Summary
البلاناريا mediterranea شميدتيا نموذج ممتاز لدراسة الخلايا الجذعية وتجديد الأنسجة. ويصف هذا المنشور أسلوب لإزالة جهاز واحد، البلعوم، بشكل انتقائي بتعريض الحيوانات لأزيد الصوديوم الكيميائية. ويوجز هذا البروتوكول أيضا أساليب لرصد التجديد البلعوم.
Abstract
بلاناريانس هي فلاتورمس التي فعالة للغاية في التجديد. أنهم مدينون بهذه القدرة على عدد كبير من الخلايا الجذعية التي يمكن الاستجابة بسرعة لأي نوع من الضرر. نماذج الإصابات الشائعة في هذه الحيوانات إزالة كميات كبيرة من الأنسجة، مما يضر بأجهزة متعددة. للتغلب على هذه الأضرار الأنسجة واسعة، يصف لنا هنا طريقة لإزالة جهاز واحد، البلعوم، بشكل انتقائي في البلاناريا mediterranea شميدتيا. نحقق ذلك بالحيوانات مغطس بمحلول يحتوي على أزيد الصوديوم مثبطات السيتوكروم أوكسيديز. تعرض موجزاً لأزيد الصوديوم يسبب بثق البلعوم من الحيوان، والتي نسميها "الكيميائية البتر." بتر الكيميائية يزيل البلعوم كامل، ويولد جرحا صغيراً حيث تولي البلعوم للامعاء. وبعد الشطف واسعة النطاق، تجديد جميع الحيوانات المبتورة البلعوم تعمل بكامل طاقتها في أسبوع واحد تقريبا. الخلايا الجذعية في بقية أنحاء الجسم محرك التجديد البلعوم الجديدة. هنا، نحن نقدم مفصل البروتوكول لبتر الكيميائية، ووصف طرق غذائها والسلوكية على السواء لتقييم نجاح البتر والتجديد.
Introduction
التجديد هو ظاهرة تحدث في جميع أنحاء المملكة الحيوانية، مع قدرات التجدد بدءاً من تجديد كامل الجسم في بعض اللافقاريات إلى قدرات أكثر تقييداً في الفقاريات1. استبدال أنسجة وظيفية عملية معقدة، وكثيراً ما يستتبع إعادة متزامنة بأنواع متعددة من الخلايا. على سبيل المثال، تجديد أطرافهم [سلمندر]، خلايا الاوستيوبلاستس، chondrocytes، والخلايا العصبية، والعضلات، والخلايا الظهارية في حاجة إلى أن يكون محل2. هذه أنواع الخلايا التي تم إنشاؤها حديثا تحتاج أيضا إلى أن تنظم بشكل صحيح لتيسير وظيفة جديدة من أطرافهم. فهم هذه العمليات المعقدة تتطلب التقنيات التي تركز على التجديد لأنواع محددة من الخلايا واندماجها في الأجهزة.
واحدة من الاستراتيجيات المستخدمة لتبسيط دراسة استجابات التجدد هو الاجتثاث المستهدفة أما بعض أنواع الخلايا أو مجموعات أكبر من الأنسجة. على سبيل المثال، في الزرد، التعبير عن نيتروريدوكتاسي في أنواع محددة من الخلايا يؤدي إلى تدميرها بعد تطبيق ميترونيدازول3،4. في اليرقات المورفولوجية ، يمكن التعبير عن الجينات برو-أبوبتوتيك تحت المروجين الأنسجة على حدة بشكل انتقائي يجتذ مناطق محددة من5،إيماجينال القرص6. كل من هذه الاستراتيجيات تسبب التلف السريع الخاضعة للرقابة، وقد استخدمت لتشريح الآليات الجزيئية والخلوية المسؤولة عن التجدد.
في هذه المخطوطة، يمكننا وصف أسلوب انتقائي يجتذ جهازا أسرة تسمى البلعوم في البلاناريا mediterranea شميدتيا. بلاناريانس نموذج كلاسيكية للتجدد، معروفة بقدرتها التجدد غزير، حيث يمكن أن تنمو شظايا دقيقة حتى الحيوانات كله 7،8. لديهم عدد سكانها كبيرة وغير متجانسة من الخلايا الجذعية تتكون من خلايا pluripotent وفروعه المقيدة بالنسب9،،من1011. تتكاثر هذه الخلايا والتفريق ليحل محل جميع الأنسجة المفقودين، بما في ذلك البلعوم ونظم الجهاز العصبي والجهاز الهضمي والإخراج، والعضلات والخلايا الظهارية9،،من1012. وفي حين أننا نعرف أن هذه الخلايا الجذعية الشروع في التجديد، نحن لا يفهم تماما الآليات الجزيئية التي تدفع بهم استبدال كل هذه الأنواع المختلفة من الخلية. يمكن أن تساعد الأساليب مما أسفر عن إصابة محددة بأن الحصول على ردود محددة من الخلايا الجذعية تحدد هذه العملية المعقدة.
البلعوم عبارة عن أنبوب أسطواني كبير، واللازمة لتغذية، ويحتوي على الخلايا العصبية، والعضلية، والخلايا الظهارية والافرازيه13،29. عادة مخبأة في حقيبة على الجانب البطني للحيوان، فهي تمتد من خلال جسم الحيوان واحد فتح عند استشعار وجود الغذاء. إلى بتر البلعوم بشكل انتقائي، ونحن نقع بلاناريانس في أزيد صوديوم تسمى كيميائية، مخدر استخداماً في C. ايليجانس14،،من1516. استخدامها في بلاناريانس وأبلغت أولاً أدلر et al.، في عام 201412. في غضون دقائق تعرض لأزيد الصوديوم، بلاناريانس قذف بهم فارينجيس، ويفصل البلعوم مع الانفعالات لطيف، من الحيوان. نشير إلى هذه الخسارة كاملة وانتقائية البلعوم ك "بتر الكيميائية". أسبوع واحد بعد بتر الأطراف، البلعوم تعمل بكامل طاقتها هو استعادة12. لأن البلعوم مطلوب للتغذية، يمكن قياس التجدد الوظيفية برصد سلوك التغذية. أدناه، ونحن تصف البروتوكول لبتر الكيميائية، وتقييم تجديد البلعوم وإعادة تغذية السلوك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد
-
إعداد المياه المستورقات 17
- الحفاظ على بلاناريانس في محلول ملح X Montjuïc 1. لإعداد البلاناريا المياه، جعل الحلول الأسهم الفردية كاكل 1 م2، 1 م MgSO4، 1 "مجكل م"2، 1 م بوكل وكلوريد الصوديوم م 5 في الماء عالي النقاوة. عامل التصفية-تعقيم مع تخزين طويل الأجل فيلتيرفور أعلى زجاجة 0.2 ميكرون.
ملاحظة: استخدم فقط عالي النقاوة المياه (مع أومه MΩ 18.2 عند 25 درجة مئوية) لإعداد مونتجويك الأملاح. - إعداد مخزون 1 لتر من 5 س الحل الملح، الجمع بين 5 مل م 1 كاكل2, 5 مل من 1 م MgSO4، 0.5 مل من مجكل2، 0.5 مل من بوكل و 1.6 مل م 5 حلول كلوريد الصوديوم في الماء عالي النقاوة 900 مل. لهذا الحل، إضافة ز 0.504 ناكو3 وآثاره للخلط. قم بضبط درجة الحموضة 7.0 مع حمض الهيدروكلوريك.
- تمييع هذا 5 × الحل الأسهم 1 × تركيز العمل في الماء عالي النقاوة في حاوية معقمة مثل كاربوي قدرة كبيرة (انظر الجدول للمواد). استخدام هذا الحل X 1 للحفاظ على بلاناريانس مخصي.
ملاحظة: كبديل للحل الملح مونتجويك، استخدام مياه الينابيع التي تم شراؤها محلياً أو عالي النقاوة المياه التي تحتوي على ملح حوض السمك متاحة تجارياً مزيج (انظر الجدول للمواد) في غرام/لتر of0.5 تركيز18. - لمنع العدوى البكتيرية في ثقافة ثابتة19، الحفاظ على بلاناريانس في المياه التي تحتوي على المضادات الحيوية. إعداد 50 ملغم/مل الحل الأسهم من كبريتات الجنتاميسين في الماء عالي النقاوة وتعقيم عامل التصفية. للحاويات حيث يتم الاحتفاظ بالحيوانات، إضافة كبريتات الجنتاميسين لتركيز نهائي من 50 ميكروغرام/مل (تخفيف 1: 1000).
- الحفاظ على بلاناريانس في محلول ملح X Montjuïc 1. لإعداد البلاناريا المياه، جعل الحلول الأسهم الفردية كاكل 1 م2، 1 م MgSO4، 1 "مجكل م"2، 1 م بوكل وكلوريد الصوديوم م 5 في الماء عالي النقاوة. عامل التصفية-تعقيم مع تخزين طويل الأجل فيلتيرفور أعلى زجاجة 0.2 ميكرون.
-
إعداد معجون الكبد
- كما تزدهر بلاناريانس على نظام غذائي من العضوية، شراء اللحوم بنك الاحتياطي الفيدرالي العشب الكبد، الكبد الطازج وعملية ضمن 24 h. إزالة الكبسولة الغشائي تغليف الكبد التي يسقط بلطف. قطع الكبد إلى مكعبات ~ 1 سم، واستخدام شفرة كشط قبالة وتجاهل جميع عروق الكبد والشرايين.
- مسرات استخدام مطحنة المواد غذائية أو الطعام معالج قطعة الكبد وثم نقله من خلال مصفاة سلك شبكة غذاء. الجمع بين أكياس الحلويات، والاستغناء عن الحقن أو أطباق بتري 35 ملم. قبل اﻹطعام، الطرد المركزي برفق لإزالة فقاعات الهواء.
- تخزين مختبرين للكبد في-80 درجة مئوية لتصل إلى السنة، وذوبان الجليد قبل استخدام. بعد ذوبان الجليد، إعادة تجميد أي بقايا الكبد مرة واحدة، أو تخزين عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة.
-
الحفاظ على الحيوانات
- بلاناريانس سوف تنمو ويتقلص بأحجام مختلفة تبعاً لتواتر التغذية. آر بلاناريانس كل أسبوع (مرة واحدة كل 14 يوما). للمدى الطويل معظم الثقافات، استخدام حاويات بلاستيكية بأحجام مختلفة (انظر الجدول للمواد).
- لعلف الحيوانات واستخدام ملعقة معدنية أو بيبيت نقل البلاستيك لتضع قطره الحجم البازلاء من الكبد في مربع. السماح للحيوانات للأكل حاء – 1-2 إزالة المواد الغذائية المتبقية قبل تنظيف المربع.
- تنظيف الديدان مرتين في أسبوع إذا كان بنك الاحتياطي الفيدرالي (مرة واحدة مباشرة بعد الرضاعة ومرة بعد ذلك بيومين)، أو مرة واحدة في أسبوع إذا لم تغذي. لتنظيف، تصب المياه في كوب بلاستيك بصب الماء بعناية مع الاحتفاظ بلاناريانس في المربع. مسح سطح مربع مع منشفة ورقية، ثم كرر على جميع الجوانب حتى يصبح المربع نظيفة.
- استبدال الماء (إلى حوالي ¾ حجم مربع) وإضافة الجنتاميسين لتركيز نهائي من 50 ميكروغرام/مل. تخزن الحيوانات في خزانة مظلمة أو في حاضنة 20 درجة مئوية.
-
تحديد ديدان
- حدد الديدان غذيت 5-7 أيام السابقة.
ملاحظة: أنها أكثر صعوبة إلى حد كبير إلى بتر فارينجيس من الديدان التي قد تم تغذية مؤخرا (1-2 أيام قبل البتر). تغذية الحيوانات أيضا أكثر حساسية لأزيد الصوديوم. - حدد الديدان التي تقريبا 6 مم في الطول. ولتقدير حجم الدودة، أنه نقل إلى طبق بتري ماصة نقل بلاستيك باستخدام. ضع المسطرة في شقة 6-أو ورق الرسم البياني 5 مم × 5 مم تحت طبق بيتري وقياس طول الدودة بينما كان يزحف.
ملاحظة: الديدان أصغر من 6 مم في الطول أكثر صعوبة بتر.
- حدد الديدان غذيت 5-7 أيام السابقة.
-
إعداد أزيد الصوديوم
- تحضير حلاً 100 ملم بتذويب مسحوق أزيد الصوديوم في المياه المستورقات.
تنبيه: أزيد الصوديوم السامة وينبغي التعامل معها بعناية. عدم تجاهل أزيد الصوديوم هباء. وبعد الاستخدام، أنه جمع كل على حدة للتخلص منها كنفايات خطرة.
- تحضير حلاً 100 ملم بتذويب مسحوق أزيد الصوديوم في المياه المستورقات.
2-البلعوم البتر
- مكان الديدان في قطرها 35 ملم طبق بيتري. بعناية إزالة جميع البلاناريا المياه من الطبق باستخدام بيبيت نقل بلاستيك.
ملاحظة: كحد أقصى من 20 ملم 6 الديدان يمكن استيعابها بشكل مريح في طبق بهذا الحجم. - ضع الصحن تحت المجهر وضبط التكبير بحيث يمكن مشاهدة الديدان متعددة في وقت واحد (مثلاً 10 X التكبير). استبدال المياه البلاناريا بمحلول أزيد الصوديوم 100 مم.
ملاحظة: لطبق بتري 35 ملم، حوالي 5 مل أزيد الصوديوم غير كافية. وينبغي أن تغرق الحل الكامل بلاناريانس. ضبط حجم الحل للاطباق أكبر عند الضرورة. - مراقبة الحيوانات تحت المجهر وتمتنع عن تحريك الطبق لأول 3-4 دقيقة.
- مراقبة البثق البلعوم عن طريق المجهر؛ وسوف تبرز من الحقيبة البلعوم البلعوم وتمتد بالكامل (حوالي 1 مم في الطول) كما هو مبين في الشكل 1 باء.
ملاحظة: من المهم الانتظار لحين انتهاء البلعوم تمديد تماما قبل المضي قدما. وبمجرد البلعوم يخرج من الحيوان، يأخذ التمديد الكامل تقريبا 1 دقيقة. - استخدام بيبيت نقل بلاستيك لبخ الحيوانات حول الطبق. امتصاص الحيوانات إلى بيبيت وقسرا الإفراج عنهم إلى الطبق بضع مرات. إذا مددت البلعوم هو تماما، هذا بيبيتينج قوية سوف يؤدي إلى فصل.
- وبدلاً من ذلك، فهم البلعوم أما عمودياً على طوله، أو أفقياً على طول محيط استخدام زوج من غرامة الملقط (انظر الجدول للمواد) كما هو مبين في الشكل 1. مع البلعوم مقروص في الملقط، رفع الحيوان صعودا نحو غضروف. كما أثير الحيوان، سوف يسبب التوتر السطحي البلعوم لفصل من الحيوان.
ملاحظة: يمكن استخدام هذا الأسلوب لإزالة فارينجيس الحيوانات الصغيرة (1-3 ملم في الطول) حيث يحوم قوية ليست كافية. تجنب دس أو خلاف ذلك مما أسفر عن إصابة جسم الحيوان. - استخدام بيبيت نقل، نقل الحيوانات المبتورة إلى طبق جديد يحتوي على المياه العذبة المستورقات.
- بمجرد نقل، بترت شطف الحيوانات جيدا في المياه المستورقات، تماما تبادل المياه ثلاث مرات. نقل إلى طبق جديد يحتوي على الماء المستورقات مع 50µg/مل جنتاميسين.
ملاحظة: تبادل المخزن المؤقت كاملة خلال هذه يغسل ثلاث ضروري لضمان التخلص أزيد الصوديوم. - في اليوم التالي، استبدال الماء في الطبق مع المياه العذبة المستورقات التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل من الجنتاميسين. كرر كل يوم بعد ذلك.
3-تقييم لإزالة البلعوم بعد بتر
- دراسة الحيوانات تحت مجهر (مع 10-20 X التكبير) لتحديد ما إذا كانت بقعة مظلمة قد ظهرت بعد نجاح إزالة البلعوم، كما هو مبين في الشكل 2 ألف.
- وبدلاً من ذلك، إصلاح والتبييض الحيوانات وفقا لبروتوكول وصف بيرسون et al. 20-الحيوانات نقع بين عشية وضحاها في 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) أو ستريبتافيدين فلوريسسينتلي مترافق (1: 500 1 مغ/مل مخففة في 1 × الفوسفات خفف المحلول الملحي الذي يحتوي على 0.3% تريتون العاشر). جبل الحيوانات على الشرائح في glycerol/20% 80% 1 × الفوسفات خفف المحلول الملحي والصورة تحت ستيريوميكروسكوبي نيون (الشكل 2).
ملاحظة: تم القبض على جميع الصور في هذه المخطوطة في ستيريوميكروسكوبي فلورية ذات هدف X 1.0.
4-تقييم التجدد البلعوم بقياس تغذية السلوك
-
إعداد الكبد
- نقل الكمية المطلوبة من معجون الكبد إلى ميكروسينتريفوجي أو أنبوب مخروطي. تدور بإيجاز لإزالة فقاعات الهواء. تقدير حجم الكبد، ثم قم بإضافة المياه المستورقات إلى 1/5 حجمها، و 2 في المائة من الحجم الإجمالي في تلوين الطعام حمراء. على سبيل المثال، إلى 1000 ميليلتر للكبد لصق، إضافة 200 ميليلتر من الماء المستورقات و 24 ميليلتر لتلوين الطعام.
- باستخدام مدقة بلاستيكية أو ماصة تلميح أو ملعقة معدنية، مزيج دقيق حتى تلوين الطعام موزعة بالتساوي في لصق الكبد. تدور مرة أخرى بإيجاز. يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية عن ح 24 لصق الكبد أو المجمدة في مختبرين في-80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
- إذا كان اختبار الحيوانات تصل إلى 25، إعداد 25 ميليلتر من معجون الكبد كل طبق (حوالي 1 ميليلتر من معجون الكبد للحيوان الواحد).
-
تغذية الحيوانات
- سبعة أيام بعد البتر الكيميائية ونقل الحيوانات إلى طبق بتري جديدة. إذا كان اختبار الحيوانات 10-15، استخدم طبق 35 مم؛ وينبغي اختبار الحيوانات أكثر من 15 في طبق بتري 60 ملم. إبقاء الحيوانات في الظلام، دون عائق، لقرابة 1 ح قبل التغذية.
- باستخدام مقص، زيادة عرض تلميح ماصة P200 بالتشذيب تقريبا ½ سم قبالة نهاية الضيقة. بيبيت 25 ميليلتر لصق الكبد الأحمر إلى الطبق.
ملاحظة: تقليم النهاية يجعل بيبيتينج لصق الكبد لزج أسهل. لمنع الكبد من تطفو على السطح، تلمس في تلميح إلى الجزء السفلي من الطبق أثناء الاستغناء. - السماح للحيوانات لإطعام لمدة 30 دقيقة.
- نقاط عدد الحيوانات التي قد أكلت بوضع الحيوانات على خلفية بيضاء أو فحصها تحت مجهر مع 10-20 X التكبير.
- بعد الرضاعة، إزالة الكبد من الطبق ونظيفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التعرض لأزيد الصوديوم يعطل حركية طبيعية من بلاناريانس، مما تسبب في الحيوانات على امتداد وتلوي. قوة هذه الحركات البلعوم الخروج من الجانب البطني للحيوان، وبعد حوالي 6 دقائق في محلول أزيد الصوديوم، يمكن رؤية تلميح أبيض البلعوم (الشكل 1B-اللوحة اليسرى). بضع دقائق في وقت لاحق، الحيوانات بنشاط العقود وتمديد البلعوم تماما بقوة دفعها خارج الجسم. (الشكل 1B-الفريق الأوسط). حوالي الساعة 11 دقيقة بعد التعرض أزيد والحيوانات والبلعوم الاسترخاء. في هذه المرحلة، شكل جرس مميزة البلعوم مرئية بوضوح (الشكل 1B-اللوحة اليمنى). للبتر السهل، من المهم الانتظار البلعوم للاسترخاء.
لأن البلعوم كبير، ينتج أونبيجمينتيد كتلة من الأنسجة، وإزالته في ظهور بقعة مظلمة في الجهة الظهرية من الحيوانات المبتورة (الشكل 2A). هذه المنطقة المظلمة مؤشر مرئي البتر ناجحة في الحيوانات الحية. الحال مرئياً مباشرة بعد بتر الأطراف وتصبح أكثر بروزا في اليوم التالي. كما تجدد البلعوم، يخفف من هذه المنطقة. رصد التجديد البلعوم أكثر دقة، يمكن الملون الحيوانات مع DAPI أو streptavidin مترافق فلوريسسينتلي بين عشية وضحاها (الشكل 2). لتقييم مدى التجديد البلعوم كمياً، يمكن قياس المجال استخدام البرمجيات إيماجيج.
البلعوم جهازا أساسيا لابتلاع تشيموسينسيشن والمواد الغذائية. لتحديد متى يتم استعادة هذه المهام أثناء التجديد، استخدمنا تغذية فحوصات لمراقبة سلوك الحيوانات. من خلال الجمع بين الأغذية التلوين مع لصق الكبد، كنا قادرين على التمييز بين الحيوانات التي أكلت من تلك التي لم لا (الشكل 3A). ثم أننا كمياً عدد الحيوانات الحمراء لتقييم النسبة المئوية للحيوانات مع البلعوم وظيفية. استناداً إلى النتائج هو موضح في الشكل 3، تمت استعادة سلوك التغذية الناجحة 7 أيام بعد بتر الأطراف، مشيراً إلى أن أسبوع واحد بعد إزالة البلعوم، الحيوانات قد مجدد البلعوم وظيفية. لاختبار ما إذا كان التعرض أزيد الصوديوم يؤثر سلوك التغذية، نحن غارقة الحيوانات في أزيد الصوديوم لكن جرفت قبل قذف البلعوم مباشرة. يوم واحد في وقت لاحق، ونحن تقييم ما إذا كان تم تغيير سلوك البحث عن الغذاء بالتعرض أزيد الصوديوم مع المقايسة التغذية. على النقيض من الحيوانات بترت كيميائيا تفتقر البلعوم، جميع الحيوانات الاحتفاظ البلعوم سليمة بعد أن تناولوا التعرض أزيد الصوديوم (n = الحيوانات 30 لكل شرط) الطعام. هذه النتيجة تشير إلى أن التعرض أزيد الصوديوم يؤثر على سلوك التغذية، ما دامت البلعوم لا تزال سليمة.
الشكل 1 . إخراج البلعوم والبتر. (أ) التخطيطي للتشريح البلاناريا. (ب) صور للحيوانات الحية عرض الإخراج البلعوم عند نقع في أزيد الصوديوم 100 مم. الأسهم الحمراء تسليط الضوء على البلعوم. تغيير حجم أشرطة = 750 ميكرون. (ج) صورة من الحيوانات الحية (يسار) والتخطيطي (يمين) لبتر الأطراف باستخدام الملقط. لوحات عرض اثنين من الخيارات المختلفة لتجتاح البلعوم. يواجه الجانب البطني للحيوان. تغيير حجم أشرطة = 500 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . تقييم البلعوم البتر والتجديد. (أ) الصور التمثيلية للحيوانات الحية في تحديد مرات قبل وبعد بتر الأطراف. تظهر لوحة الأوسط بقعة مظلمة في منطقة البلعوم بعد بتر الأطراف، وأبرز مربع أبيض متقطع. يواجه الجانب الظهرية. تغيير حجم أشرطة = 500 ميكرومتر. (ب) صور الممثل للحيوانات الملون مع Alexa488-ستريبتافيدين في تحديد مرات قبل وبعد بتر الأطراف. تظهر لوحة وسط غياب البلعوم بعد بتر الأطراف. منطقة البلعوم وأبرز مربع أبيض. يواجه الجانب البطني. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. التقييم التجدد البلعوم. (أ) الصور والتخطيطي لتغذية المقايسة، قامت بوضع 25 ميليلتر للكبد في المركز من 60 مم طبق بيتري. التخطيطي (أعلى اليسار)، وتظهر الصورة (الأوسط) تغذية السلوك في الحيوانات مع فارينجيس سليمة. أعلى الصورة الصحيحة، من الحيوانات التي أكلت. التخطيطي (أسفل اليسار) والصورة (الأوسط) لتغذية السلوك في الحيوانات يوم 1 بعد بتر الأطراف. أسفل اليمين، الحيوان الذي لم يأكل. شريط المقياس = 750 ميكرون. (ب) نتائج التغذية الاعتداء. النسبة المئوية للحيوانات التي قد تناولها الغذاء (الكمية باللون الأحمر) في أوقات محددة بعد بتر الأطراف. لكل نقطة الوقت، n = 10 الحيوانات، تتكرر في ثلاث نسخ. شريط الخطأ = التنمية المستدامة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويصف هذا البروتوكول طريقة التذرية انتقائية البلعوم باستخدام أزيد الصوديوم. استخدمت دراسات أخرى الاجتثاث المستهدفة في بلاناريانس تعديل عملية جراحية لإزالة photoreceptors21 أو العلاج الدوائي ليجتذ تتميز الخلايا العصبية22. واحد ميزة هامة من بتر الكيميائية عبر الطرق الحالية أنها لا تتطلب جراحة. يسهل بنية جامدة البلعوم مقارنة ببقية الجسم البلاناريا إزالة كاملة من الحيوان، الذي أكثر ليونة جسديا. كما يفصل البلعوم من الحيوان في مفرق صغيرة (المريء)30 الانضمام إلى البلعوم والأمعاء، توليد جرح استنساخه بأكثر من واحد الناجمين عن طريق أداة جراحية أكبر. استناداً إلى الخصائص الفيزيائية والصلة التشريحية الصغيرة إلى بقية الحيوان، إزالة البلعوم وبالتالي يولد الجروح أكثر تجانساً من غيرها البتر الجراحي.
طول التعرض لأزيد الصوديوم أيضا عاملاً حاسما في نجاح هذا الأسلوب. على الرغم من أن تعرض موجزاً لأزيد الصوديوم لا يؤثر سلبا على بلاناريانس، التعرض المطول السامة وسيتم في نهاية المطاف قتل الحيوانات. من المعروف أن تعوق العمليات المعتمدة على الطاقة عن طريق تثبيط السيتوكروم أوكسيديز،من2324أزيد الصوديوم. وباﻹضافة إلى ذلك، فإنه يمنع النسخ والترجمة، ويحتمل بتراكم العناصر الرئيسية لهذه التفاعلات في الإجهاد حبيبات25. في بلاناريانس، يمنع التعرض أزيد الصوديوم الانقسام ح 24، بعد استئناف الخلايا انتشار12. التعديلات مثل يمكن أن تساعد على الحد من الوقت المخصص للتعرض أزيد، إزالة أزيد مع الشطف دقيق، والمحاسبة لقمع الانقسامية عابر في التصميم التجريبي التغلب على هذه القيود.
موقف تشريحية فريدة البلعوم والتماثل شعاعي المميزة بالسماح للتفريق السهل المجددة حديثا أنسجة البلعوم من الخلايا الجذعية الموجودة من قبل. يمكن رصد التجديد البلعوم على المستويين الخلوي والتشريحية استخدام أنسجة البقع مثل ستريبتافيدين و DAPI، إيمونوهيستوتشيميستري، أو بواسطة التهجين في الموقع 26. والرزن التغذية الموصوفة هنا فحوصات التجدد الوظيفية البلعوم. به نحو الغذاء يتطلب27،البلعوم28 ولا يمكن استيعاب الحيوانات دون البلعوم تعمل بكامل طاقتها الغذاء. ويكمل هذا التقييم بسيطة والكمية لوظيفة الجهاز ولذلك التجديد الهيكلي. بالإضافة إلى ذلك، بتر الكيميائية يمكن أن يؤديها على سكان حيوانات، ويمكن أن تولد العديد من الحيوانات بإصابات مماثلة. ولذلك الإجراء مريحة لدراسات واسعة النطاق. يجعل هذه المزايا، إلى جانب حقيقة أن يتطلب تجديد البلعوم ناضجة الخلايا الجذعية، وبتر البلعوم نموذجا مثاليا لدراسة تجديد الجهاز. تستخدم في تركيبة مع البتر أوسع، يمكن أن تستخدم إزالة البلعوم لاختبار فرضيات حول كيفية تأثير حجم الجرح وموقف التشريحية استجابة الخلايا الجذعية للإصابة، ومسألة رئيسية في مجال التجديد21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونود أن نشكر أليخاندرو سانشيز ألفارادو، الذين أيدوا في التحسين الأولية وتطوير هذه التقنية. العمل في مختبر كارولين أدلر معتمد من قبل جامعة كورنيل أموال بدء التشغيل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Chemical | C79-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | Fisher Chemical | M65-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2) | Acros/VWR | 41341-5000 | Montjuïc salt solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Acros Organics/VWR | 196770010 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Chloride (NaCl) | Acros Organics/VWR | 207790050 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Acros Organics/VWR | 123360010 | Montjuïc salt solution |
| Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot | ThermoFisher Scientific/VWR | 2324-0015 | Storing planaria water |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands | Amazon | Planaria water |
| Gentamicin Sulfate | Gemini Bio-products | 400-100P | Planaria water |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Mincing liver |
| Disposable pastry bags-16”, 12 pack | Wilton | Amazon | Liver aliquots |
| 5 mL syringes | BD/VWR | 309647 | Liver aliquots |
| Petri dishes-35mm/60mm | Greiner Bio-One/VWR | 82050-536/82050-544 | |
| Plastic containers (various sizes) | Ziploc | Amazon | Housing planarians in static culture |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Transfer pipette | Globe Scientific | 138030 | |
| Forceps - Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D (0203-5-PO) | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62247 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 |
References
- Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).
- Tanaka, E. M. The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration. Cell. 165, 1598-1608 (2016).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat. Protoc. 3, 948-954 (2008).
- White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62, 232-240 (2013).
- Smith-Bolton, R. K., Worley, M. I., Kanda, H., Hariharan, I. K. Regenerative growth in Drosophila imaginal discs is regulated by Wingless and Myc. Dev. Cell. 16, 797-809 (2009).
- Smith-Bolton, R. Drosophila Imaginal Discs as a Model of Epithelial Wound Repair and Regeneration. Adv. Wound Care. 5, 251-261 (2016).
- Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics. Nat. Rev. Genet. 3, 210-219 (2002).
- Reddien, P. W., Sánchez Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 725-757 (2004).
- Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration. Science. 332, 811-816 (2011).
- Scimone, M. L., Kravarik, K. M., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Neoblast specialization in regeneration of the planarian Schmidtea mediterranea. Stem Cell Reports. 3, 339-352 (2014).
- van Wolfswinkel, J. C., Wagner, D. E., Reddien, P. W. Single-cell analysis reveals functionally distinct classes within the planarian stem cell compartment. Cell Stem Cell. 15, 326-339 (2014).
- Adler, C. E., Seidel, C. W., McKinney, S. A., Sánchez Alvarado, A. Selective amputation of the pharynx identifies a FoxA-dependent regeneration program in planaria. Elife. 3, e02238 (2014).
- Adler, C. E., Sánchez Alvarado, A. PHRED-1 is a divergent neurexin-1 homolog that organizes muscle fibers and patterns organs during regeneration. Dev. Biol. 427, 165-175 (2017).
- Wong, M. C., Martynovsky, M., Schwarzbauer, J. E. Analysis of cell migration using Caenorhabditis elegans as a model system. Methods Mol. Biol. 769, 233-247 (2011).
- Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C elegans chemotaxis assay. J. Vis. Exp. , e50069 (2013).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 177 (2012).
- Tasaki, J., Uchiyama-Tasaki, C., Rouhana, L. Analysis of Stem Cell Motility In Vivo Based on Immunodetection of Planarian Neoblasts and Tracing of BrdU-Labeled Cells After Partial Irradiation. Methods Mol. Biol. 1365, 323-338 (2016).
- Roberts-Galbraith, R. H., Brubacher, J. L., Newmark, P. A. A functional genomics screen in planarians reveals regulators of whole-brain regeneration. Elife. 5, (2016).
- Arnold, C. P., et al. Pathogenic shifts in endogenous microbiota impede tissue regeneration via distinct activation of TAK1/MKK/p38. Elife. 5, (2016).
- Pearson, B. J., et al. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).
- LoCascio, S. A., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Eye Absence Does Not Regulate Planarian Stem Cells during Eye Regeneration. Dev. Cell. 40, 381-391 (2017).
- Nishimura, K., et al. Regeneration of dopaminergic neurons after 6-hydroxydopamine-induced lesion in planarian brain. J. Neurochem. 119, 1217-1231 (2011).
- Wilson, D. F., Chance, B. Azide inhibition of mitochondrial electron transport. I. The aerobic steady state of succinate oxidation. Biochim. Biophys. Acta. 131, 421-430 (1967).
- Duncan, H. M., Mackler, B. Electron Transport Systems of Yeast: III. Preparation and properties of cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 241, 1694-1697 (1966).
- Buchan, J. R., Yoon, J. H., Parker, R. Stress-specific composition, assembly and kinetics of stress granules in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 228-239 (2011).
- Cebrià, F. Organization of the nervous system in the model planarian Schmidtea mediterranea: An immunocytochemical study. Neurosci. Res. 61, 375-384 (2008).
- Shimoyama, S., Inoue, T., Kashima, M., Agata, K. Multiple Neuropeptide-Coding Genes Involved in Planarian Pharynx Extension. Zoolog. Sci. 33, 311-319 (2016).
- Ito, H., Saito, Y., Watanabe, K., Orii, H. Epimorphic regeneration of the distal part of the planarian pharynx. Dev. Genes Evol. 211, 2-9 (2001).
- Bueno, D., Espinosa, L., Baguñà, J., Romero, R. Planarian pharynx regeneration in tail fragments monitored with cell-specific monoclonal antibodies. Dev. Genes Evol. 206, 425-434 (1997).
- Hyman, L. The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria. , McGraw-Hill. (1951).
