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方法文章

高通量鉴定协同药物组合的Overlap2方法

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DOI：

10.3791/57241

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2018年5月21日

 , 
1Microbiology and Immunology Division, Department of Pathology, University of Utah

本文内容

摘要

协同药物组合通过实验方法鉴定往往困难且耗时。本文中，我们描述了一种用于鉴定和验证协同作用小分子的方法。

摘要

尽管抗菌药物显著延长了20世纪以来人类的寿命并提高了生活质量th 21世纪，抗菌药物耐药性威胁着全社会治疗全身性感染的能力。仅在美国，每年就有约23,000人死于抗生素耐药性感染，额外增加约200亿美元的医疗支出。应对抗菌药物耐药性的一种策略是联合疗法，这种疗法在感染早期尤为有用，此时致病微生物及其耐药谱尚未明确。许多抗菌治疗采用联合用药方案。然而，这些组合大多为相加作用，即联合疗效等于各抗生素单独疗效之和。部分联合疗法具有协同作用，即联合疗效远超相加效应。协同组合特别有价值，因为它们能够抑制耐药菌株的生长。然而，这类协同组合较为罕见且难以发现，原因在于需要两两测试的分子数量极为庞大：一个包含1,000个分子的文库可产生100万种潜在组合。因此，研究人员已致力于开发预测分子协同作用的方法。本文介绍我们用于预测协同小分子对的高通量方法，称为Overlap2 方法（O2M）。O2M利用化学遗传学数据集中的模式，识别对协同作用分子对中的每个分子表现出特异性生长抑制的突变株，而对其他分子无此反应。布朗实验室通过高通量筛选抑制突变株生长但不影响野生型细胞生长的分子，利用这种生长差异。该实验室此前已利用此策略鉴定出与抗生素甲氧苄啶及抗真菌药物氟康唑产生协同作用的分子。本文中，作者提出一种用于筛选新型协同作用组合的方法，该方法可适用于多种微生物。

引言

根据美国疾病控制与预防中心（CDC）的数据，每年由抗生素耐药性细菌引起的感染超过200万例，导致23,000人死亡1。为应对这些感染，亟需开发新的治疗方法。目前探索新疗法的策略包括研发新型抗菌药物，或将已获批用于其他疾病的药物重新用于治疗微生物感染2,3,4。然而，新药研发成本高昂且耗时漫长。药物再利用策略可能无法发现全新的药物或药物靶点5,6。本实验室专注于第三种策略，即协同组合疗法。当两种小分子联合使用时的疗效超过其各自单独疗效的相加效应时，即产生协同作用7。此外，协同组合不仅对其中一种小分子耐药的病原体仍可能有效，而且具有更少的非预期脱靶效应，因而展现出巨大的应用潜力8,9,10。

协同作用的药物组合较为罕见，仅占所有药物组合的大约4-10%11,12,13因此，传统的两两筛选等技术具有挑战性且耗时，仅由一百种分子组成的小型文库就可能产生数千种组合。此外，化合物的单独活性通常无法预测其协同作用。14然而，作者开发了一种高通量筛选协同作用配对的方法，称为重叠法2 方法（O2M）12该方法在此处进行描述，可实现对这些协同配对更快、更高效的识别。O2M方法需要利用已知的协同配对以及化学遗传学数据集。化学遗传学数据集的生成方式是：在多种不同小分子存在条件下培养一系列基因敲除突变体文库。如果已知协同配对中的一个分子，与第二个协同分子在特定基因敲除突变体中诱导出相同的表型，那么任何其他能从该相同突变体中引发该表型的小分子，也应与已知协同配对中的每个成员产生协同作用。布朗实验室已采用这一原理，用于鉴定对病原体具有活性的协同抗生素配对 大肠杆菌（Escherichia coli） 以及对致病性真菌具有协同抗真菌作用的药物组合 新型隐球菌 (C. neoformans)11,12O2M 不仅适用于多种病原体，还可用于大规模分子文库的筛选，以快速、简便地鉴定协同作用的分子对。利用 O2M 鉴定出的遗传突变体进行筛选，可使我们仅针对预测具有协同效应的小分子进行验证。因此，若对一个包含 2,000 种分子的文库进行两两组合测试，可能需要数月时间；而若该文库中仅有 20 种分子被预测具有协同作用，则协同效应的验证仅需数天即可完成。O2M 无需编程技能，所需设备在大多数实验室或核心设施中均具备。除了关注药物组合的研究人员外，任何已完成药物筛选并希望通过对重要药物-药物相互作用的识别来拓展其筛选结果的研究者，均可受益于 O2M 分析。以下是用于在细菌中鉴定协同作用小分子，以及在已知的常用实验中验证预测协同作用的实验方案15,16.

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方案

1. 通过重叠分析从化学生物学遗传数据集中鉴定协同作用预测突变体2 方法（O2M）

注意：本方法用于利用 Nichols 发表的数据集鉴定协同作用预测突变体 等.17 在 E. coli然而，该方法可应用于任何化学遗传学数据集及微生物。这些数据集包含一个在超过100种小分子存在下培养的基因敲除突变体文库，为每种小分子中的每个突变体提供定量的生长评分。必须已知一对具有协同作用的小分子组合，且数据集中应包含这两种小分子各自的生长评分。

  1. 计算所有突变体在单一浓度小分子存在下生长的平均生长评分及标准差。
    注意：此步骤可使用任意电子表格软件完成。Brown 实验室使用 Excel，并采用函数 =AVERAGE(B3:B3981) 和 =STDEV(B3:B3981) 计算每列小分子的数据。
    1. 计算每列小分子的均值和标准差，不过如果使用不同的数据集，此方向可能会有所不同。
  2. 使用 Nichols 的相同数据集计算小分子各浓度的 Z 值 等.17 在电子表格程序中进行计算。其中，负z分数表示为 Z(2.5) = 均值 - 2.5 × 标准差，正z分数表示为 Z(2.5) = 均值 + 2.5 × 标准差。
  3. 确定哪些基因突变体在构成已知协同作用配对的小分子中具有显著的 Z 值，务必查看这些小分子的所有浓度。若某突变体的生长评分低于该小分子的负 Z 值（2.5）或高于正 Z 值（2.5），则视为显著。
  4. 确定任何显著的基因突变是否属于一个操纵子。
    注意：对于 E. coli作者建议查阅“Ecoli wiki”，以获取有关基因是否作为多顺反子RNA的一部分进行转录的信息。
  5. 鉴定在不同浓度下对多数目标小分子化合物均共同涉及的基因/操纵子突变体例如在寻找与抗生素甲氧苄啶协同作用的分子时，可鉴定在甲氧苄啶及其已知协同伙伴（如磺胺甲噁唑或磺胺甲噻唑）存在下生长时表现出显著Z分数的突变株。这些突变株为潜在的协同作用预测突变株。

2. 通过 O2M 在化学遗传学数据集中预测协同剂

  1. 返回数据集17，确定每种能够从协同作用预测突变体中引发显著生长评分的小分子浓度。此过程通过查看为每种小分子浓度计算的 Z 分数来完成。同样，显著的生长评分是指小于该小分子浓度对应的负 Z 分数或大于正 Z 分数的值。
    注意：如果某分子在其任一浓度下出现，则该分子被视为预测的协同剂；任何未能引发显著生长评分的分子则被视为预测的非协同剂。

3. 预测协同作用的验证

  1. 测定预测协同剂的最低抑菌浓度（MIC）。
    1. 培养一夜间培养物 E. coli 在M9最低培养基中 37 °C.
      注意：任何过夜培养物均可在适合目标生物的明确定义的培养基中培养。Brown 实验室不推荐使用 LB 或 YPD 等营养丰富的培养基。M9 最小培养基的成分为 10.5 g/L M9 肉汤、0.2% 酪蛋白氨基酸（casamino acids）、0.1 M CaCl₂、1 M MgSO₄，以及 2% 葡萄糖。2，0.4% 葡萄糖，1 M MgSO₄4，0.25% 烟酸和 0.33% 硫胺素在 H2O.
    2. 若在收到小分子化合物时，文献中未找到目标病原体的最小抑菌浓度（MIC）数据，可将其溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成高浓度溶液>10 mg/mL
    3. 使用96孔板，加入 100 µL 向每个孔中加入 M9 培养基。额外添加一份 100 µL M9 培养基在第 1 列中，使其总共含有 200 µL.
    4. 加入任意量（约10 µL第1列中加入小分子浓缩溶液（每孔一种小分子，每板8种小分子）。
      注意：这些是受关注的小分子，据预测可产生协同作用。Brown 实验室通常会添加 10 µL 高浓度小分子溶液，其浓度低于可产生抑制作用的100% DMSO量 E. coli.
    5. 加入小分子后，沿培养板的 x 轴方向稀释小分子。取 100 µL 从第1列取溶液，加入第2列并混匀。取 100 µL 从第2列转移至第3列并混匀，继续此操作直至 100 µL 置于第11列。混匀第11列，然后取 100 µL 从该列中移除并弃去。仅保留第12列的培养基数据以用于归一化处理。
    6. 接种平板。测定光密度（OD600) 来自过夜培养物。将培养物与M9培养基混合，配制为指定OD值的溶液600 0.002（或代表500个细胞的适当浓度）µL 针对目标生物体）。用移液器 2 µL 向每孔加入培养液，使每孔含有1,000个细胞。
    7. 轻轻摇动培养板并测定OD值600 0小时读数。让培养板继续生长于 37 °C 24 h。测定OD600 24小时读数。
      注意：对其他感兴趣的生物，请使用适当的培养条件。
    8. 使用电子表格程序计算每个孔的净增长量。
    9. 将第12列的净生长量取平均值，得到无药物条件下的平均生长量。使用电子表格软件将其他孔的生长量以此平均值进行归一化处理。寻找生长量低于10%的孔，以确定MIC90；任何生长量低于50%的孔即为MIC50。计算这些孔中小分子化合物的浓度。
  2. 棋盘法检测协同相互作用
    1. 培养一晚上培养物 E. coli 在M9最小培养基中，方法同前。
      注意：对其他生物应使用适当的培养条件。
    2. 添加 100 µL 向96孔板的每个孔中加入M9培养基，并额外加入 100 µL 第1列中
    3. 在第1列的每个孔中加入待测小分子（浓度约为8倍MIC），并在A1孔中加入两倍浓度（约为16倍MIC）的小分子（每块板仅测试一种小分子）。
      注：该用量根据此前完成的 MIC 试验确定，不同潜在协同剂的用量有所不同。
    4. 在x轴上通过取样创建梯度稀释 100 µL 从第1列转移至第2列。重复此步骤直至 100 µL 加入第11列。混匀后取 100 µL 从第11列移除并弃去。不要向第12列添加任何药物（图1A).
    5. 在 y 轴方向建立第二种药物梯度，用于输入药物。添加 100 µL 含有输入分子2倍MIC的培养基，在A行中混合并按前述方法稀释，吸取 100 µL 从 A 行移至 B 行。继续此操作直至 100 µL 置于G行。混匀后取 100 µL 并妥善处理，确保H行不加入任何输入药物。这样可使H行和12列包含所测试药物对各自的最小抑菌浓度（MIC）。图1B).
    6. 接种平板。加入 2 µL 的 E. coli OD 培养600 每孔0.002（每孔1,000个细胞）。
    7. 测定 OD600 读取平板中每个孔在0小时的数值。
    8. 在37°C、5% CO₂培养箱中孵育培养板24小时 37 °C.
    9. 测量OD600 每个孔在24小时时的
  3. 从棋盘法测定中计算抑菌分数浓度指数（FICI）
    1. 通过从每个孔的 OD 值中减去初始 OD 值，计算平板各孔的净生长量600 在0 h时从OD600 在电子表格程序中于24小时时记录。
    2. 通过将每个孔除以不含小分子的 H12 孔，对软件中的生长数据进行归一化处理。
    3. 在第12列中查找输入分子的MIC90，并在H行中查找潜在协同剂的MIC90。
    4. 寻找所有抑制生长达90%的孔。
    5. 使用以下公式计算该孔的 FICI90，该孔的值为低于（协同作用）或高于（拮抗作用）两个 MIC90 值的最低或最高值：
      FIC指数方程，药物协同作用分析公式，协同研究的详细数学表达式
    6. 将任一FICI ≤ 0.5视为协同作用，FICI ≥ 4视为拮抗作用（图2).
      注意：也可使用 MIC50（50% 生长抑制浓度）根据该 MIC 值计算 FICI50。
  4. Bliss独立性实验
    注意：Bliss独立性分析适用于那些单独使用时无最低抑菌浓度（MIC）的潜在协同剂。
    1. 培养一夜间培养物 E. coli 在M9培养基中 37 °C，与之前相同。
      注意：此步骤中可再次使用其他目标生物的适宜培养条件。
    2. 为测试潜在协同分子、输入分子、组合处理以及未处理对照，准备96孔板。
    3. 通过添加制备潜在协同剂平板 50 µL 向每个孔中加入 M9 培养基。添加 50 µL 含有设定浓度的培养基10 µM 或 100 µM) 将潜在增效剂加入每行各孔中。每块板测试 8 种分子。
    4. 通过添加创建输入分子板 50 µL 每孔加入培养基。添加 50 µL 在第1列的每个孔中加入含输入药物4倍MIC的溶液。沿x轴进行梯度稀释，方法类似于MIC板的制备。 50 µL 从第1列开始，在第2列中进行分散和混合。继续此操作直至第12列，处理完毕后弃去 50 µL 从第12列开始。添加一个额外的 50 µL 每孔加入培养基，使每孔最终总体积为 100 µL.
    5. 使用96孔板制备组合板，加入 50 µL 每孔加入培养基。添加 50 µL 在第1列的每个孔中加入输入药物，使其终浓度为4倍MIC。沿x轴方向进行稀释，方法与MIC板类似，依次进行 50 µL 从第1列开始，在第2列中进行分散和混合，依此类推直至第12列，随后处理废弃物 50 µL 从第12列开始。添加 50 µL 含潜在协同剂的培养基 10 µM 或 100 µM 向每行的每个孔中加入。同样，每行应只对应一种浓度或一种药物。
    6. 通过添加创建未经处理的对照组 100 µL 向该板的所有孔中加入 M9 培养基。
    7. 接种所有平板，通过添加 2 µL 细菌培养物的OD600 每孔加入0.002或1,000个细胞，操作同前。
    8. 测定 OD600 每个孔在0和24小时的值。
  5. 计算Bliss独立性评分
    1. 通过从各孔的 OD 值中减去初始 OD 值，计算平板中每孔的净生长量600 使用电子表格程序，根据24小时的生长情况计算0小时的生长量。
    2. 在电子表格程序中，将各孔的数值归一化为无药物孔板的平均生长值。
    3. 使用电子表格软件，通过从 1 中减去净生长量来计算抑制率。
    4. 在电子表格软件中对仅包含输入梯度的对照板的列进行平均。
    5. 通过以下公式计算每个孔的Bliss评分：
      Bliss评分 = (第X列 + 输入列X) – 合并X孔
    6. 在输入物的 MIC90 以下孔中寻找负分值。
      注意：多个浓度下出现负分值表明存在协同作用。

4. 利用协同作用预测突变体进行高通量筛选以鉴定新的协同作用配对

  1. 鉴定协同作用预测突变体
    注意：步骤1.5已鉴定出潜在的协同作用预测突变株。在此，我们确定其中哪些突变株最适合用于高通量筛选协同药物。本实验在Bioscreen仪器中进行，但使用96孔板读板仪也应可行。
    1. 在M9最小培养基中培养每种推测的协同作用预测突变体及野生型细胞。
    2. 设置100孔蜂窝板（或96孔板），分别加入适当的生长培养基、含待测药物的生长培养基、含该待测药物已知协同作用伴侣的生长培养基，以及含已知非协同作用药物的生长培养基。需包含溶剂对照组。
      注意：我们建议每种菌株/药物/浓度设置四个重复孔。
    3. 每孔接种 1,000 个细胞，包括空白对照孔。
    4. 培养48小时 37 °C，振荡混匀后测定OD值600 每20分钟一次。
    5. 确定在输入药物及其已知协同作用伙伴药物存在的情况下，野生型细胞与协同作用预测突变细胞之间生长差异最大的药物浓度和时间点。在最佳时间点和浓度下，当存在已知不与输入药物产生协同作用的药物时，野生型细胞与协同作用预测突变细胞之间的生长差异应较小。图3).
  2. 高通量筛选协同作用药物
    1. 在M9最小培养基中培养野生型细胞和协同作用预测突变细胞。
      注意：使用适合目标生物的适当培养基。
    2. 将文库中的药物加入培养基中，使每个孔均含有 100 µL 含特定浓度小分子的培养基，该浓度在前一步骤中已确定。包括空白孔（无细胞）和溶剂对照孔（含溶剂）.，DMSO），以排除药物稀释载体对细胞生长的抑制作用。
      1. 每块板至少准备四个溶剂对照孔，理想情况下应分散分布在板上，以消除孔位效应的影响。如果检测结果变异性较大，则每行/列至少包含一个溶剂对照孔，并以每行/列的对照孔作为控制，用于计算该行/列的Z分数，而非整块板的Z分数（步骤4.2.5）。
    3. 添加 2 µL 向每个孔中加入与之前相同量的培养物。（一块平板用于野生型细菌，另一块平板用于预测的协同突变型细菌）。
    4. 测定 OD600 在 0 和 18 h 时 E. coli 或 48 小时 C. neoformans.
    5. 使用电子表格软件，通过从OD值中减去初始值来计算净增长量600 从空白孔中扣除溶剂对照孔的数值。筛选Z分数为-2.5的孔（Z分数 = 均值 - 2.5×标准差）。这些孔中可能含有潜在的协同作用小分子。
    6. 使用第3步中概述的方法验证筛选结果。

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结果

棋盘式实验是一种用于测量协同作用的半定量方法。最终输出的评分FICI可判断药物组合是否具有协同作用（FICI ≤0.5）、无相互作用（0.5 图1展示了如何在棋盘式实验中设置药物梯度。图2展示了常见的实验结果。判断生长情况时（紫色孔），若生长抑制率低于90%，则视为有生长。在测定每块板各孔的OD600后，我们将所有数据归一化至无药物对照孔。任何归一化值>0.1（即对照孔OD600的10%）的孔均记为“生长”。FICI评分可能因所选孔的不同而变化；我们为每块板选择给出最低FICI值的孔。在图2A中，该孔为F9（列用数字编号，行用字母编号），其FICI = 0.07。在图2B中，FICI由孔C3计算得出（FICI = 1.0）。...

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讨论

协同作用的小分子组合在治疗微生物感染方面具有巨大潜力，但由于协同作用的分子对难以发现，其临床应用潜力尚未得到充分发挥。本文介绍了一种比简单成对组合更快速识别协同作用分子对的方法。通过利用化学遗传学数据集，O2M 可识别出基因敲除的突变体，并以此作为读出系统，用于筛选大量小分子文库，从而预测具有协同作用的分子对。这种预测小分子协同作用的能力使得筛选过程具有高度可扩展性，进而实现大规模识别协同作用的配对分子。在鉴定出协同作用分子对后，可进一步阐明其协同作用背后的分子机制，并据此理性设计更多协同作用的分子组合11。

O2M 方法需要一个化学生物学基因数据集以及一个已知的协同作用配对。幸运的是，目前已有多种微生物的化学生物学基因数据集19,20,21。Brown 实验室先前已证明，O2M 能够在 C. neoformans 和 E....

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了犹他大学病理学系向 J.C.S.B. 提供的启动资金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Bioscreen C仪器Growth Curves USA
Synergy H1仪器BioTek
M9 肉汤试剂AmrescoJ863-500G
酪蛋白氨基酸试剂菲舍尔科技BP1424-500
葡萄糖试剂SigmaG7021-10KG
烟酸试剂Alfa AesarA12683
硫胺素试剂Acros Organics148991000
CaCl2 二水合物试剂FisherC79-500
MgSO4 七水合物试剂FisherM63-500
化学遗传学数据集数据集示例包括 Nichols 等人，Cell，2011；Brown 等人，Cell，2014，以及文中引用的其他研究。
甲氧苄啶（示例输入药物；可使用任意药物）试剂菲舍尔科技ICN19552701
磺胺甲噁唑（示例测试药物；可使用任意药物）试剂菲舍尔科技ICN15671125

参考文献

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