Summary
Aqui nós apresentamos um método para um modelo humano em vitro de lesão de estiramento em um formato de 96 poços, numa escala de tempo relevante para o impacto do trauma. Isto inclui métodos para a fabricação de placas stretchable, quantificando o insulto mecânico, cultivo e ferindo células, imagem e análise de conteúdo elevado de quantificar a lesão.
Abstract
Traumatismo crânio-encefálico (TCE) é um grande desafio clínico com alta taxa de morbidade e mortalidade. Apesar de décadas de pesquisa pré-clínica, desenvolveram-se sem terapias comprovadas para TBI. Este trabalho apresenta um método novo para pesquisa pré-clínica neurotrauma destinado a complementar os actuais modelos pré-clínicos. Ele introduz a fisiopatologia humana através do uso de neurônios de células-tronco derivadas de humanas pluripotentes induzidas (hiPSCNs). Consegue o pulso de carregamento duração semelhante para as durações de carregamento da clínica fechada impacto cabeça lesão. Ele emprega um formato de 96 poços que facilita as experiências de alta taxa de transferência e faz o uso eficiente das células caras e reagentes de cultura. Membranas de silicone são primeiro tratadas para remover o polímero não polimerizado neurotóxico e então ligadas aos organismos comerciais placa de 96 poços para criar stretchable placas de 96 poços. Um dispositivo custom-built é usado para recuar alguns ou todos os fundos bem partir de baixo, induzindo equibiaxial esforços mecânicos que fere mecanicamente as células em cultura em poços. A relação entre a profundidade do recuo e esforços mecânicos é determinada empiricamente utilizando Videografia de alta velocidade de fundos bem durante o recuo. As células, incluindo hiPSCNs, podem ser cultivadas nestas membranas de silicone usando versões modificadas de protocolos de cultura de células convencional. Imagens microscópicas fluorescentes de culturas celulares são adquiridas e analisadas após a lesão de forma semi-automática para quantificar o nível de prejuízo em cada poço. O modelo apresentado é otimizado para hiPSCNs, mas poderia, em teoria, ser aplicado a outros tipos de células.
Introduction
TCE é das principais causas de mortalidade e morbidade nos Estados Unidos, causando cerca de 52.000 mortes e 275.000 hospitalizações a cada ano1. Foram realizados mais de 30 ensaios clínicos de terapêutica candidato para TBI sem um único sucesso2. Essa falha uniforme sugere que processos humanos específicos separam TBI humana a fisiopatologia observada em modelos de roedores pré-clínicos comumente usados.
O advento do hiPSCNs criou a oportunidade de estudar neurotrauma em um modelo humano em vitro . Com modelos baseados em hiPSCN de rastreio de drogas podem entregar resultados que são mais preditivos de sucesso clínico do que modelos empregando células de roedores. Além disso, hiPSCNs pode ser manipulado geneticamente para isolar e estudar o efeito de variantes genéticas humanas individuais na patologia3.
O método descrito neste manuscrito é projetado para trazer as vantagens únicas da doença baseada em hiPSCN modelagem de neurotrauma. Em vitro modelos de lesão de estiramento de neurotrauma são bem estabelecidos4,5,6 com células primárias de roedores e de linhas de células cancerosas humanas neural. A maioria destes modelos gera trecho pneumaticamente carregando uma membrana de silicone. Esta abordagem é eficaz em um único formato bem mas provou difícil de escala até um formato multi bem7. Como resultado, nunca houve uma tela de alta produtividade para agentes tratar estiramento neurônios feridos.
Neste modelo, a membrana se estende devido ao recuo de baixo com um rígida do indenter. Esta abordagem tem demonstrada repetidamente para gerar patologia clinicamente relevantes em vitro em sistemas bem simples8,9,10. Nossos trabalhos mais recentes tem mostrado que é facilmente escalas para um formato de 96 poços, mantendo durações de pulso da ordem de dezenas de milissegundos11, que é o tempo fechado de domínio de cabeça impacto eventos12,13.
Em resumo, as principais vantagens deste modelo de lesão em vitro são o formato de 96 poços, o uso de hiPSCNs e o domínio do tempo clinicamente relevantes do insulto.
Protocol
1. desintoxicação de silicone
- Corte 254 membranas de silicone 30,48 x 30,48 cm espessura, µm em retângulos de 7,5 cm x 11 cm, usando uma lâmina de barbear e um modelo de acrílico. 10 membranas retangulares podem ser feitas com cada folha. Salve o papel que vem com o silicone.
- Coloque as membranas em uma banheira de deionizada (DI) com sabão do vidro. Um por vez, esfregar as membranas vigorosamente com a ponta dos dedos com luvas, pelo menos 20 s ou até lathered.
- Enxague as membranas sob DI água corrente até que o sabão lathered visivelmente é removido. Coloque as membranas no papel (da embalagem) e autoclave em um ciclo de gravidade.
-
Mergulhe cada membrana do silicone em 250 mL de etanol a 70% por membrana em um agitador orbital em 60 rpm para 24 h. uso um recipiente feito de um material que não reage com o etanol, como o polipropileno.
- Se mais de uma membrana é colocada numa caixa única, ou se as membranas grude no fundo da bin, separar as membranas do seu ambiente com pontas de pipetas plásticas e pipetar cremalheiras de ponta.
- Transferir as membranas de silicone com as mãos enluvadas para 250 mL de água DI por membrana e mergulhe no agitador orbital por 48 h a 60 rpm.
- Deitou as membranas no papel e o lugar em um forno de vidro de 93 ° C por 4 h.
- Armazene as membranas no papel, em um local limpo e seco, coberto com outra folha de papel para protegê-los de poeira.
2. fabricação de placa
- Plasma tratar um top placa de 96 poços, com uma TV de plasma de 200 W limpador (ver Tabela de materiais) para 60 s em alta potência, colocando-se lado-ascendente dentro do plasma líquido de limpeza. Verifique se há um brilho roxo visível através da janela da câmara, o que indica que tem formado um plasma eficaz. Esta técnica de colagem é uma adaptação de Domingos et al . 14
- Dentro de 60 s, coloque a parte superior da placa em 200 mL de 1,5% (3-aminopropil) triethoxysilane (APTES) em água por 20 min, baixo-lado-para baixo. Esta solução é instável: prepará-lo não mais do que 60 s antes de introduzir a placa.
Cuidado: Trabalho com APTES em uma coifa. - Plasma tratar uma membrana de silicone extraído no plasma líquido de limpeza para 60 s em alta potência. Tempo o tratamento de plasma, tal que termina não mais que 5 min antes do final do período de 20min no passo 2.2.
- Use fórceps para posicionar a membrana de plasma Tratado em cima de um retângulo de papel de pergaminho de2 7,5 x 11 cm. Alinhe um 7,5 x 11 cm x laje de alumínio 0,5 cm na parte inferior da braçadeira de fabricação da placa. Alinhe o papel de membrana e pergaminho de silicone sobre a laje de alumínio usando fórceps.
Nota: Arquivos de desenho assistido por computador (CAD) para este dispositivo são fornecidos nos materiais complementares como um arquivo de código suplementar ' imprensa morrer - 3D genéricos. PASSO '. A associado lista de materiais é fornecida no suplementares tabela 1: Custom construiu dispositivos - BOM.xlsx. - Retirar o máximo de placa do banho APTES e sacuda o excesso solução. Mergulhe em um banho de água de 200 mL DI para 5 s e sacuda o excesso de água. Mergulhe em um banho de água de 200ml diferente DI para 5 s e sacuda o excesso de água. Substitua a água nestes banhos antes de mergulhá outra parte superior da placa.
- Use ar comprimido para secar completamente o topo da placa.
- Coloque a parte superior da placa na parte superior do grampo de fabricação da placa. Delicadamente feche a placa de aperto de fabricação para pressionar a placa superior e silicone juntos. Braçadeira pelo menos 1 h.
- Deixe a placa curar por 24 horas à temperatura ambiente antes do uso, protegido de poeira.
3. uma placa de alongamento
- Limpe os indenters.
Nota: Ver Figura complementar 1.- Prepare um sonicador de banho estilo 60 W com DI água à temperatura ambiente.
- Suporte do bloco do indenter acima o banho sonicador, invertido para que apenas os topos dos indenters estão submersos a uma profundidade de pelo menos 1 mm. proceda à sonicação os indenters para min 8 de 42 kHz.
- Seque os indenters com ar comprimido.
- Alinhe o bloco do indenter.
- Posicione uma câmera com uma transmissão ao vivo acima o dispositivo de alongamento para que ele está olhando para a matriz do indenter. Concentre-se em cima dos indenters.
Nota: A configuração descrita na seção 4, "Caracterizando a membrana Stretch," é uma configuração possível para esta tarefa. - Fixar uma placa no palco do dispositivo lesão usando os grampos de fase (Figura 1) e coloque uma luz de abóbada sobre o dispositivo.
Nota: Consulte a Tabela de materiais para o software de controle do instrumento. - Inicie o software de controle de instrumento clicando no ícone do software na área de trabalho do computador que está a controlar o dispositivo de lesão. Execute o projeto de "in_vitro_neurotrauma.lvproj", clicando na janela de lançamento. Da janela de projeto, iniciar o controle de movimento e posição instrumentos virtuais rastreador (VIs), que são chamados 'motion_control.vi' e 'position_tracker.vi', respectivamente, clicando duas vezes sobre eles.
- Feche a gaiola em torno do dispositivo de lesão. Pressione o botão 'seta' no canto superior esquerdo do controle de movimento VI para executar o VI e clique em 'Próximo inferior' para abaixar o palco para menos de 2 mm de entrar em contato com os indenters. Clique no botão 'Stop' para parar a VI.
Atenção: Mantenha as mãos fora da maca ao manipular a câmera na gaiola. A gaiola deve ser equipada com um interruptor de porta que fornece energia para o dispositivo de alongamento somente quando é fechada a porta da gaiola. - Na janela de projeto, dê um clique-direito no 'Eixo 1'. Clique em "Painel de teste interativo". Na janela que se abre, defina o tamanho do passo de 50 µm inserindo unidades '500' no campo 'Posição'.
- Clique no botão verde 'ir' na parte inferior da janela 'Painel de teste interativo' repetidamente até a placa primeiro entra em contato com qualquer indenters. Seleção para contato sobre a imagem ao vivo exibida pela câmera. Nota a posição vertical fase relatada na parte superior esquerda da janela 'Painel interativo de teste'; Esta é a primeira posição de contato.
- Mais baixa (conforme descrito na etapa 3.2.6) até cada poço tem feito contato com os indenters. Se necessário, mover a câmera para ver a placa inteira e subir ao palco (especificando uma posição negativa' alvo') e para baixo. Nota a posição vertical fase relatada na parte superior esquerda da janela, quando todas as mensagens estão em contato (esta é a posição de contato total).
- Observe a diferença entre as posições de contato primeiro contatos e completa. Feche o painel de' teste interativo'. Executar o 'controle de movimento VI' (consulte a etapa 3.2.4) e clique no 'Top' para elevar o palco. Pare o controle de movimento VI com o botão 'Stop'.
- Uma vez que o estágio é na parte superior do seu curso, abre a porta para desativar o dispositivo. Ajuste os parafusos nos cantos do bloco do indenter. Afrouxe o parafuso de ajuste na esquina que fez o primeiro contato, para abaixá-lo e apertar o parafuso oposto para elevar o canto que fez o último contato.
- Repita o processo de redução do palco até a placa entra em contato com os indenters, inspecionando as imagens contatos para inclinação, levantando o palco, e ajustando (etapa 3.2.9) o indenter do bloco. Quando o palco e o bloco estão alinhados, fará todos os indenters contacte de imediato.
- Abra a porta para desativar o dispositivo. Insira os parafusos de fixação nos seus buracos no bloco do indenter e aperte-os. Confirme que o bloco está nivelado com os parafusos de fixação no lugar (passos 3.2.4-3.2.8). Tome nota da posição de palco, relatada pelo 'painel de teste interativo' quando a placa faz contato. Esta será a posição zero para experimentos de recuo.
- Posicione uma câmera com uma transmissão ao vivo acima o dispositivo de alongamento para que ele está olhando para a matriz do indenter. Concentre-se em cima dos indenters.
- Lubrifique os indenters.
- Se o bloco do indenter só foi criado e ainda não foi lubrificado, limpe uma almofada de borracha maciça (7,5 x 11 cm x 1,5 mm) e uma almofada de espuma de borracha macia, de célula fechada (7,5 x 11 cm x 3 mm) com uma compressa com laboratório encharcada de etanol. Deixe-os secar ao ar.
- Mergulhe uma limpeza de laboratório em óleo de milho e espalhá-lo sobre a almofada de borracha sólida para um brilho fosco.
- Coloque a almofada de espuma para a almofada de borracha maciça para transferir o óleo para a almofada de espuma. Coloque um 7,5 x 11 cm x laje de alumínio 0,5 cm em cima a almofada de espuma e carregá-lo com um peso de lastro de aproximadamente 360 g (por exemplo, 6 tubos cónicos carregados com 45 mL de água cada) para garantir a transferência consistente de óleo da almofada de borracha sólida para a almofada de espuma. Permitir que 10 s para o óleo transferir para a almofada de espuma de borracha.
- Mova a almofada de espuma de borracha para a matriz do indenter. Coloque a placa de alumínio e o peso do lastro em cima dela para garantir a transferência consistente do óleo para as pontas dos indenters. Permitir que 10 s para o óleo transferir para os indenters.
- Se nenhuma placa foi esticada desde o bloco do indenter foi criado e lubrificado pela primeira vez, esticar uma placa de teste antes de começar o experimento.
Nota: Isto irá impedir qualquer inconsistência entre o primeiro trecho e trechos subsequentes confundindo o experimento. Para trechos subsequentes, repita apenas passos 3.3.2-3.3.5 antes de cada trecho.
- Estica uma placa.
- Lubrifique os indenters conforme descrito na etapa 3.3.
- Segure o prato no palco do dispositivo lesão com os grampos de palco. Se esterilidade for necessária, ajuste a posição da pálpebra para fixar a placa sem expor a superfície de cultura para o ar do quarto.
- Baixe o palco para a posição zero-usando o controle de movimento de 'VI' (ver passos 3.2.4-3.2.6); zero-posição é determinada durante a etapa 3.2.
- Mudar o nome do arquivo no campo "caminho do arquivo" o rastreamento VI 'posição' para um nome de arquivo exclusivo, então executá-lo com o botão 'seta' no canto superior esquerdo da janela.
- Definir a profundidade e a duração de recuo (tipicamente 1-4 mm e 30 ms, respectivamente, profundidade máxima de 5 mm, duração mínima 15 ms) nos campos de 'Lesão duração (ms)' em 'movimento painel de controle VI' clicando sobre os campos e digitando a desejada e «Prejuízo (mm)» valores.
- Executar o 'movimento controle painel VI' e clique em 'Ferimento' para recuar a placa.
- Mova o palco até o topo de sua viagem clicando no 'Top'. Então pare a VI com o botão 'Stop' e desactivar o dispositivo de lesão ao abrir a porta.
- Inspecione a história de deslocamento de fase apresentado no rastreador VI 'posição' para confirmar que o deslocamento máximo especificado foi aplicado. Clique com o botão direito no gráfico e clique em 'Exportar para Excel'. Clique em ' arquivo | Salvar ' para salvar os dados.
4. caracterizando o estiramento da membrana
- Pinte o recesso no topo de cada branco do indenter para fornecer um fundo de alto contraste para produção de vídeo de alta velocidade.
Cuidado: Não pintar as jantes dos indenters onde eles fazem contato com as placas. - 3D imprimir com poly(lactic acid) (PLA), ou caso contrário fabricar, um selo cilíndrico com que tornar-se um ponto em cada poço. Fazer o 5,9 mm de diâmetro e 12,2 mm de altura, com uma saliência cilíndrica 1,5 mm de diâmetro e 1,0 mm de altura centrado na parte superior do cilindro.
Nota: Um modelo para impressão 3D ' carimbo. STL' está disponível como um arquivo complementar. - Plasma tratar a placa direito-lado-acima para ativar a superfície do silicone de cultura celular em poços para 60 s, como mencionado no passo 2.1.
- Coloque a placa sobre uma almofada de borracha ou outras superfícies macias. Prime a pequena saliência no carimbo (consulte a etapa 4.2) com tinta de uma caneta de tinta permanente. Inserir o carimbo dentro do poço a ser testado e toque para garantir a boa transferência de tinta. Prime o selo antes de cada poço.
- Alinhar o bloco do indenter e lubrificar as indenters do dispositivo lesão (ver etapas 3.2-3.3). Fixe a placa para o palco do dispositivo lesão. Posicione uma luz difusa axial acima o dispositivo de lesão.
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Colocar uma câmera de alta velocidade em um carrinho de crescimento sobre o dispositivo de lesão, voltada diretamente para baixo, com a lente definido como o menor número f-stop e ligá-lo. Inicie o software da câmera no computador conectado à câmera. No quadro taxa no menu suspenso, selecionados 2.000 frames por segundo e no obturador menu suspenso, selecione o tempo de exposição mais rápido que produz imagens de alto contraste. Centro sobre os poços pontilhados.
- Posicione a câmera de modo que o campo de visão contém 12 poços em uma grade de 3 x 4.
Nota: Este campo de vista oferece um compromisso ideal entre o throughput e a resolução de uma imagem de 1.280 x 1.024.
- Posicione a câmera de modo que o campo de visão contém 12 poços em uma grade de 3 x 4.
- Baixe a placa para o ponto zero (ver passos 3.2.4-3.2.6). O registro de um-clique botão no software da câmera para que ele lê 'gatilho em'. Inicie o localizador de posição VI (etapa 3.4.4).
- Ligue a luz difusa axial. Recuo da placa, conforme descrito na etapa 3.4.6.
- Desligue a luz difusa axial.
-
No computador de controle de câmera, encontrar a janela de 30-40 ms da gravação em que ocorre o recuo: arraste as setas de início e fim na barra de reprodução de vídeo de alta velocidade no software da câmera. Clique em salvar, defina o nome no campo 'Nome do arquivo', selecione 'TIFF' no campo 'Formato' e clique em 'Salvar'.
- Olhe através do. TIF-arquivos para imagens do menos esticado (início) e mais esticada (recuo de pico) Estados.
- Para medir a altura e largura dos pontos em ambas as imagens, use Fiji para abrir as imagens do menos e pico estiramento side-by-side. Usando a ferramenta de seleção retangular padrão, clique e arraste para desenhar uma caixa ao redor de um ponto na imagem menos estiramento. Medir a altura e largura com ' Analyze | Medida '.
- Repita para o ponto no mesmo poço na imagem de estiramento de pico. Repita para o resto dos poços.
- Calcule a tensão Lagrangiana nas direções x e y da seguinte maneira:
Nota: Aqui, Exx é a tensão Lagrangiana na direção x , Eyy é a tensão Lagrangiana na direção y , X é a largura do ponto, Y é a altura do ponto, f denota a imagem final (ou seja, a imagem de recuo de pico), e denota a imagem inicial (ou seja, a imagem de pre-recuo). Média de dois valores para determinar a tensão naquele poço.
5. chapeamento de culturas de células
- Autoclave a escaninhos e pesos de lastro que serão usados para a esterilização.
- Plasma tratar a placas com fundo do silicone direito-lado-acima por 60 s (consulte a etapa 2.1). Mergulhe imediatamente as placas em tulhas estéril contendo etanol a 70% por 15 min.
- Mergulhe as placas em solução salina estéril tamponada de fosfato (PBS) em separado escaninhos estéril por 30 min.
- Aspire a PBS dos poços. Só seco um prato de cada vez para evitar que os poços perder o tratamento de plasma.
Cuidado: Silicone placas com fundo fornecem feedback tátil menos do que placas rígidas, quando pipetagem e são mais propensos a bloquear a ponta de uma pipeta. - Adicione 100 µ l de 0,1 mg/mL poli-L-ornitina (PLO) por alvéolo para as placas esterilizadas. Incube a temperatura ambiente durante 1 h.
- Lave os poços duas vezes com 100 µ l de PBS estéril, embora a segunda lavagem em poços até a suspensão de eritrócitos está pronta.
- Remover o frasco de hiPSCNs de armazenamento de nitrogênio líquido, usando luvas de segurança e colocar em gelo seco. Transporte do frasco para um banho-maria 37 ° C e descongelar por exatamente 3 min rapidamente. Não agite o frasco.
- Um capuz estéril, gentilmente transferi o conteúdo do frasco para um tubo cônico de 50 mL com uma pipeta sorológica 1ml.
- Enxague o frasco criogênico vazio com 1 mL de meio de manutenção completa de temperatura (base de mídia + suplemento).
- Transferi a 1 mL de mídia para o tubo de 50 mL drop-wise em cerca de uma gota por segundo. Agite suavemente o tubo ao adicionar. Adicione 8 mL de meio de manutenção completa de temperatura para o tubo de 50 mL em cerca de 2 gotas/s.
- Tampe o tubo e inverta 2 - 3 vezes. Conte as células com um hemocytometer. Calcule o volume dos meios de comunicação adicionais necessários para diluir a suspensão de eritrócitos a 225.000 células/mL.
- Delicadamente, pipete a quantidade de mídia (calculada acima) dentro do tubo da suspensão de células usando uma pipeta de 25 mL serológicos.
- Adicione 10 µ l de 1 mg/mL de caldo de laminina por 1 mL de suspensão de células com uma micropipeta µ l 1.000 para atingir 10 µ g/mL de laminina na suspensão de célula. Aspire o cima e para baixo uma vez com a ponta usada para laminina, então tampar o tubo e inverter o tubo de uma vez.
- Aspire a PBS das placas, uma placa de cada vez. Use uma pipeta multicanal para adicionar 100 µ l de suspensão de células de hiPSCN a cada poço. Os poços possuem uma área de cultura de 0,33 cm2, então a densidade de células por área é 67.500 células/cm2.
- Descanse as placas em temperatura ambiente por 15 min após a semeadura para promover a penhora. Para evitar vibrações ventilador exaustor de cultura estéril, coloca as placas cobertas na bancada do laboratório. Incube as culturas a 37 ° C com 5% de CO2.
- Realizar uma alteração de mídia completo em 24 horas, voltar a encher os poços com 200 µ l de mídia manutenção completa. Execute um meio mídia muda de 100 µ l/poço a cada 2-3 dias.
6. ferindo culturas
- Alinhar o bloco do indenter e encontrar a posição zero, conforme descrito no passo 3.2. Lubrifique os indenters conforme descrito na etapa 3.3.
- Defina o nome do arquivo para a história do deslocamento no 'tracker posição VI' (passo 3.4.4). Defina os parâmetros de lesão no 'controle de movimento VI' (passo 3.4.5).
- Leve o prato para ser ferido fora da incubadora e apertá-lo para o palco. Ajuste a posição da tampa para fixar a placa sem expor as culturas para o ar do quarto.
- Baixe a placa para o ponto zero (passos 3.2.4-3.2.6) usando o 'controle de movimento VI'. Começar o 'tracker posição VI' (passo 3.4.4).
- Use o controle de movimento VI para recuar a placa (conforme descrito na etapa 3.4.6). Para trechos de Souza, pule apenas esta etapa.
- Retornar o palco para o topo da sua amplitude de movimento (consulte a etapa 3.4.7). Devolve a chapa para a incubadora.
- Inspecionar e salvar o rastreamento do deslocamento (como na etapa 3.4.8).
7. microscopia
- Prepare um 10 x coloração solução com 2 µ g/mL Hoechst 33342 e 5 µ g/mL calceína AM na mídia de manutenção.
- Cada mancha bem com um pico de 20 µ l de 10 x solução de coloração.
- Incube por 15 min com mancha a 37 ° C.
- Adquira imagens fluorescentes de campo largo. Uso convencional FITC e DAPI filtram conjuntos para a imagem da calceína AM e Hoechst 33342 sinais, respectivamente. Se a sequência de imagens multi bem vai demorar mais de 10 min, coloque a placa em uma incubadora de estágio superior para manter a saúde das culturas.
Nota: 10 X, 0,30 NA lente fornece detalhes suficientes para determinação da viabilidade celular e morfologia. Ajuste os ganhos para garantir a boa visualização dos neuritos, mesmo se isso causa alguma saturação a soma muito mais brilhante. - Segmento de imagens de células vivas no canal verde calceína AM para identificar a soma e neuritos. Use imagens nucleares no canal da Hoechst 33342 Azul para ajudar com a identificação da soma.
Representative Results
O dispositivo de maca é capaz de mover o palco repetidamente com durações de pulso tão curtos quanto 10 a 15 ms dependendo da amplitude do pulso (Figura 2A). As amplitudes de pulso são altamente repetitivo, mas a duração do pulso varia por aproximadamente 1 ms entre repetições. A amplitude de pulso real diverge a amplitude de pulso prescrita quando um grande número de poços é carregado, e a amplitude prescrita é elevada (ver Figura 2B). Como a amplitude de deslocamento de fase é aumentada além de 3 milímetros, a amplitude de deslocamento real cada vez mais fica aquém da amplitude de deslocamento prescrito (ver Figura 2B). Alinhamento cuidadoso do bloco post elimina qualquer tendência na tensão de membrana através de linhas ou colunas (Figura 2). A 3.5 mm prescrita a amplitude de deslocamento de fase (amplitude de deslocamento real de 3,3 mm) com 52 poços recuados, a tensão média de Lagrangiana em todos os locais bem era 0.451 (desvio-padrão dos meios para todas as localizações = 0,051, média dos desvios-padrão para todos os locais = 0.065, n = 5 medições por alvéolo). Estes resultados são aqui apresentados estão completos embora alguns deles já foram relatados11.
Uma cultura ideal, ileso terá poucas ou nenhumas grupos de mais de 5 células. Neuritos será individual, longo, esbelto e curvo com pouco ou nenhum sinal de tensão ou perolização (Figura 3A). Sob condições ideais, a viabilidade das culturas deve aproximar a viabilidade especificada na folha de dados do fabricante (normalmente 60-70%) e culturas em silicone devem se parecer com aqueles mantidos em substratos de cultura rígida convencional ( Figura 3B). Neuritos podem ou não ser visíveis em um microscópio de campo claro de baixa potência. Concentração de laminina e densidade celular ambos influenciam culturas na linha de base e após a lesão. Aumento da densidade celular aumentou o número e tamanho dos aglomerados que formaram na cultura. Aumentando a concentração de laminina frequentemente contrariadas este efeito (Figura 3A). No entanto, aumentar a laminina, concentração muito malhado a sensibilidade das culturas a lesão (Figura 4). A concentração de laminina ideal para culturas ilesos era 50 µ g/mL de laminina (Figura 3), mas a separação ideal entre as populações de feridos sham e estiramento obteve-se a 10 µ g/mL de laminina (Figura 4). Altas concentrações de laminina reduziram a sensibilidade das culturas a lesão em curto espaço de tempo pontos (Figura 4), mas também de base melhorada viabilidade celular em pontos de tempo mais longos (por exemplo, 7 dias). Em resumo, vale a pena para otimizar a concentração de laminina para cada cenário experimental.
Tensão de membrana, ponto da imagem latente do tempo pós-lesão, laminina concentração e densidade celular todos exerceram um efeito principal altamente estatisticamente significante sobre o comprimento do axônio por célula (ANOVA, p < 0,001). O efeito da tensão de membrana no comprimento do axônio por célula tiveram interações altamente significativas com pós-lesão imagem tempo ponto e laminina concentração (ANOVA, p < 0,001) e uma interação significativa com célula densidade (ANOVA, p < 0,05). Da mesma forma, tensão de membrana, pós-lesão imagem ponto de tempo, cela a densidade, e laminina concentração todos exerceu um efeito principal altamente estatisticamente significativo na viabilidade celular (ANOVA, p < 0,001). O efeito da tensão da membrana na viabilidade celular teve uma interação altamente significativa com o ponto de tempo pós-lesão de imagem (ANOVA, p < 0,001) e uma interação significativa com a densidade celular (ANOVA, p < 0,05). Estes resultados comprovam que sincronismo, densidade celular e laminina concentração exercem uma influência importante sobre a relação entre o insulto aplicado e resultados experimentais, para que cada um deve ser otimizado com cuidado.
Viabilidade celular baixa e neuritos frisados, juntamente com crescimento atrofiado axônio, indicam as condições de cultura tóxicos que podem surgir de forma inadequada preparado do silicone. Ignorando-o ou diminuindo o banho de água ou o forno seco pode deixar etanol absorvido ou água na membrana, respectivamente, que podem difundir na mídia e sublinhar as células. Culturas bem lesionadas serão ter reduzido viabilidade celular, neuritos reduzidos ou ausentes, frisados neuritos e neuritos aquele olhar tenso ou esticado. Lesão pode induzir aglutinação em culturas de células que estavam bem disperso pré-lesão. Grandes massas que podem confundir a análise morfológica. Para análise morfológica, o nível de prejuízo deve ser afinado que ocorrem mudanças perceptíveis, mas as células estão ainda presentes com alguns neuritos.
Figura 1 : A rotulado esquemática do dispositivo lesão. (A) vista superior, vista isométrica (B), (C) vista frontal, vista do lado direito (D). Barra de escala aplica-se para as vistas ortogonais (A, B e D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Cinemática do insulto mecânico. (A), o deslocamento de fase histórias sobre 5 pulsos em uma gama de amplitudes prescritas (amplitudes prescritos são listados na legenda) quando não há poços são carregados. (B) o deslocamento de fase histórias sobre 10 pulsos em uma gama de amplitudes prescritas (amplitudes prescritos são listados na legenda) quando 52 poços são carregados. (C) a tensão média em cada poço com amplitude de deslocamento de fase de 3,3 mm (n = 5 medições por alvéolo, média erro-padrão por alvéolo = 0,029). Observe que o C4-F4 e F9 C9 são poços de controle unstretched. Esta figura foi modificada de Sherman et al . 11 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Otimização de cultura condições em silicone. (A) o efeito da variação de concentração de densidade e laminina células em culturas de hiPSCN em silicone. Aglutinando aumenta com o aumento da densidade celular e diminuindo a concentração de laminina. Concentração de densidade e laminina células deve ser otimizada para atingir culturas mono-dispersos. Mono-dispersos culturas são menos vulneráveis aos artefatos durante a quantificação. Observe que a faixa dinâmica foi ajustada para otimizar a visualização dos neuritos. Como consequência, o soma muito mais brilhante estão saturados. Esta apresentação é preferível à alternativa de otimização da gama dinâmica com relação a soma, o que torna o muito redutor neuritos quase invisível. A condição, destacada-se a Praça Vermelha foi considerada ideal para em vitro experiências de lesão de estiramento. (B) sob condições ideais, culturas nas membranas de silicone parecem semelhantes às culturas em substratos rígidos convencionais. O painel esquerdo mostra hiPSCNs cultivadas em 33.750 células/cm2 com 3,3 µ g/mL de laminina em uma placa de 96 poços convencional, rígida (o substrato de cultura de células é um olefina cíclica de cultura de tecidos Tratado co polímero). O painel direito reproduz o painel delineado em vermelho do (A). Barras de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : O fenótipo da lesão e sua dependência na concentração de laminina. (A) cultura saudável, usando 10 µ g/mL laminina e 67.500 células/cm2. Neuritos são comprimento com sem grânulos. Existem alguns núcleos de morto e poucos pedaços. (B) cultura usando as mesmas condições de cultura, ferido com a tensão de pico de 57% e fotografada após 4 h. neuritos são encurtados ou ausente e alguns têm grânulos (indicados pelas setas). Existem menos células de calceína AM-positivo e mais calceína AM-negativo (ou seja, morto) núcleos. Lesão aumentou aglutinação entre as células sobreviventes. (C) 4 h após a lesão, o comprimento do axônio por célula declina com o aumento da tensão de uma forma que depende da concentração de laminina. (D) 4 h após a lesão, viabilidade celular diminui com o aumento da tensão de uma forma que depende da concentração de laminina. (E) 24 h após a lesão, o comprimento do axônio por célula declina com o aumento da tensão de uma forma que depende da concentração de laminina. (F) 24 h após a lesão, viabilidade celular diminui com o aumento da tensão de uma forma que depende da concentração de laminina. (n = 4 por bar, barras de erro são ± 1 desvio padrão, barras de escala = 100 µm). Valores de tensão são deduzidas a partir de deslocamento de fase usando os dados de uma publicação prévia por Sherman et al . 11 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 1: técnicas de desenho do indenter. Clique aqui para baixar esta figura.
Suplementares tabela 1: costume-construído dispositivos. Clique aqui para baixar esta tabela.
Suplementares tabela 2:96 placa bem-carregador Pinout diagrama de fiação. Clique aqui para baixar esta tabela.
Arquivo complementar de código 1: desenhos de projeto auxiliado por computador do dispositivo lesão. Clique aqui para baixar este arquivo.
Complementares código arquivo 2: desenhos de projeto auxiliado por computador da mordaça fabricação placa. Clique aqui para baixar este arquivo.
Complementares código arquivo 3: representação em 3D da geometria do carimbo, adequada para uso com uma impressora 3D. Clique aqui para baixar este arquivo.
Complementares código arquivo 4: SubVI para MuStLiMo_si_initialize.vi, que é um SubVI para motion_control.vi. Converte as entradas nas caixas de diálogo em parâmetros para o movimento. Clique aqui para baixar este arquivo.
Complementares código arquivo 5: SubVI para vários Moves_simplified.vi de linha reta, que é um SubVI para motion_control.vi. Converte as entradas nas caixas de diálogo em parâmetros para o movimento. Clique aqui para baixar este arquivo.
Complementares código arquivo 6: SubVI para position_tracker.vi. Deslocamento de faixas de balcão de entrada do codificador linear. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo de código complementar 7: Base LabVIEW Project. Clique aqui para baixar este arquivo.
Complementares código arquivo 8: Top nível VI que move o dispositivo. Clique aqui para baixar este arquivo.
9 de arquivo de código complementar: SubVI para motion_control.vi. Executa o deslocamento rápido que se estende a placa. Clique aqui para baixar este arquivo.
10 de arquivo de código complementar: SubVI para motion_control.vi. Executa o deslocamento lento que move o palco. Clique aqui para baixar este arquivo.
Complementares código arquivo 11: SubVI para motion_control.vi. Parcelas de uma história de deslocamento (geralmente rarefeitas) no painel de controle motion_control.vi. Clique aqui para baixar este arquivo.
Complementares código arquivo 12: Top nível VI que registra a história de deslocamento. Clique aqui para baixar este arquivo.
Complementares código arquivo 13: Variable2 contém, que se comunica entre motion_control.vi e position_tracker.vi. Clique aqui para baixar este arquivo.
Complementares código arquivo 14: esquemático para placa de circuito impresso. Clique aqui para baixar este arquivo.
15 de arquivo de código complementar: Layout para placa de circuito impresso. Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussion
A chave para a obtenção de uma consistente, fenótipo biofidelic neste modelo está aplicando um insulto mecânico biofidelic consistente. Este modelo pode gerar pulso durações tão curtas quanto 10 a 15 ms, que são semelhantes para as durações de pulso para impactos de cabeça humanas de acordo com experimentos cadavérico12,13. A consistência deste insulto varia de acordo com o alinhamento da placa com o bloco do indenter e lubrificação consistente dos indenters. Quando o bloco do indenter está bem alinhado, não há nenhuma tendência a deformação aplicado através de linhas ou colunas (Figura 2). Uma fina camada de lubrificante normalmente cria menos atrito do que uma camada espessa e viscosas graxas não são recomendadas porque falta o silicone e obstruir a passagem da luz durante a microscopia. A amplitude de deslocamento de fase real pode aquém substancialmente a amplitude de deslocamento prescrito quando muitos indenters são utilizados, e a amplitude de deslocamento de fase prescrita é grande (> 3 mm). No entanto, enquanto o deslocamento real é menor do que o prescrito deslocamento em grandes amplitudes, continua a ser repetível (Figura 2B). Portanto, amplitudes de deslocamentos grandes, real podem ser obtidos confiavelmente inserindo um valor prescrito excedam o valor desejado. Amplitude de deslocamento é importante só porque é um proxy facilmente gravado para a tensão de membrana de pico, que mede diretamente o insulto mecânico que induz a patologia. Portanto, o procedimento descrito para determinar a tensão de membrana de deslocamento de fase é crítico. Este processo deve ser repetido se qualquer grandes mudanças são feitas no sistema que afetam a interação entre a placa e os indenters, por exemplo, se for diferente indenters de diâmetro, do indenter diferentes materiais ou revestimentos ou diferentes tipos de silicone placa de fundo são usados. O processo de realinhamento do bloco do indenter e determinar a posição de zero deve ser repetido no início de cada experimento. Um diagrama esquemático do dispositivo alongamento é mostrado na Figura 1. Modelos CAD necessários para reproduzir o dispositivo são fornecidos como materiais complementares: ' dispositivo de lesão - conjunto completo - 3D genéricos. PASSO '; a conta associada de materiais fornecidos comosuplementares tabela 1: Custom construiu dispositivos - BOM.xlsx. Consulte também complementar tabela 2 96 bem placa _loader – Pinout fiação Diagram.xlsx, que descreve as conexões cabos que conectam os vários componentes dos sistemas. 'Interconnector_circuit_board.dip' descreve uma placa de circuito que interliga os cabos.
Se o dispositivo está desativado com o palco no meio do seu curso, o estágio vai passar depois que a energia é cortada, porque é com mola. Quando a energia for restaurada, o circuito de retroalimentação irá detectar uma diferença grande entre a última posição prescrita e a posição real. Isso fará com que o estágio mover-se de repente para a posição que estava quando o dispositivo foi desativado. Este movimento repentino pode causar erros na saída do codificador, assim que cuidado deve ser tomado para desactivar o dispositivo somente quando ele é em sua energizados posição de descanso no topo da sua viagem.
A braçadeira de fabricação é projetada para reunir a placa inferior de silicone e corpo de uma forma que permite a ligação ideal. Para este efeito, existem três características principais no projeto apresentado no arquivo suplementar ' imprensa morrer - 3D genéricos. PASSO '. Primeiro, o suporte de corpo de chapa braçadeira é paralela ao fundo do silicone. Não se este é corretamente construído, exigirá nenhum ajuste após a instalação inicial. Em segundo lugar, a camada de espuma de borracha no grampo fornece uma pequena quantidade de conformidade sob a placa, como um sistema completamente rígido teoricamente iria experimentar um súbito aumento de zero força de aperto para infinita força de aperto quando o grampo foi fechado. A posição da trave e parafuso de fixação do grampo são ajustáveis para que a distância entre os dois lados da pinça pode ser afinada.
Todos os esforços devem fornecer um fundo brilhante, branco atrás do ponto na parte inferior bem durante experimentos de caracterização de estirpe. Melhor o contraste nestas imagens, mais fácil será para automatizar o processo de medir a altura e largura do ponto, que pode se tornar entediante para um operador humano analisando um grande experimento. Videografia de alta velocidade, de fundo de um poço em uma placa de 96 poços apresenta desafios porque as paredes do poço tendem a projetar sombras. O uso de uma cúpula de luz ou luz axial difusa que pode iluminar-se ao longo da linha de visão da câmera sem obscurecer a imagem elimina sombras ou reflexos especulares que surgem com uma fonte de luz convencional. A mais brilhante fonte de luz disponível deve ser usada porque a iluminação brilhante permite que as imagens a serem adquiridos com um tempo de exposição curto. Tempos de exposição curtos minimizam de motion blur. Atualizando a luz emitindo-se diodos (LEDs) na luz difusa axial permite tempos de exposição mais curtos durante a aquisição de vídeo de alta velocidade. Os LEDs podem ser atualizados através da abertura a luz difusa e axial, removendo o estoque de LEDs, montagem 4 de alta potência LED matrizes para o painel traseiro usando LEDs titulares, conectando-os a uma fonte de alimentação de corrente constante e voltar a montar a luz difusa axial (ver tabela de de Materiais para os números de catálogo). A desvantagem de atualizar os LEDs é que os LEDs passivamente resfriados não podem ser mantidos por mais de alguns segundos devido ao risco de sobreaquecimento. Portanto, uma luz diferente é necessária para o alinhamento do ajustamento pós-bloco e câmera.
O método apresentado de quantificar a tensão de membrana, medindo a dilatação de um ponto carimbado para a membrana é relativamente primitiva, mas ele pode escalar até vários poços de forma robusta. O campo de tensão através da parte inferior bem pode ser caracterizado em mais detalhes usando a correlação da imagem digital. Esta técnica envolve a pulverização um padrão salpicado na base do poço e depois de imagens em alta velocidade durante a deformação. Software comercial, então, pode ser usado para quantificar a tensão em cada ponto da imagem seguindo a evolução do padrão salpicado.
Este protocolo produz um fenótipo de lesão multi-facetada, clinicamente relevantes, estiramento em hiPSCNs. Morte celular e degeneração do axônio axônio perolização são tudo bem documentadas sequelas de TCE em humanos e animais modelos15. A chave para o sucesso deste modelo é estabelecer e manter culturas saudáveis. De um modo geral, um protocolo de cultura celular desenvolvido com placas rígidas convencionais é um ponto de partida útil para cultura de placa stretchable. No entanto, sempre deve ser considerada a possibilidade de que as células em questão podem responder diferentemente em silicone. Isto é particularmente verdadeiro de hiPSCNs, que são muito sensíveis às condições de cultura. Alguns exemplos de otimização de concentração de densidade e laminina células são fornecidos na seção de Resultados de representante (Figura 3, Figura 4). Ativação do silicone com tratamento de plasma é vital. Silicone é hidrofóbica e ́; em seu estado natural, não vinculará a laminina ou outras moléculas usadas para promover a fixação da célula. Tratamento de plasma processa a superfície hidrofílica e expõe os grupos reativos. Estas alterações permitem que moléculas de adesão ligar para o silicone e promover a fixação da célula. É importante notar que o efeito do tratamento de plasma dissipa-se em poucos minutos a menos que a superfície está submersa no líquido, e então os procedimentos que envolvem a secagem da superfície ativada devem ser realizados logo que possível. Uma maneira simples de verificar se o efeito do tratamento de plasma desgastou fora é colocar uma gota de água sobre a superfície. Em silicone não tratado, a gota será talão acima, Considerando que na plasma Tratado silicone, vai se espalhar para fora. Com o hiPSCNs que usamos (ver Tabela de materiais), o fabricante recomenda adicionando a laminina com a suspensão de células em vez de pre-revestimento. Este protocolo incorporou essa abordagem com êxito. Enquanto a segmentação pode, em teoria, ser realizada com software open source ou linguagens de programação de uso geral, um alto grau de proficiência com essas ferramentas é necessário para obter bons resultados. Neuritos são frequentemente difíceis de distinguir do sinal de fundo porque eles são tão esbelto. Portanto, recomendamos o uso de ferramentas de software comerciais distribuídos por empresas de elevado conteúdo de microscopia com módulos dedicados para segmentação e quantificação dos neurônios, se eles estiverem disponíveis. Mesmo com o software comercial, é sábio exportar imagens da segmentação para verificar visualmente a exactidão.
Existem algumas limitações associadas trabalhando em placas stretchable comparadas ao trabalhar com placas convencionais, rígidas. Stretchable placas podem ser fotografadas como normal com objectivos de ar. No entanto, a imagem latente com objectivos de imersão é muito difícil. Lente de petróleo pode danificar o silicone. Além disso, o objetivo exerce pressão sobre a membrana de silicone, enquanto se move para cima. Esta pressão desloca a membrana verticalmente, tornando difícil de levar a amostra em foco. As membranas de silicone usadas atualmente na fabricação das placas são aproximadamente 250 µm de espessura. Esta espessura excede a distância focal de muitos de alta potência, objectivos de imersão. Deve ter especial cuidado para colocar as membranas perfeitamente plana antes de fixar para alcançar o nivelamento necessário para microscopia. Sistemas de focagem automática de desvios podem compensar no nivelamento da placa terminada em certa medida. Versões futuras do protocolo podem pre-tensão da membrana antes que é ligado a parte superior da placa para garantir a planicidade. O procedimento sem cola para colagem da membrana do silicone para a placa top14 é considerado uma importante força do protocolo atual. Elimina o risco de neurotoxicidade do adesivo, bem como quaisquer desvios no nivelamento devido à não-uniforme de espessura da camada de adesivo.
Eletrodo multi matrizes são comumente usados em experimentos com hiPSCNs para avaliar a sua maturidade e funcionalidade. Infelizmente, esses sistemas são incompatíveis com este modelo porque o substrato de cultura de célula é rígido. É possível criar uma matriz de multi eletrodo stretchable, embora isto até agora só foi demonstrado em um único bem formato16,17. Observe que indenters podem ser removidos individualmente do bloco do indenter para que alguns poços não são recuados e podem servir como Souza. Remover o indenter impede recuo, mas não elimina completamente carregamento mecânico, desde que não há movimento ainda por inércia do fluido nos poços, enquanto o palco está se movendo. Vale a pena comparar esses poços poços em placas que foram nunca sujeitos a movimento de palco para medir qualquer influência patológica do movimento do fluido. Além disso, a matriz de indenters no bloco deve ser bisymmetric (simétrica da frente para trás e para os lados). Esta precaução garante que a placa é uniformemente carregada durante o recuo, para que o palco não inclinar para o lado e causar as barras vincular em seus rolamentos.
Um dos principais desafios para inovação terapêutica em neurotrauma é a complexidade e heterogeneidade da condição. Trauma aplica stress multimodal para cada tipo de célula no sistema nervoso central simultaneamente. Os neurônios foram confiantemente gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSCs) e estão amplamente disponíveis de fornecedores comerciais. Inovação é avançar rapidamente neste campo, e outros tipos de células neurais como astrócitos18 e microglia19 também estão sendo derivados de hiPSCs. Logo é possível isolar as célula autónomos respostas de cada um desses tipos de célula para trauma em vitro e em seguida co-cultura diferentes tipos de células para entender como eles se comunicam após trauma. Desta forma, em última análise, pode ser possível recriar o desafio clínico do fundo acima de completamente compreendê-lo em um sistema humano. Esta abordagem difere da abordagem convencional, baseando-se em modelos de roedores e tem o potencial de gerar novos insights que levam para as terapias de primeiras para esta condição comum, devastador e intratável.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho é financiado em parte por uma concessão do National Institutes of Health (R21NS098129). Nós gostaríamos de reconhecer a excelente assistência técnica de SueSan Chen, Jonathan Tan, Courtney Cavanaugh, Shi Kai Ng e Feng Yuan Bu, que projetou e construiu uma estrutura para suportar as luzes usadas durante experimentos de imagem de alta velocidade descritos neste manuscrito .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| .010" Silicone Sheet | Specialty Manufacturing, Inc | #70P001200010 | Polydimethylsiloxane (PDMS) sheet |
| Sparkleen | Fisher Scientific | #043204 | |
| Nunc 256665 | Fisher Scientific | #12-565-600 | Bottomless 96 Well Plate |
| Kim Wipes | ULINE | S-8115 | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | #PDC-001-HC | |
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane | Sigma-Aldrich | #440140 | APTES |
| Parchment Paper | Reynolds | N/A | |
| Dome Light | CCS inc | LFX2-100SW | |
| Dome Light Power Supply | CCS inc | PSB-1024VB | |
| Axial Diffuse Lighting Unit | Siemens | Nerlite DOAL-75-LED | Diffuse axial light |
| High Power LED Array | CREE | XLamp CXA2540 | High Power LED Array |
| LED holder | Molex | 1807200001 | LED Holder |
| LED power supply | Mean Well | HLG-320H-36B | Constant Current Power Supply |
| FastCam Viewer software | Photron | camera softeware | |
| Fastcam Mini UX50 | Photron | N/A | High Speed Camera |
| Micro-NIKKOR 105mm f/2.8 | Nikon | #1455 | High Speed Camera Lens |
| 0.1 mg/mL Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | #P4597 | |
| iCells | Cellular Dynamics International | #NRC-100-010-001 | |
| iCell media | Cellular Dynamics International | #NRM-100-121-001 | |
| iCell supplement | Cellular Dynamics International | #NRM-100-031-001 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L2020 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | #H3570 | |
| Calcein AM | Fisher Scientific | #C3099 | |
| voice coil actuator | BEI Kimco | LA43-67-000A | |
| optical linear encoder | Renishaw | T1031-30A | |
| servo drive | Copley Controls | Xenus XTL | |
| Controller | National Instruments | cRIO 9024 Real Time PowerPC Controller | |
| cRIO chassis | National Instruments | cRIO 9113 | |
| digital input module | National Instruments | NI 9411 | |
| data acquistion chassis | National Instruments | NI 9113 | |
| LabVIEW | National Instruments | instrument control software | |
| hiPSCNs | Cellular Dynamics International |
References
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