הערכת עוצמת סביבתיים כימיקלים, תרופות, להיות enzymatically bioactivated כדי intermediates יצירת DNA קוולנטיות adducts, הוא שדה חשוב בהתפתחות של סרטן וטיפול שלה. שיטות מתוארים עבור הפעלת מתחם לטופס שה-DNA adducts, כמו גם טכניקות שלהם זיהוי, כימות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
היווצרות קשרי ערכיות דנ א Adducts על ידי חומרים מסרטנים Enzymatically מופעל, סמים במבחנה ונחישות שלהם על ידי 32P-postlabeling
במאמר זה
סיכום
תקציר
DNA קוולנטיות adducts שהוקמה על ידי כימיקלים או סמים עם העוצמה מסרטנים נשפטים כאחד הגורמים החשובים ביותר בשלב הייזום של תהליכים מסרטנים. איגוד קוולנטיות זה, הנחשב הגורם tumorigenesis, עכשיו מוערך של הדוגמה המרכזית של carcinogenesis כימי. כאן, שיטות מתוארים העסקת את התגובות על ידי ציטוכרום P450, אנזימים ביואמסה נוספים כדי לחקור את העוצמה של כימיקלים או סמים עבור ההפעלה שלהם כדי מטבוליטים ויוצרים את הדנ א הללו adducts. ההליכים מוצגים המתארים את ניתוקה של שברים הסלולר הפו אנזימים ביואמסה (microsomal cytosolic דגימות עם cytochromes P450 או אחרים ביואמסה אנזימים, קרי, peroxidases, nadph ל: ציטוכרום P450 oxidoreductase, oxidoreductase H:quinone NAD (P) או xanthine אוקסידאז). יתר על כן, מתוארות שיטות זה יכול לשמש עבור ההפעלה מטבולית של כימיקלים שנותחה על ידי אנזימים אלה, כמו גם עבור בידוד של דנ א. עוד יותר, השיטות המתאימות מסוגל זיהוי וכימות DNA כימית/סמים-נגזר adducts, דהיינו, שינויים שונים של הטכניקה P-postlabeling 32, העסקתם של רדיואקטיבי שכותרתו ניתח כימיקלים, הם מוצגים בפירוט.
מבוא
חילוף החומרים של ואינטראקציות (כימיקלים סביבתיים או תרופות) מתרחשת בשני שלבים1. שלבים I ו- II במטרה להבהיר את תרכובות הידרופוביות במקור (לא מסיסים במים) יותר הידרופילית (מסיסים במים), ובכך הופך אותם excretable בקלות באמצעות שתן, צואה או זיעה. שלב I (functionalization) תגובות כוללים חמצון, הפחתה, ו hydroxylation מזורז על ידי אנזימים כגון ציטוכרום P450s (P450s, CYPs), peroxidases (כלומר., cyclooxygenase, קוקס), אלדו-keto reductases (AKRs), ו microsomal פלווין המכילים monooxygenases (FMOs). שלב אני כולל גם הפחתת תגובות, מתווכת על ידי מגוון רחב של reductases דהיינו microsomal nadph ל: ציטוכרום P450 רדוקטאז (POR) ו- NAD (P) cytosol....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בוצעו בהתאם לכללים על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה (311/1997, משרד החקלאות, צ'כיה), אשר תואם הצהרת הלסינקי.
1. בידוד של הכבד שברים Microsomal ו- Cytosolic
- הכן שברים subcellular הכבד (microsomes עשיר אנזימי P450 או cytosols עשיר reductases או peroxidases מסיסים) של חולדות באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית פשוטה (שהם 105,000 x g).
הערה: צניפה ואת תגובת שיקוע נלקחים כמו microsomes ו- cytosols, בהתאמה.- לשטוף את הדגימות הכבד (1-10 גרם) פעמיים עם מאגר 50 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4 המכיל 150 מ מ מאגר אשלגן כלורי (מאגר 1) (10 פעמים גבוה יותר אמצעי אחסון מאשר משקל של הרקמה, דהיינו 10-100 מ ל) ואת הרקמות לחתי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות פרוטוקולים המתוארים כאן על הניצול של הפעלת מזורז-אנזים (קרי, P450, peroxidase, רדוקטאז) לחקור את העוצמה של כימיקלים (חומרים מסרטנים/תרופות) כדי להיות מטבוליזם כדי intermediates וכתוצאה מכך קוולנטיות שלהם איגוד ה-DNA (דור של דנ א adducts), היינו מסוגלים לפתור (i) מנגנון של פעילות פרמקולוגית ellipticine הסוכן נגד סרטן (עבור סקירה ראה,29,30,31), (ii) האטיולוגיה של שניים nephropathie.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בנייר זה, הוכח מתודולוגיה נרחב נגיש ללמוד את העוצמה של כימיקלים להיות bioactivated כדי intermediates מטבולית, וכתוצאה מכך הדור ה-DNA קוולנטיות adducts. זה הוא נושא קריטי, כי הערכה של עוצמת כימיקלים סביבתיים או סמים של הפעלת אנזימטי שלהם כדי מטבוליטים יצירת DNA קוולנטיות adducts הוא שדה חשוב בהתפתחות של סרטן וטיפול שלה. השינוי של ה-DNA על ידי חומרים מסרטנים נחשב הגורם התפתחות גידולים עכשיו נשפטת כמו הדוגמה המרכזית של carcinogenesis הנגרמת על ידי חומרים מסרטנים. הצעה זו אושר על ידי מגוון רחב של ממצאים, כגון התופעה זה: (i) .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחבר אין לחשוף.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי קרן המדע הצ'כית (GACR, גרנט 17-12816S).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Tris | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| אשלגן כלורי | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| נתרן אצטט | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| פנול | רוט | 0032.8 | |
| פנול/כלורופורם/איזואמילאלכוהול | רוט | A156.1 | |
| אתנול | פנטה | 70390-11000 | |
| עגל תימוס DNA | סיגמא-אולדריץ | ' D4522 | |
| NADH | סיגמא-אולדריץ' | N7004 | |
| NADP+ | סיגמא-אולדריץ' | N5755 | |
| NADPH | סיגמא-אולדריץ' | N7505 | |
| D-גלוקוז 6-פוספט | סיגמא-אולדריץ' | ||
| 6-פוספט דהידרוגנאז | Sigma-Aldrich | G6378 | |
| Supersomes | Corning Gentest | 456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202 | |
| מיקרוזומי כבד אנושי | Corning Gentest | 452172 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | 77662 | |
| 2-Hydroxypyrimidine | Sigma-Aldrich | H56800 | |
| אתיל אצטט | סיגמא-אולדריץ' | 437549 | |
| אתר דיאתיל | סיגמא-אולדריץ' | 179272 | |
| נוקלאז מיקרוקוקלי מ-Staphylococcus aureus | Sigma-Aldrich | N3755 | |
| טחול פוספודיאסטראז מטחול עגל, סוג II | Calbiochem | 524711 | |
| נוקלאז P1 מ-פניציליום ציטרינום | סיגמא-אולדריץ' | N8630 | |
| ביסין | סיגמא-אולדריץ' | 163791 | |
| DL-דיתיוטרייטול | סיגמא-אולדריץ' | D0632 | |
| ספרמידין | סיגמא-אולדריץ' | S2626 | |
| טטרה-בוטילאמוניום כלוריד | סיגמא-אולדריץ' | 86870 | |
| n-בוטנול | סיגמא-אולדריץ' | 437603 | |
| T4-פולינוקלאוטיד קינאז | USB Corp | 70031Y | |
| [γ-32P]ATP | Hartman Analytic GmbH | FP-201 | |
| לוחות TLC ספוגים PEI תאית | Macherey-Nagel | 801053 | |
| Packard Instant Imager A202400 | Packard | G120337 | |
| Ellipticine | Sigma-Aldrich | 285730 | |
| 3-Nitrobenzanthrone | מוכן (מסונתז) כפי שמוצג בהפניה 40 |
מקורות
- Croom, E. Metabolism of xenobiotics of human environments. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).
- Guengerich, F. P. Common and uncommon cytochrome P450 reactions related to metabolism and chemical toxicity. Chem. Res. Toxicol. 1....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
