Pseudomonas aeruginosa 感染在易感宿主中可引起显著的发病率。铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）菌株 PA14 的非冗余转座子插入突变体文库（命名为 PA14NR 文库）可用于分析众多生物学过程中的基因功能。本文介绍了一种用于制备高质量 PA14NR 文库拷贝的实验方案。
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方法文章
铜绿假单胞菌 PA14菌株转座子插入突变体有序非冗余文库的复制
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
Pseudomonas aeruginosa 是一种表型和基因型多样且具有高度适应性的革兰氏阴性细菌，广泛存在于人类环境中。P. aeruginosa 能够形成生物膜、产生抗生素耐药性、分泌毒力因子，并在慢性感染过程中快速进化。因此，P. aeruginosa 可引起急性和慢性感染，且难以治疗，导致特定患者群体中出现显著的发病率。P. aeruginosa 菌株 PA14 是一种人类临床分离株，其基因组结构保守，可感染多种哺乳动物和无脊椎动物宿主，使其成为研究该病原体的理想菌株。2006年，研究人员构建了一个非冗余的转座子插入突变体文库，包含5,459个突变体，对应于4,596个预测的PA14基因。自那时起，PA14文库的分发使科研界能够更深入地理解P. aeruginosa中单个基因及复杂通路的功能。为确保文库在复制过程中的完整性，必须进行规范的操作和精确的技术处理。为此，本文提供了详细的实验方案，描述了文库复制、文库质量控制以及单个突变体正确保存的具体步骤。
引言
Pseudomonas aeruginosa 是一种表型和基因型多样且具有高度适应性的革兰氏阴性细菌，广泛存在于土壤、水体、大多数人类生活环境以及皮肤微生物群中。与其他许多细菌物种相比，P. aeruginosa 拥有相对较大的基因组，大小为 5.5–7 Mbp，其鸟嘌呤+胞嘧啶（G+C）含量较高（65–67%）。此外，其大量基因参与代谢适应性，并属于调控网络的一部分，使其在应对环境胁迫时具有极强的灵活性1。P. aeruginosa 表达多种毒力因子，易于形成生物膜，能够通过多条群体感应通路协调反应，并表现出显著的抗生素耐药性和耐受性发展能力2,3,4,5,6,7,8。这些特性为治疗由 P. aeruginosa 引起的感染带来了重大挑战。
慢性P. aeruginosa感染可发....
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方案
注意：处理时应采用标准的 BSL-2 安全措施 P. aeruginosa 一种人类病原体。如果您属于免疫功能低下者，或患有任何会增加细菌感染易感性的医学状况，在操作该生物体时应格外谨慎 P. 铜绿假单胞菌。在使用PA14 NR文库或细菌病原体突变体文库前，请咨询所在机构的生物安全办公室，并获得医生的批准。
图 1：方案 I 概述：PA14NR 菌株集的复制。 第 1 天：将 PA14NR 菌株集的“主库”中保存的冻存突变株接种至 LB 琼脂培养基平板上，于 37 °C 过夜培养。第 2 天：将 LB 琼脂平板上生长的突变株转移至含有 LB 液体培养基的深孔块中，于 37 °C、950 rpm 振荡条件下过夜培养。第 3 天：将过夜培养的 LB 菌液与甘油混合，随后转移至 96 孔目的板中进行长期保存。将 96 孔板平放于 -80 °C 超低温冰箱中。
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结果
使用方案I复制了12份PA14NR文库的新副本，并使用方案III对生成的新副本进行质量控制评估。
按照预设模式交替排列接种了野生型PA14的孔和未接种的孔，构成对照平板（图4A），PA14NR突变体平板与这些对照平板一起，依照方案I中所述方法进行复制。在PA14NR平板集中包含对照平板，用于评估进行平板复制时可能发生的孔间污染。此外，对照平板还可用于在接触含有转座子插入突变体的平板之前练习复制技术。在LB琼脂平板上完成复制并过夜培养后，通过肉眼观察对照平板的生长情况，以确认是否出现预期的生长模式（图4B）。对使用对照平板1接种的深孔板，在过夜培养后通过分光光度计测定OD600，以评估细菌生长情况。结果显示，接种野生型PA14的孔中出现显著生长，而未接种的孔中完全无生长（图.......
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讨论
P. aeruginosa PA14NR 文库是科学界一项宝贵的资源。根据科睿唯安（Clarivate Analytics）基本科学指标数据库2017年3月的数据，Liberati et al.（2006）37（描述了PA14NR文库的构建）位列微生物学领域发表论文中被引频次最高的前1%。截至2017年8月，Google Scholar 显示Liberati et al.（2006）的原始论文已被引用超过600次。该文库在阐明P. aeruginosa致病机制方面发挥了重要作用。尤为重要的是，PA14NR文库采用96孔板格式，便于开展高通量遗传筛选，以研究多种P. aeruginosa突变体表型44,45,46。由于PA14NR文库可供分发使用，必须采取特殊预防措施以确保该资源的完.......
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披露
作者声明无经济利益冲突。Eliana Drenkard 和 Frederick Ausubel 参与了 PA14 非冗余转座子突变体文库的构建。Bryan Hurley 和 Lael Yonker 目前作为麻省总医院儿科系的一部分，负责该突变体文库的保藏与分发。
致谢
我们感谢麻省总医院特雷德韦尔虚拟图书馆的 Lisa Philpotts 在数据库检索方面的指导。本研究由囊性纤维化基金会（YONKER16G0 和 HURLEY16G0）以及美国国立卫生研究院过敏与传染病研究所（BPH 和 ADE：R01 A1095338）提供资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 文库扩增所需材料 | |||
| 无菌96孔组织培养板，每箱50块 | 康宁生命科学 | 353072 | 通过 Fisher Scientific |
| 无菌 96 孔平底透明板 2000μL型深孔板，每箱25个 | 康宁生命科学 | 3960 | 通过 Fisher Scientific |
| Nunc OmniTray（矩形板），每箱60块 | 赛默飞世尔科技 罗切斯特 | 242811 | 通过 Fisher Scientific |
| 矩形冰盒，中号（4L） | 康宁生命科学 | 432104 | 通过 Fisher Scientific |
| Secure-Gard 锥形面罩，每箱 300 个 | Cardinal Health | AT7509 | 通过 Fisher Scientific |
| AluminaSeal，100个装 | Diversified Biotech | ALUM-100 | 通过 Fisher Scientific |
| Breathe-Easy 膜，每包100片 | Diversified Biotech | BEM-1 | 通过 Sigma-Aldrich |
| 无菌、独立包装、50 mL 溶液槽/试剂储液槽，每箱100个 | Sorenson | S50100 | 通过 Westnet Incorporated |
| 平板滚轴器 | VWR | 60941-118 | 通过 VWR |
| Cryo 激光标签 - CRYOLAZRTAG 2.64" x 0.277"，16 张装 | GA国际 | RCL-11T1-WH | 通过 Labtag.com（打印模板也可从 Labtag.com 获取） |
| 96孔复制器 | V & P Scientific, Inc. | 定制 407C，3.18 mm 针径，57 mm 长 | 通过 V & P Scientific, Inc. |
| Multitron Pro，3 mm 摇床培养箱 | Infors HT | l10003P | via Infors HT |
| Picus 12 通道 50-1200μ电子移液器 | 赛多利斯 | 735491PR | 通过 Sartorius |
| 过滤技巧 50-1200μL，960 个装 | Biohit | 14-559-512 | 通过 Fisher Scientific 购买；使用适用于电子多通道移液器的吸头 |
| 干冰 | 用户特定供应商 | ||
| 个体突变体保存材料 | |||
| Fisherbrand 优质微量离心管：1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-130 | 通过 Fisher Scientific |
| 移液器（P1000、P200、P20、P2） | Gilson | F167370 | via Gilson |
| 质量控制 PCR 所需材料 | |||
| Fisherbrand 优质微量离心管：1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-130 | 通过 Fisher Scientific |
| NanoDrop | 赛默飞世尔科技 | ND-2000 | 通过 ThermoFisher |
| PCR扩增仪 | |||
| Omnistrips PCR管（带圆顶盖） | 赛默飞世尔科技 | AB0404 | 通过 Fisher Scientific |
| ART Barrier 低吸附移液器吸头（10 μL，100 μL，1000 μL） | Molecular BioProducts, Inc. | Z676543（10 μL）、Z676713（100 μL）、Z676802（1000 μL） | 通过 Sigma-Aldrich |
| 移液器（P1000，P200，P20，P2） | Gilson | F167370 | 通过 Gilson |
| Fisherbrand 优质微量离心管：1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-130 | 通过 Fisher Scientific |
| MasterPure DNA 纯化试剂盒 | Epicentre | MCD85201 | via Epicentre Technologies Corp |
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder，即用型 | 赛默飞世尔科技 | SM1333 | 通过 ThermoFisher |
| RediLoad 上样缓冲液 | Invitrogen | 750026 | 通过 ThermoFisher |
| <强>化学品 | |||
| 用于文库及单个突变体保存的化学品 | |||
| 甘油 MB 级，1L | Sigma Aldrich | G5516 | 通过 Sigma-Aldrich |
| LB肉汤 | 每升去离子水2O：10 g 胰蛋白胨，5 g 酵母提取物，5 g NaCl，1 ml 1 N NaOH（《分子生物学实验指南》）。 Wiley，1994。 | ||
| 胰蛋白胨 | Sigma Aldrich | T7293 | 通过 Sigma-Aldrich |
| 酵母提取物 | Sigma Aldrich | Y1625 | 通过 Sigma-Aldrich |
| 氯化钠 | Sigma Aldrich | S7653 | 通过 Sigma-Aldrich |
| 氢氧化钠 | Sigma Aldrich | S8045 | 通过 Sigma-Aldrich |
| LB 琼脂 | 参见上述制备步骤，加入15 g Bacto Agar | ||
| Bacto 琼脂 | Sigma Aldrich | A5306 | 通过 Sigma-Aldrich |
| 硫酸庆大霉素，10 g | 生物试剂 | 1405-41-0 | 通过 Sigma-Aldrich |
| 硫酸卡那霉素 | Gibco | 11815024 | 通过 ThermoFisher |
| 乙醇，190 proof | 去污 | 04-355-221 | 通过 Fisher Scientific |
| 质量控制 PCR 用化学品 | |||
| 引物 | 用户首选供应商 | 参见表3中列出的引物 | |
| 康宁 Cellgro 分子生物学级水 | 康宁 | 46000CV | 通过 Fisher Scientific |
| Taq 聚合酶缓冲液 | Invitrogen | 10342020 | 通过 ThermoFisher |
| Taq DNA聚合酶，重组 | Invitrogen | 10342020 | 通过 ThermoFisher |
| dNTPs | Invitrogen | 10297018 | 通过 ThermoFisher |
| 琼脂糖 | Sigma | A9539 | 通过 Sigma-Aldrich |
参考文献
- Moradali, M. F., Ghods, S., Rehm, B. H. Pseudomonas aeruginosa lifestyle: A paradigm for adaptation, survival, and persistence. Front Cell Infect Microbiol. 7, 39(2017).
- Bleves, S., et al. Protein secretion sy....
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