המטרה של הפרוטוקול היא לבנות מודל של דלקת חניכיים אנושי בתוך חוץ גופית. מודל זה רקמות מטפחת שיתוף שלושה סוגים של תאים אנושיים, HaCaT keratinocytes, fibroblasts חניכיים ו מקרופאגים THP-1, בתנאים תלת מימדי. מודל זה ניתן להחיל כדי לחקור מחלות חניכיים, כגון דלקת חניכיים, חניכיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תלת מימדי רקמה אנושית דלקתיות במקבילות של חניכיים
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחלות חניכיים (כגון דלקת חניכיים חניכיים) הם הגורמים המובילים ואובדן שיניים אצל מבוגרים. דלקת חניכיים היא physiopathology היסוד של מחלות חניכיים. הנוכחי ניסיוניות של מחלות חניכיים הוקמו בסוגים שונים של בעלי חיים. עם זאת, physiopathology של מודלים בעלי חיים שונה של בני האדם, ולכן קשה לנתח מנגנונים תאית ומולקולרית ולהעריך תרופות חדשות למחלות חניכיים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לשחזור רקמה דלקתית אנושית במקבילות של חניכיים (iGTE) במבחנה. ראשית, אנו בונים רקמה אנושית במקבילות של חניכיים (GTE) על ידי ניצול שני סוגים של תאים אנושיים, כולל האדם חניכיים fibroblasts (דבורה שחר) העור האנושי keratinocytes עוריות (HaCaT), בתנאים תלת מימדי. אנו יוצרים מודל הפצע באמצעות כבטלן רקמות לחורר ב GTE. ומונוציטים THP-1 הבא, אנושי מעורבב עם ג'ל קולגן מוזרקים לתוך החור GTE. על ידי adimistration של 10 ננוגרם למ"ל phorbol פעילים-12 13-אצטט (PMA) עבור 72 h, הבדיל THP-1 תאים לתוך מקרופאגים אל טופס מוקדים דלקתיים ב GTE (iGTE) (IGTE גם יכול להיות stumilated עם µg/mL 2 של lipopolysaccharides (LPS) במשך 48 שעות ליזום דלקת ). IGTE הוא במבחנה המודל הראשון של דלקת חניכיים באמצעות תאים אנושיים עם ארכיטקטורה תלת מימדי. IGTE משקפת שינויים פתולוגיים משמעותיים (immunocytes activition, תאיים אינטראקציות בין fibryoblasts, תאי אפיתל, ומונוציטים ו מקרופאגים) במחלות חניכיים. GTE GTE פצועים, iGTE יכול לשמש כלי רב-תכליתי ללמוד ריפוי הפצע, התחדשות רקמות, דלקת, תא-תא אינטראקציה, וכן תרופות פוטנציאליות מסך למחלות חניכיים.
מבוא
מחלות חניכיים הן הגורם המוביל לאובדן שיניים בקרב מבוגרים. דלקת חניכיים חניכיים מחלות חניכיים הנפוץ ביותר בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. שניהם מציגים בתיווך biofilm אקוטי או כרוני שינויים דלקתיים חניכיים. דלקת חניכיים מאופיין על ידי דלקת חריפה, ואילו חניכיים בדרך כלל מציג כמו דלקת כרונית. ברובד היסטולוגית, רכיבים חיידקי להפעיל את ההפעלה של תאים חיסוניים, כגון מקרופאגים, לימפוציטים, תאי פלזמה ותאים תורן1,2. אלו תאים חיסוניים, במיוחד מקרופאגים, אינטראקציה עם תאים מקומיים (כולל תאים אפיתל חניכיים, fibroblasts, תאי אנדותל, תאי העצם) וכתוצאה מכך נגעים דלקתיים רקמת חניכיים3,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
פרוטוקול זה תוכנן כדי ליצור רקמה אנושית חניכיים מקבילות, הפצע חניכיים דגמים ומודלים דלקת חניכיים. העור האנושי keratinocytes עוריות (HaCaT) נמסרו באדיבותו של פרופסור נורברט אי Fusenig של Deutsches Krebsforschungszentrum (היידלברג, גרמניה)7. האדם חניכיים fibroblasts (HGFs) הם בודדו אותנו מהמתרחש רקמות חניכיים על פי פרוטוקולים שפורסמו בעבר8. הסכמה מדעת הושג מראש, ואת המחקר אושרה בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי ועדת האתיקה, ניפון שיניים אוניברסיטת בית הספר של החיים וברפואת שיניים טוקיו (מספר אישור: NDU-T2012-35). פרוטוקול שלבים 1-3 צריכה להתבצע בשכונה התרבות תאים.
1. הכנת רקמות אנושיות 3D במקבילות של חנ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
HaCaT התאים מוצג מורפולוגיה תקין טיפוסי בהסתכלות מיקרוסקופית שלב-ניגודיות (איור 2 א). סורק אלקטרון מיקרוסקופיות (SEM) תמונות הראה כי HaCaT תא משטחים כוסו על ידי רבים microvilli. חיבורי המערכת בין תאים HaCaT היו מתווכת על-ידי תהליכים קרום (איור 2B). תאים HaCaT הביע אפיתל חניכיים סמן K8/1814, המציין כי HaCaT תאים מתאימים עבור שחזור חניכיים (איור 2C).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מבוסס על שיטות ליצירת רקמת חניכיים מקבילות ושווי רקמת שומן תת עורית מתוארת על ידי הקודם דוחות8,21,22. למרות זאת הוא שיטה פשוטה וקלה, כמה צעדים דורשים תשומת לב מיוחדת. לדוגמה, התערובת קולגן יש לשמור בקירור עד השימוש כדי למנוע היווצרות ג'ל בפתרון. בעת הוספת את התערובת קולגן לתוך תותב תרבות, ודא כי הפתרון הוזרק במרכז של התותב, כדי למנוע יצירת ג'ל מוטה (כמו איור 3B). גם לפריצת חור GTE לוקח מ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.
תודות
עבודה זו נתמך בחלקה של החברה יפן לקבלת מענק הסיוע קידום המדע (JSPS) למחקר מדעי (26861689 ו- 17 K 11813). המחברים רוצה להודות מר נתנאל גרין לצורך הגהה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| קולגן מסוג I-A | Nitta Gelatin Inc | להכנת דרמיס של GTE | |
| MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 11900073 | מדיום תרבית |
| תאים הכנס תרבית תאים (לצלחת 24 בארות), גודל נקבוביות 3.0 μ מ | קורנינג, בע"מ | 353096 | לתרבית רקמות |
| GlutaMAX | תרמו פישר | 35050061 | מגיב תרבית תאים |
| DMEM | תרמו פישר מדעי | 31600034 | תרבית תאים |
| מדיום החלפת סרום | תרמו פישר מדעי | 10828028 | מגיב תרבית תאים |
| אגרוף רקמות | Shibata מערכת שירות ושות', בע"מ | SP-703 | עבור ניקוב חורים ב- GTE |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 31800022 | מדיום תרבית תאים |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | לצביעה חיסונית |
| Hoechst 33342 (כתם תאים חיים NucBlue) | Thermo Fisher Scientific | R37605 | לתיוג גרעינים |
| פלואורסצנטי הר בינוני | Dako | להרכבת דגימות לאחר צביעה | |
| חיסוניתנוגדן אנטי-ציטוקרטין 8+18 [5D3] | abcam | ab17139 | לזיהוי |
| מיקרוסקופ אלקטרונים סריקת | היטאצ'י, בע"מ. | HITACHI S-4000 | לתצפית על טופוגרפיית פני השטח וההרכב של דגימות |
| מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי | LSM 700; קרל זייס מיקרוסקופיה ושות', בע"מ | LSM 700 | להתבוננות בצביעה אימונופלואורסצנטית של דגימות |
| Anti-Cytokeratin 19 נוגדן | abcam ab52625 | לזיהוי נוגדן | |
| אפיתל אנטי-וימנטין | abcam | ab92547 | לזיהוי פיברובלסטים ומקרופאגים מופעלים |
| נוגדן Anti-TE-7 | Millipore | CBL271 | לזיהוי פיברובלסטים בדרמיס |
| Anti-CD68 נוגדן | Sigma-Aldrich | SAB2700244 | לזיהוי מקרופאגים |
| Human CD14 נוגדנים | R& D Systems | MAB3832-SP | לזיהוי מקרופאגים |
| Alexa Fluor 594-מצומד עז משני נגד ארנב נוגדן Thermo | Fisher Scientific | A11012 | לצביעה אימונופלואורסצנטית |
| Alexa Fluor 488-מצומד עז משני נגד עכבר נוגדן Thermo | Fisher Scientific | A11001 | לצביעה אימונופלואורסצנטית |
| EVOS FL מערכת הדמיית תאים | Thermo Fisher Scientific | לצפייה בצביעת האימונופלואורסצנציה של הדגימה | |
| תאי THP-1 | Riken בנק תאי BRC | RCB1189 | להכנת iGTE |
| PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | לבידול תאי THP-1 |
מקורות
- Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease. Periodontology 2000. 64 (1), 57-80 (2014).
- Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. Oral Inflammatory Diseases a....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
