Summary
De planarian Schmidtea mediterranea is een uitstekend model voor het bestuderen van stamcellen en weefselregeneratie. Deze publicatie beschrijft een methode om selectief verwijderen van één orgaan, de keelholte, door dieren naar de chemische natriumazide bloot te leggen. Dit protocol wordt ook uitgelegd welke methoden voor de controle van de keelholte regeneratie.
Abstract
Planarians zijn platwormen die uiterst efficiënt bij regeneratie zijn. Ze zijn verplicht deze mogelijkheid om een groot aantal cellen van de stam die snel op elke vorm van schade inspelen kunnen. Gebruikelijke letsel modellen met deze dieren verwijderen grote hoeveelheden weefsel, die meerdere organen aantast. Om te overwinnen deze brede weefselschade, beschrijven we hier een methode voor het selectief verwijderen van een enkel orgaansysteem, de farynx, in het planarian Schmidtea mediterranea. Dit bereiken we door inweken dieren in een oplossing met de cytochroom oxidase remmers natriumazide. Korte blootstelling aan natriumazide veroorzaakt extrusie van de keelholte van het dier, wat wij noemen "chemische amputatie." Chemische amputatie worden verwijderd van de gehele farynx en genereert een kleine wond waar de farynx aan de darm hecht. Na het uitgebreide spoelen, regenereren alle geamputeerde dieren een volledig functionele keelholte in ongeveer een week. De cellen van de stam in de rest van het lichaam rijden regeneratie van de nieuwe farynx. Hier, wij bieden een gedetailleerd protocol voor chemische amputatie, en beschrijven van zowel histologische en gedragsmatige methoden om succesvolle amputatie en regeneratie te beoordelen.
Introduction
Regeneratie is een verschijnsel dat zich voordoet in het dierenrijk, met regeneratieve capaciteiten van volledige lichaam regeneratie in bepaalde ongewervelde dieren tot meer beperkte capaciteiten in gewervelde dieren1. Vervanging van functionele weefsels is een complex proces en vaak met zich meebrengt het gelijktijdige herstel van meerdere celtypen. Bijvoorbeeld om te regenereren de salamander ledemaat, botcellen chondrocyten, neuronen, spieren en epitheliale cellen moeten worden vervangen2. Deze nieuw gegenereerde celtypes moeten ook goed worden georganiseerd om nieuwe functie van de ledematen. Inzicht in deze complexe processen vereist technieken die gericht zijn op herstel van bepaalde celtypen en hun integratie in de organen.
Een van de strategieën ter vereenvoudiging van de studie van regeneratieve reacties in dienst is de gerichte ablatie van hetzij bepaalde celtypen of grotere collecties van weefsels. Bijvoorbeeld, in zebrafish leidt uitdrukking van nitroreductase in specifieke celtypen tot hun vernietiging na toepassing van metronidazol3,4. In Drosophila larven, het uiten van pro-apoptotic genen onder weefsel-specifieke initiatiefnemers bepaalde regio's van de imaginaire schijf5,6selectief lasertherapie. Beide van deze strategieën snelle, maar gecontroleerde schade veroorzaken, en zijn gebruikt voor het ontleden van de moleculaire en cellulaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de regeneratie.
In dit manuscript beschrijven we een methode voor selectief lasertherapie een gehele orgaan de farynx in de planarian Schmidtea mediterraneagenoemd. Planarians zijn een klassieke model van regeneratie, bekend voor hun productieve regeneratieve vermogen, waar zelfs minieme fragmenten kunnen regrow hele dieren 7,8. Ze hebben een grote, heterogene populatie van stamcellen uit zowel pluripotente cellen en lineage-beperkte progenitoren9,10,11. Deze cellen vermenigvuldigen en onderscheid maken ter vervanging van alle ontbrekende weefsel, met inbegrip van de keelholte, zenuwachtig, spijsvertering en uitscheidingsmechanisme systemen, en spier- en epitheliale cellen9,10,12. Terwijl we weten dat deze stamcellen regeneratie start, doen we de moleculaire mechanismen die hen ter vervanging van al deze verschillende soorten cellen rijden niet volledig begrijpen. Gedefinieerde verwonden methoden die de cel van de stam van de precieze antwoorden ontlokken kunnen helpen dit complexe proces af te bakenen.
De keelholte is een grote, cilindervormige buis die nodig zijn voor het voederen en neuronen, spier, epitheliale en secretoire cellen13,29bevat. Normaal gesproken verborgen in een tasje aan de ventrale zijde van het dier, het strekt zich uit door één lichaam van het dier openen na detectie van de aanwezigheid van voedsel. Om selectief amputeren de farynx, genieten we planarians in een chemische genaamd natriumazide, een veelgebruikte verdoving in C. elegans14,15,16. Het gebruik ervan in planarians werd voor het eerst gemeld door Adler et al.., in 201412. Binnen enkele minuten van de blootstelling aan natriumazide planarians extruderen hun pharynges, en met zachte agitatie, de keelholte is losgekoppeld van het dier. We verwijzen naar dit complete en selectieve verlies van de keelholte als "chemische amputatie". Een week na amputatie, is een volledig functionele farynx gerestaureerde12. Omdat de farynx vereist wordt voor het voederen, kan functionele regeneratie worden gemeten door voeding werking te controleren. Hieronder beschrijven we het protocol voor chemische amputatie, en voor de beoordeling van de regeneratie van de farynx en restauratie van het voederen van gedrag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding
-
Bereiding van planaria water 17
- Het handhaven van planarians in een 1 X Montjuïc zout oplossing. Zorg om te bereiden planarian water, individuele voorraadoplossingen van 1 M CaCl2, 1 M MgSO4, 1 M MgCl2, 1 M KCl en 5 M NaCl in ultrazuiver water. Filter-steriliseren met een fles-top filterfor langetermijnopslag van 0,2 µm.
Opmerking: Gebruik alleen ultrazuiver gedeïoniseerd water (met een soortelijke weerstand van 18.2 MΩ bij 25 ° C) te bereiden Montjuïc zouten. - Ter voorbereiding van een voorraad van 1 L van 5 X zoutoplossing, 5 mL van de 1 M CaCl2, 5 mL van de 1 M MgSO4, 0,5 mL van MgCl2, 0,5 mL KCl en 1.6 mL 5 M NaCl oplossingen in 900 mL ultrazuiver water te combineren. Voor deze oplossing, Voeg 0.504 g van NaHCO3 en roer te mengen. Breng de pH op 7.0 met zoutzuur.
- Verdun deze 5 X stockoplossing op een 1 X werken concentratie in ultrazuiver water in een steriele container zoals een grote capaciteit mandfles (Zie de Tabel van de materialen). Gebruik deze 1 X oplossing voor het behoud van ongeslachtelijke planarians.
Opmerking: Als alternatief voor zout oplossing van Montjuïc, lokaal gekocht bronwater of ultrazuiver water met een commercieel beschikbare aquarium zout te gebruiken (Zie Tabel van materialen) mengen om een concentratie of0.5 g/L18. - Handhaven om te voorkomen dat een bacteriële infectie in statische cultuur19, planarians in water met een antibioticum. Een 50 mg/mL stockoplossing van gentamicine sulfaat in ultrazuiver water bereiden en filter-steriliseren. Toevoegen aan containers waarin dieren worden onderhouden, gentamicine sulfaat om een eindconcentratie van 50 µg Mo/mL (1:1000 verdunning).
- Het handhaven van planarians in een 1 X Montjuïc zout oplossing. Zorg om te bereiden planarian water, individuele voorraadoplossingen van 1 M CaCl2, 1 M MgSO4, 1 M MgCl2, 1 M KCl en 5 M NaCl in ultrazuiver water. Filter-steriliseren met een fles-top filterfor langetermijnopslag van 0,2 µm.
-
Voorbereiding van lever plakken
- Zoals planarians op een dieet van biologische gedijen, gras-gevoerd rundvlees lever, koop verse lever en proces binnen 24 h. de membraanachtig capsule inkapselen van de lever door het peeling uit voorzichtig verwijderen. Snijd de lever in ~ 1 cm blokjes, en gebruik een mes om schraap en alle hepatische aders en slagaders negeren.
- Lever stukken met behulp van een voedsel molen of een keukenmachine maceraat en sturen de taak door een zeef met draad mazen voedsel. Combineer in gebak zakken, en afzien in spuiten of 35-mm petrischalen. Voorafgaand aan het voederen van dieren, centrifugeren zachtjes om luchtbellen te verwijderen.
- Opslaan aliquots van lever bij-80 ° C gedurende maximaal een jaar en de dooi voorafgaand aan het gebruiken. Na het ontdooien, opnieuw bevriezen alle overgebleven lever eenmaal of bewaren bij 4 ° C gedurende maximaal 24 uur.
-
Onderhoud van dieren
- Planarians zal groeien en verschrompelen voor verschillende maten, afhankelijk van de frequentie van de voeding. Feed planarians om de andere week (eenmaal elke 14 dagen). Gebruik voor lange termijn bulk culturen, plastic verpakkingen van verschillende grootte (Zie Tabel van materialen).
- Gebruik een metalen spatel of kunststof overdracht Pipetteer om een daling van de erwt-grootte van de lever in een doos om het voederen van dieren. Toestaan dat dieren te eten voor 1-2 h. verwijderen resterende voedsel voor het reinigen van het vak.
- Schoon wormen tweemaal per week als gevoed (eenmaal direct na de voeding en eens twee dagen later), of eenmaal per week, zo niet gevoed. Om te reinigen, afvoer water in een bekerglas van kunststof door zorgvuldig uit het water te gieten met behoud van planarians in het vak. Vak Navegen met een papieren handdoek en herhaal vervolgens aan alle zijden totdat het vak schoon is.
- Vervang water (tot ongeveer ¾ van het vak volume) en gentamicine toevoegen om een eindconcentratie van 50 µg/mL. Dieren in een donkere kast of in een incubator van 20 ° C worden opgeslagen.
-
Selectie van worms
- Selecteer wormen die 5-7 dagen voorafgaande werden gevoed.
Opmerking: Het is aanzienlijk moeilijker te amputeren pharynges van wormen die zijn gevoederd onlangs (1-2 dagen voorafgaand aan de amputatie). Fed dieren zijn ook gevoeliger voor natriumazide. - Selecteer wormen die ongeveer 6 mm lengte zijn. Als u wilt schatten van de omvang van de worm, overbrengen naar een petrischaal met behulp van een precisiepipet kunststof overdracht. Plaats een platte 6 - in-liniaal of 5 x 5 mm-ruitjespapier onder de petrischaal en de worm lengte gemeten terwijl het kruipt.
Opmerking: Wormen kleiner is dan 6 mm in lengte zijn moeilijker te amputeren.
- Selecteer wormen die 5-7 dagen voorafgaande werden gevoed.
-
Voorbereiding van natriumazide
- Bereid een 100 mM-oplossing door het oplossen van natrium azide poeder in planaria water.
Let op: Natriumazide is giftig en voorzichtig moet worden omgegaan. Gooi niet natriumazide in de afvoer. Na gebruik, verzamelen het afzonderlijk voor verwijdering als gevaarlijk afval.
- Bereid een 100 mM-oplossing door het oplossen van natrium azide poeder in planaria water.
2. de farynx amputatie
- Plaats wormen in een 35-mm diameter petrischaal. Verwijder voorzichtig alle planarian water van de schotel met behulp van een pipet kunststof overdracht.
Opmerking: Een maximum van 20 6-mm wormen kan comfortabel worden ondergebracht in een schotel van deze omvang. - Zet de schotel onder de Microscoop en vergroting aanpassen zodat meerdere wormen kunnen gelijktijdig worden weergegeven (bijvoorbeeld 10 X vergroting). Planarian water vervangen door 100 mM natrium azide oplossing.
Opmerking: Voor een 35-mm petrischaal volstaat ongeveer 5 mL natriumazide. De oplossing moet volledig onderdompelen planarians. Volume van de oplossing voor grotere gerechten aanpassen als dit nodig is. - De dieren onder de Microscoop en afzien van het verplaatsen van de schotel voor de eerste 3-4 min toezien.
- Observeren van de extrusie van de keelholte door de Microscoop; de farynx zal uitsteken uit het faryngaal zakje en volledig uit te breiden (ongeveer 1 mm in lengte) zoals aangegeven in figuur 1B.
Opmerking: Het is belangrijk om te wachten totdat de farynx klaar is met volledig voordat u verder uit te breiden. Zodra de farynx uit het dier blijkt, duurt volledig uittrekbaar ongeveer 1 minuut. - Gebruik een plastic overdracht Pipetteer om te spuiten dieren rond de schotel. De dieren in de pipet zuigen en onder dwang laat hen in de schotel een paar keer. Als de keelholte volledig uitgeschoven is, zal dit krachtig pipetteren het veroorzaken om los te maken.
- U kunt ook begrijpen de farynx verticaal langs de lengte of horizontaal langs de omtrek met behulp van een paar fijne pincet (Zie Tabel van materialen) zoals aangegeven in Figuur 1 c. Met de keelholte geknepen in de Tang, til het dier naar boven richting de meniscus. Als het dier wordt verhoogd, zal de oppervlaktespanning de farynx om los van het dier te veroorzaken.
Opmerking: Deze methode kan worden gebruikt voor het verwijderen van de pharynges van kleinere dieren (1-3 mm in lengte) waar het krachtige wervelende is niet voldoende. Vermijd porren of anders verwonden het kadaver van het dier. - Met behulp van een pipet overdracht, geamputeerde dieren naar een nieuwe schotel met verse planaria water verplaatsen.
- Eenmaal overgedragen, spoel geamputeerde dieren grondig in planaria water, volledig uit te wisselen het water drie keer. Overbrengen naar een nieuwe schotel met planaria water met 50µg/mL gentamicine.
Opmerking: Volledige buffer uitwisseling tijdens deze drie wast is essentieel om verwijdering van natriumazide. - De volgende dag, wordt water in de schotel vervangen door verse planaria water met 50 µg/mL gentamicine. Herhaal elke andere dag daarna.
3. beoordeling van de keelholte verwijdering na amputatie
- Dieren onder een microscoop (met 10-20 X vergroting) onderzoeken om te bepalen of een donkere vlek na succesvolle verwijdering van de keelholte, verscheen zoals weergegeven in figuur 2A.
- Als alternatief, repareren en bleekmiddel dieren volgens het protocol beschreven door Pearson et al. 20. soak dieren overnachting in 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) of daar fluorescently-geconjugeerde (1 mg/mL verdund 1:500 in 1 X Phosphate Buffered Saline met 0,3% Triton-X). Mount dieren op dia's in 80% glycerol/20% 1 X Phosphate Buffered Saline en afbeelding onder een fluorescente stereomicroscoop (figuur 2B).
Opmerking: Alle afbeeldingen in dit manuscript waren gevangen op een fluorescerende stereomicroscoop met een 1.0 X-doelstelling.
4. beoordeling van de keelholte regeneratie door het meten van de voeding gedrag
-
Voorbereiding van de lever
- Breng vereiste hoeveelheid lever plakken in een microcentrifuge of een conische buis. Kort draaien om luchtbellen te verwijderen. Schatten van de omvang van de lever, en planaria water toevoegen aan 1/5 van het volume, en 2% van het totale volume in rood voedsel kleuren. Bijvoorbeeld naar 1000 µL van lever plakken, voeg 200 µL van planaria water en 24 µL van voedselkleuring.
- Met behulp van een plastic stamper, Pipetteer tip of metalen spatel, meng totdat voedselkleuring is gelijkmatig verdeeld in de lever plakken. Nogmaals kort draaien. Lever plakken kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 24 uur of bevroren in aliquots bij-80 ° C voor langdurige opslag.
- Als het testen van tot 25 dieren, voorbereiden 25 µL van lever plakken per schotel (ongeveer 1 µL van lever plakken per dier).
-
Voederen van dieren
- Zeven dagen na amputatie aan chemische, dieren overbrengen in een nieuwe petrischaal. Als 10-15 dieren te testen, gebruik een schotel van 35 mm; meer dan 15 dieren moeten worden beproefd in een petrischaal 60 mm. Dieren houden in het donker, ongestoord, gedurende ongeveer 1 uur voorafgaand aan voeding.
- De breedte van een P200 pipette uiteinde met behulp van schaar, vergroten door te korten ongeveer ½ cm off van het smalle einde. Pipetteer 25 µL van rode lever plakken in de schotel.
Opmerking: Trimmen het einde maakt pipetteren de viskeuze lever plakken gemakkelijker. Om te verhinderen dat de lever drijvend op het oppervlak, raak het uiteinde aan de onderkant van de schotel terwijl verstrekking. - Toestaan dat dieren te voeden gedurende 30 minuten.
- Score van het aantal dieren dat hebben gegeten door de dieren op een witte achtergrond plaatst of onderzoeken ze onder een microscoop met 10-20 X vergroting.
- Na het voeding, lever verwijderen uit de schotel en schoon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Blootstelling aan natriumazide verstoort de normale beweeglijkheid van planarians, veroorzaakt door dieren te rekken en te spartelen. Deze bewegingen dwingen de farynx te ontstaan aan de ventrale zijde van het dier, en na ongeveer 6 min in natrium azide oplossing, het witte uiteinde van de keelholte kan worden gezien (figuur 1B-linker paneel). Een paar minuten later, dieren actief contract en de farynx volledig uit te breiden door te krachtig drukken het uit het lichaam. (Figuur 1B-middelste deelvenster). Ongeveer ontspannen 11 min na azide blootstelling, de dieren en de farynx. In dit stadium, de karakteristieke bell-vorm van de keelholte is duidelijk zichtbaar (figuur 1B-rechter paneel). Voor gemakkelijk amputatie is het belangrijk te wachten op de farynx om te ontspannen.
Omdat de keelholte een grote is, resulteert unpigmented massa van weefsel, het verwijderen van het in het uiterlijk van een donkere vlek aan de dorsale zijde van geamputeerde dieren (figuur 2A). Deze donkere regio is een visuele indicator van succesvolle amputatie in levende dieren. De plek is zichtbaar onmiddellijk na amputatie en wordt de volgende dag meer op de voorgrond. Zoals de farynx regenereert, lichter deze regio. Als u wilt controleren farynx regeneratie nauwkeuriger, dieren kunnen worden gekleurd met de DAPI of fluorescently-geconjugeerde daar 's nachts (figuur 2B). Om het kwantitatief beoordelen in hoeverre de farynx regeneratie, kan haar gebied worden gemeten ImageJ softwarematig.
De keelholte is een essentieel orgaan voor chemosensation en voedsel inname. Om te bepalen wanneer deze functies zijn hersteld tijdens regeneratie, gebruikt wij voeding testen om te controleren van dierlijk gedrag. Door het combineren van voedsel kleuren met lever paste, konden we dieren die aten onderscheiden die deed niet (figuur 3A). We dan het aantal rode dieren te beoordelen van het percentage dieren met een functionele farynx gekwantificeerd. Op basis van de resultaten die worden weergegeven in figuur 3B, werd succesvolle voeding gedrag gerestaureerd 7 dagen na amputatie, die aangeeft dat een week na de verwijdering van de keelholte, dieren hebben opnieuw gegenereerd een functionele farynx. Om te testen of natrium azide blootstelling voeding gedrag beïnvloed, we dieren gedrenkt in natriumazide maar het uitgewassen onmiddellijk voorafgaand aan de farynx uitwerpen. Een dag later, we geëvalueerd of voedsel-seeking gedrag werd gewijzigd door natrium azide blootstelling met de voeding assay. In tegenstelling tot chemisch geamputeerd dieren ontbreekt een keelholte, alle dieren behouden van een intact farynx na natrium azide blootstelling aten (n = 30 dieren voor elke voorwaarde) het voedsel. Dit resultaat geeft aan dat natrium azide blootstelling geen afbreuk doet aan de voeding gedrag, zolang de farynx intact blijft.
Figuur 1 . Keelholte uitwerpen en amputatie. (A) schema van de planarian anatomie. (B) beelden van levende dieren tonen farynx uitwerpen op onderdompelen in 100 mM natriumazide. Rode pijlen wijzen farynx. Schaal bars = 750 µm. (C) beeld van levende dieren (links) en schema (rechts) van amputatie met pincet. Panelen tonen twee verschillende opties voor de farynx aangrijpend. Ventrale zijde van het dier gezichten omhoog. Schaal bars = 500 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Beoordeling van farynx amputatie en regeneratie. (A) representatieve beelden van levende dieren op bepaalde tijden voor en na de amputatie. Middelste paneel toont donkere vlek faryngaal regio na amputatie, gemarkeerd door onderbroken witte doos. Dorsale zijde gezichten omhoog. Schaal bars = 500 µm. (B) representatieve foto's van dieren gekleurd met Alexa488-daar op bepaalde tijden voor en na de amputatie. Middelste paneel toont gebrek aan farynx na amputatie. Faryngaal regio benadrukt door witte doos. Ventrale zijde gezichten omhoog. Schaal bar = 500 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Evaluatie van de keelholte regeneratie. (A) beelden en schematische assay, uitgevoerd door het plaatsen van 25 µl van lever in het midden van een 60 mm petrischaal te voeden. Schema (boven, links) en beeld (midden) Toon voeding gedrag bij dieren met intact pharynges. Juiste, afbeelding bovenz─│de van dier dat heeft gegeten. Schema (linksonder) en beeld (midden) 1 dag na amputatie gedrag bij dieren te voeden. Onderaan rechts, dier dat niet heeft gegeten. Schaal bar = 750 µm. (B) resultaten van voeding assay. Percentage van de dieren die voedsel (gekwantificeerd door rode kleuring) op bepaalde tijdstippen na amputatie hebben ingenomen. Voor elk punt van de tijd, n = 10 dieren, herhaald in drievoud. Foutbalk = SD. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een methode voor selectief ablatie van de farynx met behulp van natriumazide. Andere gerichte ablatie studies in planarians hebben gemodificeerde chirurgie tweedehands voor wegnemen researchdieren21 of farmacologische behandeling lasertherapie Dopaminerge neuronen22. Een belangrijk voordeel van chemische amputatie over bestaande methoden is dat het vereist geen chirurgie. De rigide structuur van de farynx vergeleken met de rest van het lichaam planarian vergemakkelijkt zijn volledige verwijdering van het dier, dat veel zachter-bodied is. De keelholte is ook losgekoppeld van het dier op een kleine junction (de slokdarm)30 samen met de keelholte en de darm, het genereren van een meer reproduceerbare wond dan één geïnduceerd door een grotere chirurgische instrument. Gebaseerd op de fysieke eigenschappen en kleine anatomische koppeling aan de rest van het dier, keelholte verwijdering daarom genereert meer homogene wonden dan andere chirurgische amputaties.
Lengte van blootstelling aan natriumazide is ook cruciaal voor het succes van deze techniek. Hoewel korte blootstelling aan natriumazide planarians niet nadelig beïnvloedt, langdurige blootstelling is giftig en zal uiteindelijk doden dieren. Natriumazide is bekend dat remt energie-afhankelijke processen door middel van remming van cytochroom oxidase23,24. Bovendien, onderdrukt het transcriptie en vertaling, waarschijnlijk door opeenhoping van essentiële onderdelen van deze reacties in stress korrels25. In planarians onderdrukt natrium azide blootstelling mitose voor 24u, waarna cellen proliferatie12 hervatten. Wijzigingen, zoals het tijdstip van azide blootstelling te beperken, verwijderen van azide met grondig spoelen, en de boekhouding voor de voorbijgaande mitotische onderdrukking in proefopzet kan helpen deze beperkingen te overwinnen.
De unieke anatomische positie van de farynx en haar karakteristieke radiaal symmetrie toestaan voor het gemakkelijk onderscheid van nieuw geregenereerde faryngaal weefsel uit reeds bestaande cellen van de stam. Regeneratie van de keelholte kan worden gecontroleerd op het niveau van het cellulaire en anatomische met behulp van weefsels-vlekken zoals daar en DAPI, immunohistochemistry, of door in situ hybridisatie26. De voeding assay beschreven hier testen functionele herstel van de keelholte. Chemotaxis naar voedsel vereist de farynx27,28 en dieren zonder een volledig functionele farynx voedsel kunnen niet inslikken. Deze eenvoudige, kwantitatieve beoordeling van orgaanfunctie is dus een aanvulling op structurele regeneratie. Bovendien, chemische amputatie kan worden uitgevoerd op de populaties van dieren, en talloze dieren met identieke verwondingen kan genereren. De procedure is daarom geschikt voor grootschalig onderzoek. Deze voordelen, in combinatie met het feit dat herstel van een volwassen farynx stamcellen vereist, maakt farynx amputatie een ideaal model om te studeren orgel regeneratie. Gebruikt in combinatie met bredere amputaties, kan keelholte verwijdering worden gebruikt om hypothesen over de invloed van grootte van de wond en anatomische positie op de cel van de stam reactie op schade, die een sleutelvraag in de regeneratie veld21 iste toetsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zouden graag bedanken Alejandro Sánchez Alvarado, die zich aansluit bij de eerste optimalisatie en de ontwikkeling van deze techniek. Werk in Carolyn Adler van laboratorium wordt ondersteund door Cornell University start-up middelen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Chemical | C79-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | Fisher Chemical | M65-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2) | Acros/VWR | 41341-5000 | Montjuïc salt solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Acros Organics/VWR | 196770010 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Chloride (NaCl) | Acros Organics/VWR | 207790050 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Acros Organics/VWR | 123360010 | Montjuïc salt solution |
| Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot | ThermoFisher Scientific/VWR | 2324-0015 | Storing planaria water |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands | Amazon | Planaria water |
| Gentamicin Sulfate | Gemini Bio-products | 400-100P | Planaria water |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Mincing liver |
| Disposable pastry bags-16”, 12 pack | Wilton | Amazon | Liver aliquots |
| 5 mL syringes | BD/VWR | 309647 | Liver aliquots |
| Petri dishes-35mm/60mm | Greiner Bio-One/VWR | 82050-536/82050-544 | |
| Plastic containers (various sizes) | Ziploc | Amazon | Housing planarians in static culture |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Transfer pipette | Globe Scientific | 138030 | |
| Forceps - Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D (0203-5-PO) | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62247 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 |
References
- Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).
- Tanaka, E. M. The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration. Cell. 165, 1598-1608 (2016).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat. Protoc. 3, 948-954 (2008).
- White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62, 232-240 (2013).
- Smith-Bolton, R. K., Worley, M. I., Kanda, H., Hariharan, I. K. Regenerative growth in Drosophila imaginal discs is regulated by Wingless and Myc. Dev. Cell. 16, 797-809 (2009).
- Smith-Bolton, R. Drosophila Imaginal Discs as a Model of Epithelial Wound Repair and Regeneration. Adv. Wound Care. 5, 251-261 (2016).
- Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics. Nat. Rev. Genet. 3, 210-219 (2002).
- Reddien, P. W., Sánchez Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 725-757 (2004).
- Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration. Science. 332, 811-816 (2011).
- Scimone, M. L., Kravarik, K. M., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Neoblast specialization in regeneration of the planarian Schmidtea mediterranea. Stem Cell Reports. 3, 339-352 (2014).
- van Wolfswinkel, J. C., Wagner, D. E., Reddien, P. W. Single-cell analysis reveals functionally distinct classes within the planarian stem cell compartment. Cell Stem Cell. 15, 326-339 (2014).
- Adler, C. E., Seidel, C. W., McKinney, S. A., Sánchez Alvarado, A. Selective amputation of the pharynx identifies a FoxA-dependent regeneration program in planaria. Elife. 3, e02238 (2014).
- Adler, C. E., Sánchez Alvarado, A. PHRED-1 is a divergent neurexin-1 homolog that organizes muscle fibers and patterns organs during regeneration. Dev. Biol. 427, 165-175 (2017).
- Wong, M. C., Martynovsky, M., Schwarzbauer, J. E. Analysis of cell migration using Caenorhabditis elegans as a model system. Methods Mol. Biol. 769, 233-247 (2011).
- Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C elegans chemotaxis assay. J. Vis. Exp. , e50069 (2013).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 177 (2012).
- Tasaki, J., Uchiyama-Tasaki, C., Rouhana, L. Analysis of Stem Cell Motility In Vivo Based on Immunodetection of Planarian Neoblasts and Tracing of BrdU-Labeled Cells After Partial Irradiation. Methods Mol. Biol. 1365, 323-338 (2016).
- Roberts-Galbraith, R. H., Brubacher, J. L., Newmark, P. A. A functional genomics screen in planarians reveals regulators of whole-brain regeneration. Elife. 5, (2016).
- Arnold, C. P., et al. Pathogenic shifts in endogenous microbiota impede tissue regeneration via distinct activation of TAK1/MKK/p38. Elife. 5, (2016).
- Pearson, B. J., et al. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).
- LoCascio, S. A., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Eye Absence Does Not Regulate Planarian Stem Cells during Eye Regeneration. Dev. Cell. 40, 381-391 (2017).
- Nishimura, K., et al. Regeneration of dopaminergic neurons after 6-hydroxydopamine-induced lesion in planarian brain. J. Neurochem. 119, 1217-1231 (2011).
- Wilson, D. F., Chance, B. Azide inhibition of mitochondrial electron transport. I. The aerobic steady state of succinate oxidation. Biochim. Biophys. Acta. 131, 421-430 (1967).
- Duncan, H. M., Mackler, B. Electron Transport Systems of Yeast: III. Preparation and properties of cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 241, 1694-1697 (1966).
- Buchan, J. R., Yoon, J. H., Parker, R. Stress-specific composition, assembly and kinetics of stress granules in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 228-239 (2011).
- Cebrià, F. Organization of the nervous system in the model planarian Schmidtea mediterranea: An immunocytochemical study. Neurosci. Res. 61, 375-384 (2008).
- Shimoyama, S., Inoue, T., Kashima, M., Agata, K. Multiple Neuropeptide-Coding Genes Involved in Planarian Pharynx Extension. Zoolog. Sci. 33, 311-319 (2016).
- Ito, H., Saito, Y., Watanabe, K., Orii, H. Epimorphic regeneration of the distal part of the planarian pharynx. Dev. Genes Evol. 211, 2-9 (2001).
- Bueno, D., Espinosa, L., Baguñà, J., Romero, R. Planarian pharynx regeneration in tail fragments monitored with cell-specific monoclonal antibodies. Dev. Genes Evol. 206, 425-434 (1997).
- Hyman, L. The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria. , McGraw-Hill. (1951).
