Article de méthode

Size Matters : Mesure du diamètre de la Capsule à Cryptococcus neoformans

DOI :

10.3791/57171

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27 février 2018

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1Department of Biology, Middle Tennessee State University, 2DRVision Technologies

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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La capsule de polysaccharide est le facteur de virulence primaire à Cryptococcus neoformans, et sa taille est corrélé avec la virulence de la souche. Mesures de diamètre capsule sont utilisées dans les tests phénotypiques et d’évaluer l’efficacité thérapeutique. Une méthode standard d’induction capsule est présentée ici, et on a comparé deux méthodes de coloration et de mesurer le diamètre.

Résumé

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La capsule de polysaccharide de Cryptococcus neoformans est le facteur de virulence primaire et un des plus couramment étudié les aspects de cette levure pathogène. Taille de la capsule peut varier considérablement entre les souches, a la capacité de croître rapidement lorsque vorstellen conditions nutritives stressantes ou faibles et a été positivement corrélée avec la virulence de la souche. Pour ces raisons, la taille de la capsule est d’un grand intérêt pour les chercheurs de c. neoformans . La croissance de la capsule de c. neoformans est induite pendant le test phénotypique pour aider à comprendre les effets des différents traitements sur les différences de levure ou de taille entre les souches. Nous décrivons ici une des méthodes standards de capsule induction et comparer deux méthodes de coloration et de mesurer le diamètre de la capsule : (i) de l’encre de Chine, un colorant négatif, utilisé en conjonction avec la microscopie optique conventionnelle et (ii) coloration conjointement avec colorants fluorescents de la paroi cellulaire et capsule suivie par microscopie confocale. Enfin, nous montrons comment la mesure du diamètre capsule des échantillons colorés à l’encre de Chine peut être automatisé en utilisant l’analyse de l’image numérique.

Introduction

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Affectant un quart de million de personnes chaque année et qui ont fait plus de 180 000 morts chaque année, Cryptococcus neoformans est une levure pathogène intracellulaire et l’agent causal de la cryptococcose1,2, 3. les plus durement touchées sont les patients séropositifs dans les pays pauvres qui n’ont pas facilement accès aux traitements antirétroviraux, ce qui les rend extrêmement sensibles à la maladie4,5,6. Les données de la CDC indiquent qu’en Afrique subsaharienne<....

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Protocole

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Remarque : C. neoformans est un pathogène de niveau de biosécurité 2 (BSL-2) et les chercheurs qui travaillent avec elle doivent prendre des précautions appropriées. Des procédures détaillées sur comment à en toute sécurité travail avec BSL-2 pathogènes se trouvent sur le Center for Disease Control (CDC), site Web, mais il est important de noter que toutes les personnes entrant en contact avec c. neoformans soient correctement formés à la manipulation agents pathogènes et doivent toujours porter approprié équipement de protection individuelle (EPI), généralement au latex ou des gants en nitrile. En outre, rotors sur les centrifugeuses doivent être ét....

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Résultats

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Pour illustrer la capsule induction, coloration de la cellule, imagerie et techniques de mesure, nous avons utilisé trois souches de c. neoformans : souche le laboratoire commun, bien caractérisé, H99S30, ainsi que deux souches isolées sur le plan clinique de précédemment diamètre capsule inconnue, B18 et B5231.

Le workflow de capsule induction, coloration et acquisition d.......

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Discussion

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Pendant des décennies, la capsule a été un élément majeur de la recherche pour les mycologues et les cliniciens intéressés par c. neoformans et cryptococcose en raison de son rôle comme un facteur de virulence important pour l’agent pathogène. En utilisant la microscopie à mesurer les différences dans la taille de la capsule entre les souches et en vertu de la croissance de différente conditions peuvent fournir des informations importantes concernant l’agent pathogène et ses réponses aux divers stimuli (c.-à.......

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Déclarations de divulgation

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L’auteur, Hoyin Lai, est le chef de produit chez connaissance qui édite le logiciel d’analyse automatique d’image, Aivia.

Remerciements

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Nous remercions le programme doctoral de Biosciences moléculaires (MOBI) et le département de biologie à Middle Tennessee State University (MTSU) pour assurer le financement de cette étude. Le projet est également financé en partie par une subvention de projets spéciaux à recevoir par la Fondation MTSU.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Capsule Induction
C. neoformans cellsLa souche de laboratoire clinique, H99S, était un cadeau aimable du Dr John Perfect (Duke University).  ; Les souches cliniques, B18 et B52, ont été offertes par le Dr Greg Bisson (Université de Pennsylvanie).
Bouillon de dextrose peptone de levure (YPD)Fisher ScientificDF0428-17-5
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Ceci est fabriqué en laboratoire à l’aide d’une recette standard (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)
DMEM/hyperglucose avec L-glutamine, sans pyruvate de sodiumGE Life SciencesSH30022.01
Plaques à 6 puitsFalconCL5335-5EA
Incubateur à secoussesThermo Scientific  ;MaxQ6000
Incubateur CO2Fisher ScientificIsotemp
CentrifugeuseThermo ScientificLegend XTR
Staining
MicrocentrifugeuseThermo ScientificLegend Micro 21R
Encre de ChineFisher Scientific14-910-56
Calcofluor blancSigma-Aldrich18909-100ML-F
18B7 anticorps anti-GXM de souris conjugué à Alexafluor 488Un aimable cadeau du Dr Arturo Casadevall (Université Johns Hopkins)  ;
PBS avec 1 % d’albumine sérique bovine (BSA)Le PBS est la même recette que celle indiquée ci-dessus (ligne 4) avec 1 % de BSA ajouté et stérilisé par filtre.
Albumine sérique bovineSigma-AldrichA9418
Lames de microscope SuperfrostFisher Scientific12-550-143
Lamelles en verreCorning2855-18#1.5 épaisseur
ongles transparent ou autre produit
acquisition d’images  ;
Huile d’immersionCargille  ;16484
Microscope optique avec objectif à immersion dans l’huileZeissZeiss Axio A1 avec plan - NEOFLUAR 100x immersion dans l’huile Objectif NA 1.30
Caméra de microscope optiqueZeissZeiss Axiocam ErCD
Microscope confocal avec objectif à immersion dans l’huileZeissLSM 700 Confocal à balayage laser équipé d’un objectif à immersion dans l’huile Plan-Apochromat 63X NA 1.4 DIC M27. nbsp ;
Logiciel de microscope confocalZen 2009
Appareil photo microscope confocalNikonNikon Ti-Eclipse avec un illuminateur d’épifluorescence Intensilight (Nikon), appareil photo microscope CoolSNAP MYO (photométrie), objectif à immersion dans l’huile Plan Apo 60x NA 1.40 (Nikon) et changeur de grossissement 1.5x.  ;
Logiciel d’imagerie grand champNikon Elements (Nikon)
Capsule Measurement
Logiciel de retouche d’imagesPhotoshop (Adobe)
Logiciel de microscope pour la mesure manuelleAxiovision (Carl Zeiss)
Logiciel d’analyse d’images pour la mesure automatiséeAivia (DRVision Technologies)
TableurExcel (Microsoft)
Vernis à d’étanchéité non toxique

Références

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  1. Park, B. J., et al. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
  2. Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The intracellular life of Cryptococcus neoformans. Annu Rev....

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Mots-clés

Cryptococcus neoformansCapsule DiameterIndia Ink StainingFluorescent Dye StainingConfocal MicroscopyLight MicroscopyAutomated Image AnalysisCapsule InductionYeast Cell MeasurementZ Stack Imaging

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