Incorporer les péricytes dans une perle de cellules endothéliales test de germination

Résumé

Cette présente protocole une perle roman in vitro d’analyse que plus modèles convenablement le processus d' in vivo la germination de l’angiogenèse en incorporant des péricytes. Cette modification permet le dosage de la perle à récapituler plus fidèlement les interactions cellulaires hétérotypiques entre cellules endothéliales et murales qui sont essentiels pour l’angiogenèse.

Résumé

L’angiogenèse est la croissance de nouveaux vaisseaux du système vasculaire préexistante et est un élément important de nombreux processus biologiques, y compris l’embryogenèse et développement, la cicatrisation, la croissance tumorale et les métastases et les maladies cardiovasculaires et oculaires. Modèles efficaces in vitro qui récapitulent la biologie de l’angiogenèse sont nécessaires pour bien étudier ce processus et identifier les mécanismes de régulation qui peuvent être ciblés en fin de compte, de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le dosage de l’angiogenèse perle a été démontré précédemment pour récapituler les étapes multiples de germination endothéliales in vitro. Toutefois, une limitation de ce test est un manque d’endothéliales – interactions cellule murale, qui sont essentiels à la régulation moléculaire et phénotypique des cellules endothéliales function in vivo. Le protocole donné ici présente une méthodologie pour l’intégration de cellules murales dans le dosage de l’angiogenèse perle et montre une association étroite des cellules endothéliales et péricytes au cours de la germination in vitro. Le protocole détaille également une méthodologie de silençage efficace des gènes de cible à l’aide de siARN dans les cellules endothéliales pour études mécanistes. Au total, ce protocole prévoit un test in vitro qui mieux modélise les types de cellules différents impliqués dans l’angiogenèse de germination et fournit une plate-forme plus physiologiquement pertinents pour l’évaluation thérapeutique et découverte de mécanismes de régulation de l’angiogenèse.

Introduction

L’angiogenèse est vital à l’embryogenèse approprié et la cicatrisation des plaies, et il joue aussi des rôles clés dans nombreuses maladies, incluant les cancer progression des maladies coronariennes et¹ . ^{2 , 3} avoir une meilleure compréhension de comment l’angiogenèse se produit au cours du développement normal, et comment elle est réactivée dans des contextes pathologiques, est critique pour le développement du roman, thérapeutique efficace. Fidèle à vitro modèles qui récapitulent les étapes importantes et les types cellulaires impliqués dans l’angiogenèse in vivo s....

Protocole

Jour 1 :

1. transitoire Transfection des cellules endothéliales

1. Si vous le souhaitez, réaliser une transfection transitoire de humaine ombilicale veine endothélial cellules (HUVEC) utilisant des oligonucléotides gène réglementaires (p. ex. micro-ARN ou petits ARN interférents (siARN)) et le réactif de lipofectamine appropriées conformément à instructions du fabricant.
   Remarque : Ce protocole a eu beaucoup de succès effectuant des transfections inverses avec des séquences de siARN personnalisé et un réactif de transfection commerciale (voir le tableau des matériaux). Les auteurs n’ont pas été testés aut....

Résultats

Ce protocole permet une association étroite de la deux cellule types in vitro, et la présence de la péricytes vient compléter l’occurrence de germination (Figure 1 a, B). Le protocole permet également efficace silencieux (par exemple via l’interférence ARN) d’un gène d’intérêt dans un type de cellule d’intérêt comme (VEGFA spécifiquement dans les cellules endothéliales) ou PDGFRβ en péricytes^7,

Discussion

Ce protocole présente une méthode permettant de caractériser les étapes complexes et des interactions cellulaires hétérotypiques de germination angiogenèse en permettant au chercheur d’employer des approches génétiques et d’imagerie, de mener des enquêtes approfondies mécanistes. Lorsque vous effectuez le test, il est essentiel qu’efficace revêtement endothélial des perles se déroule pendant le talon étapes d’agitation. Revêtement endothélial pauvres seront évidente, si les perles ne semblent pas avoir une surface rugueu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pointes de pipette stériles	VWR
Pipettors	Eppendorf
Complete EGM2 Media Bullet Kit	Lonza	CC-3162	HUVEC Media
MEM	Gibco	11095114	10T1/2 Media
DMEM	Gibco	11965118	NHLF
Media PBS de qualité culture tissulaire Gibco		14190-144	Sans magnésium ni calcium
Accutase	Life Technologies	A1110501	Pour le levage HUVEC
Trypsin	Life Technologies	15050065	Pour le levage 10T 1/2 et NHLF
Customs siRNAs	Sigma
Lipofectamine RNAiMax	Life Technologies	13778150
HUVEC	Lonza	C2517A
10T 1/2	ATCC
NHLF	ATCC
Cytodex 3 billes de microsupport	Sigma	C3275
Plaques de 6 et 10 cm recouvertes de culture tissulaire	Corning
Fibrinogène de plasma bovin	Sigma	F8630
Thrombine	Sigma	t9549
Aprotinin	Sigma	a3428
Falcon Round-Bottom Tubes	Corning
Incubateur et capot
Plaques à fond en verre à 24 puits	MatTek	P24G1.513F	Les plaques à fond en verre ne sont nécessaires que si les germes doivent être imagés. Sinon, le plastique de culture tissulaire est également acceptable.
			de filtration stérile

de culture tissulaireDispositif