歯肉の炎症性三次元人体同等

サマリー

プロトコルの目的は、炎症性歯肉モデル体外を構築することです。この組織モデルは共同ひと細胞、HaCaT ケラチノ サイト、歯肉線維芽細胞および三次元条件下での THP 1 マクロファージの 3 種類を栽培します。このモデルは、歯肉炎や歯周炎などの歯周病を調査に適用することができます。

要約

(歯肉炎・歯周炎などの歯周病は、成人の歯の喪失の主要な原因です。歯肉の炎症は、歯周疾病の根本的な生理病理学です。歯周疾患の実験モデルを現在は動物の様々 なタイプに設けられています。ただし、モデル動物の生理病理学、細胞および分子メカニズムを分析し、歯周疾患の新薬を評価しにくく、人間のそれとは異なる。ここでは、ヒトの炎症性組織培養歯肉 (日本支社は 1996) 相当を再構築するための詳細なプロトコルを提案する.2 種類のひと歯肉線維芽細胞 (HGF) と三次元条件下でヒトの皮膚表皮角化細胞 (HaCaT) などを含む人間の細胞を用いた人体組織等価な歯肉 (GTE) を構築します。GTE に穴をパンチする組織パンチャーを使用して傷のモデルを作成します。次に、人間の THP 1 球がコラーゲン ・ ゲル混合は、GTE の穴に挿入されます。10 ng/mL ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) 72 時間の adimistration、thp-1 細胞では GTE (日本支社は 1996) でフォーム炎症巣にマクロファージ分化 (日本支社は 1996 もすることができます stumilated 2 μ g/ml のリポ多糖 (LPS) の炎症を開始する 48 時間).日本支社は 1996 は、ひと細胞を用いた三次元アーキテクチャ炎症歯肉の最初の in vitroモデルです。日本支社は 1996 は、歯周疾病の主要な病理学的変化 (免疫細胞 activition、fibryoblasts、上皮細胞、単球やマクロファージの細胞相互作用) を反映します。GTE、負傷者 GTE、日本支社は 1996 は、歯周疾病の創傷治癒過程を研究する汎用性の高いツール、組織再生、炎症、細胞間相互作用や画面潜在的な医薬品として使用できます。

概要

歯周病は、成人の歯の喪失の主要な原因です。歯肉炎と歯周炎は、最も一般的な歯周疾患です。両方は歯肉でバイオ フィルムを介した急性または慢性炎症性変化を提示します。歯肉炎は、歯周炎は、通常慢性炎症として提示に対し、急性炎症によって特徴付けられます。組織学的レベルでは、微生物の構成要素は、マクロファージ、リンパ球、形質細胞、肥満細胞の^1,2などの免疫細胞の活性化をトリガーします。(歯肉上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、骨芽細胞を含む) ローカルの細胞と対話するこれらの免疫細胞、特にマクロファージ炎症歯周組織^3,4病変の結果します。ラットなどの動物の様々 な種類の歯周疾患の実験モデルを確立されているハムスター、ウサギ、フェレット、イヌ、霊長類。ただし、モデル動物の生理病理学、細胞および分子メカニズムを分析し、歯周疾患⁵の新しい薬を評価しにくく、人間のそれとは異なる。歯周病細菌や単分子膜ひと口腔上皮細胞の共同栽培は、歯周感染症⁶のメカニズムを調査する使用されています。口腔細胞の単層培養がそのまま組織の三次元 (3 D) 細胞アーキテクチャを欠いているにもかかわらず、したがって、培養状況を模倣する....

プロトコル

このプロトコルは、対応するひと歯肉組織、歯肉創傷モデル、および歯肉炎モデルを作成する設計されています。ひと皮膚表皮角化細胞 (HaCaT) 親切教授ノルベルト ・ e. Fusenig ドイツ Krebsforschungszentrum (ハイデルベルク、ドイツ)⁷から提供されていました。ひと歯肉線維芽細胞 (HGFs) は、以前に公開されたプロトコル⁸によると歯肉組織から分離された.あらかじめ、インフォームド コンセントを得たし、研究が、日本歯科大学生命歯学部東京での倫理委員会で設定されたガイドラインに従って承認された (承認番号: NDU T2012 35)。細胞文化フードでプロトコルの手順 1-3 を実行必要があります。

1. 歯肉 (GTE) (図 1 a) の 3 D 人体組織等価の準備

1. ミックス タイプ - A コラーゲンゲル 10% 濃縮 MEM-α と 10% の再構築バッファー (2.2 g NaHCO₃と 4.47 g HEPES 100 mL 0.05 N 水酸化ナトリウム) ピペッティングで 15 mL の生殖不能の管に。氷上を使用するまで混合コラーゲン溶液を維持します。
2. 24 ウェル プレートに 24 の文化挿入 (細孔サイズ 3.0....

結果

細胞には、位相差顕微鏡による観察 (図 2 a) の下で典型的な表皮細胞の形態が表示されます。スキャナー電子顕微鏡 (SEM) 像は、HaCaT 細胞表面が多く微絨毛で覆われていたことを示した。HaCaT 細胞間の細胞間の接続は、膜プロセス (図 2 b) によって仲介されました。細胞は、歯肉上皮マーカー K8/18¹⁴HaCaT 細胞が歯肉再建 (図 2) に適していることを示す表現。

図 3 aは、GTE の成功例を示し、図 3 bは、GTE の失敗した例を示しています。(

ディスカッション

このプロトコルは、歯肉組織等価および皮下脂肪組織相当前レポート^8,21,22で説明を作成する方法に基づいています。これは、シンプルで簡単な方法は、いくつかの手順特別な注意が必要です。たとえば、コラーゲン混合物は、ソリューションのゲル形成を避けるために使用するまで氷で冷やす必要があります。コラーゲン混合物を文化挿入に追加すると、ソリューションは、偏りのあるゲル ( 3 b を図のように) を避けるために挿入部に注入されたを確認します。スキルを取るも GTE で穴をあけます。組織のパンチャーは時々 組織があまりにも濡れている場合組織を選ぶことはできません。組織生検システムや鉗子の有用である;ただし、負傷した位置の寸法も変更されます。また、鋭い針で穴をあけることがなく THP 1 細胞コラーゲン混合物を注入する注射器を使用することが可能だ (ゲルに針が詰まらせるれませんを確認してください)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
コラーゲンI-A型	新田ゼラチン株式会社		真皮を作るため
	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11900073	細胞培養
液 細胞培養インサート(24ウェルプレート用)、細孔径3.0 μm	コーニング株式会社	353096	組織培養用
GlutaMAX	サーモフィッシャーサイエンティフィック	35050061	細胞培養試薬
DMEM	サーモフィッシャーサイエンティフィック	31600034	細胞培養培地
ノックアウト 血清補充	サーモフィッシャーサイエンティフィ	10828028	細胞培養試薬
ティッシュパンチャー	柴田システムサービス株式会社	SP-703	用GTE
RPMI 1640	サーモフィッシャーサイエンティフィック	31800022	細胞培養培地
BSA	Sigma-Aldrich	A3294	免疫染色用
Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	R37605	核の標識用
蛍光マウント培地	Dako		免疫染色後のサンプルのマウント用
抗サイトケラチン 8+18 抗体 [5D3]	abcam	ab17139	上皮同定
走査型電子顕微鏡	日立製作所	日立 S-4000	試料の表面トポグラフィーと組成観察用
共焦点レーザー走査型顕微鏡	LSM 700;カールツァイス顕微鏡(株)	LSM 700	サンプルの免疫蛍光染色観察用
抗サイトケラチン19抗体	abcam	ab52625	上皮の同定用
アンチビメンチン抗体	abcam	ab92547	線維芽細胞および活性化マクロファージの同定用
抗TE-7抗体	ミリポア	CBL271	真皮の線維芽細胞の同定用
抗CD68抗体	Sigma-Aldrich	SAB2700244	マクロファージの同定
ヒトCD14抗体	R&D Systems	MAB3832-SP	マクロファージの同定用
Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody	Thermo Fisher Scientific	A11012	免疫蛍光染色用
Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody	サーモフィッシャーサイエンティフィ	A11001	免疫蛍光染色用
EVOS FL Cell Imaging System	サーモフィッシャーサイエンティフィック		免疫蛍光染色用試料の観察用
	理研BRC細胞バンク	RCB1189	の作製
用	Sigma-Aldrich	P8139	THP-1細胞の分化用

GTE MEM-αのック 用 ック THP-1細胞の iGTE PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)