microscope électronique à balayage	Hitachi, Ltd.	HITACHI S-4000	Pour l’observation de la surface, de la topographie et de la composition des échantillons
Microscopie confocale à balayage laser	LSM 700 ; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd.	LSM 700	Pour l’observation de la coloration par immunofluorescence des échantillons
Anticorps anti-cytokératine 19	abcam	ab52625	Pour l’identification de l’épithélium
Anticorps anti-vimentine	abcam	ab92547	Pour l’identification des fibroblastes et des macrophages activés
Anticorps anti-TE-7	Millipore	CBL271	Pour l’identification des fibroblastes dans le derme
Anti-CD68 anticorps	Sigma-Aldrich	SAB2700244	Pour l’identification des macrophages
Anticorps CD14 humains	R& D Systems	MAB3832-SP	Pour l’identification des macrophages
Anticorps anti-lapin secondaire conjugué Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A11012	Pour la coloration par immunofluorescence
Anticorps anti-souris secondaire conjugué Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A11001	Pour la coloration par immunofluorescence
Système d’imagerie cellulaire EVOS FL	Thermo Fisher Scientific		Pour l’observation de la coloration par immunofluorescence de l’échantillon des
cellules THP-1	Banque de cellules BRC Riken	RCB1189	Pour la fabrication de l’iGTE
PMA (Phorbol 12-myristate 13-acétate)	Sigma-Aldrich	P8139	Pour différencier les cellules THP-1