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Genetics

Anpassung der 3' endet rasche Verstärkung der CDNA Transkripte in Krebs zuordnen

Published: March 28, 2018 doi: 10.3791/57318
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy and Health Sciences, Butler University

Summary

Die zwei verschiedenen 3' schnelle Verstärkung der cDNA enden (3' Rennen) Protokolle beschrieben hier machen Verwendung von zwei verschiedene DNA-Polymerasen Sequenzen zuordnen, die ein Segment der offenen Leserahmen (ORF), das Stopp-Codon und die gesamte 3' UTR eine Niederschrift mit RNA enthalten aus verschiedenen Krebszelllinien gewonnen.

Abstract

Reifung der eukaryontischen mRNAs beinhaltet 3' Ende Bildung, beinhaltet die Zugabe eines Poly-Schwanzes. Um die 3'-Ende eines Gens abbilden zu können, ist die traditionelle Methode der Wahl 3' schnelle Verstärkung der cDNA enden (3' Rennen). Protokolle für 3' Rennen erfordern sorgfältige Planung und Auswahl der verschachtelten Primer innerhalb der 3' untranslatierten Region (3' UTR) des Zielgens von Interesse. Mit ein paar Modifikationen kann jedoch das Protokoll verwendet werden, um die gesamte 3' UTR und Sequenzen innerhalb der offenen Leserahmen (ORF), bietet ein noch umfassenderes Bild der Beziehung zwischen dem ORF und der 3' UTR. Dies ist neben der Kennzeichnung Polyadenylation Signal (PAS), sowie der Spaltung und Polyadenylation Website von herkömmlichen 3' Rennen zur Verfügung gestellt. Erweiterte 3' Rennen erkennt ungewöhnlichen 3' wo, einschließlich gen Fusionen innerhalb der 3' UTR, und die Sequenzinformation kann verwendet werden, um vorherzusagen, potenzielle MiRNA Bindungsstellen sowie AU reichen destabilisierende Elemente, die die Stabilität der Abschrift beeinträchtigen können.

Introduction

Die Bildung von 3'-Ende ist ein entscheidender Schritt in mRNA-Reifung, die besteht aus der Spaltung der Pre-mRNA flussabwärts ein Pas, gefolgt von dem Zusatz von ~ 250 Untemplated Adenines, die Poly Tail1,2ausmachen. Poly-Bindeprotein (PABP) bindet an das Poly-Heck, und das schützt die mRNA-Transkript vor Abbau und erleichtert die Übersetzung1.

Aktuelle Schätzungen gehen davon aus, dass 70 % der menschlichen Gene mehrere PASs haben und somit alternative Polyadenylation, wodurch mehrere 3' Enden3zu unterziehen. So ist es wichtig zu erkennen, wo die Poly-Rute für den Rest der 3' UTR legt, sowie identifizieren die PAS von jeder gegebenen Protokoll verwendet. Das Aufkommen der Sequenzierung der nächsten Generation führte die gleichzeitige Identifikation von 3' wo und den PASs von tausend Genen. Dieser Anstieg der Sequenzierung Fähigkeit erforderte die Entwicklung von der bioinformatische Algorithmen für die Datenanalyse mit alternative Polyadenylation vom 3'-Ende. Für die de-Novo -Erkennung oder Validierung des PAS und damit des 3' Endes einzelner Gene von großflächigen Sequenzierungsdaten mapping bleibt 3' Rennen die Methode der Wahl4,5. Die Sequenzen in cDNA-Produkte von 3' Rennen enthalten normalerweise enthalten nur einen Teil der 3' UTR, die Poly-Tail, die Spaltstelle, PAS und die Sequenzen stromaufwärts des PAS enthält. Im Gegensatz zu PCR, wonach die Gestaltung und Nutzung von Gen spezifische forward und reverse Primer benötigt 3' Rennen nur zwei Gen spezifische verschachtelte forward Primer. PCR erfordert daher eine genauere Kenntnis der Nukleotidsequenz einer großen Region des Gens wird verstärkt4,6. Da 3' Rennen verwendet umgekehrt das gleiche Grundierung, dass Ziele der poly(A) tail für alle Polyadenylated RNA-Transkripte, nur die forward Primer gen spezifische, müssen somit nur erfordern Kenntnisse über eine deutlich kleinere Region der mRNA. Dies ermöglicht die Verstärkung der Regionen, deren Sequenzen nicht vollständig charakterisiert4,7. Dadurch konnten 3' Rennen verwendet werden, nicht nur um festzustellen, das 3'-Ende eines Gens, sondern um auch zu bestimmen und zu charakterisieren, große Regionen oberhalb des PAS, die einen erheblichen Teil der 3' UTR bilden. Durch die Kombination von 5' Rennen mit der modifizierten 3' Rennen, die größere Teile der 3' UTR und flankierenden Regionen umfasst, ist es möglich, vollständig sequenzieren oder Klonen eine gesamte mRNA-Transkript von 5'-Ende, deren Ende 3'8.

Ein Beispiel für die Anwendung der geänderten 3' RACE ist die jüngste Identifizierung eines Romans CCND1-MRCK Fusion gen Abschrift von Mantel-Zell-Lymphom-Zell-Linien und Krebspatienten. Die 3' UTR bestand aus Sequenzen aus der CCND1 und MRCK Gene und widerspenstigen MiRNA Verordnung9war. Die zwei verschachtelte CCND1 spezifische vorwärts Primer wurden ergänzend zu der Region unmittelbar neben und hinter der CCND1 -Stopp-Codon. Obwohl ganze Transkriptom Sequenzierung zusammen mit spezifischen Bioinformatic Hilfsmittel verwendet werden kann, um gen Fusionen innerhalb der 3' UTR-10zu erkennen, können viele Labore fehlen die finanziellen Mittel oder Bioinformatic Know-how, um diese Technologie nutzen. Daher ist 3' Rennen eine Alternative zur de-Novo -Identifizierung und Validierung von Roman Fusionsgene mit der 3' UTR. In Anbetracht der drastische Anstieg der Zahl der gemeldeten Fusionsgene sowie die Transkripte durchlesen, 3' Rennen ein mächtiges Werkzeug bei der Charakterisierung von Gen-Sequenzen11,12geworden. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass diese verschiedenen Sequenzen innerhalb der 3' UTR sowie die Länge der 3' UTR mRNA-Transkript Stabilität, Lokalisierung, Übersetzbarkeit und Funktion13beeinflussen kann. Zum Teil auf ein verstärktes Interesse bei der Zuordnung des Transkriptoms, gab es eine Zunahme der Anzahl der verschiedenen DNA-Polymerasen für den Einsatz im Labor entwickelt. Es ist wichtig, festzustellen, was Arten von Änderungen an die 3' Rennen Protokoll in bestellen, nutzen Sie die verfügbaren Repertoire von DNA-Polymerasen erfolgen können.

Diese Arbeit Berichte Anpassung 3' Rennen die gesamte 3' UTR zuordnen, die PAS und die 3' Ende Spaltstelle der ANKHD1 Abschrift mit Primer im Abschnitt ANKHD1 die Abschrift und zwei verschiedene DNA-Polymerasen verschachtelt.

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Protocol

Jederzeit während der Durchführung aller Verfahren in diesem Protokoll tragen Sie ein Kittel, Handschuhe und Schutzbrille. Sicherstellen Sie, dass Container/Röhrchen mit Phenol und Guanidin Reagenz erfolgt nur in einem zertifizierten Haube und Phenol Abfälle in einem dafür vorgesehenen Behälter entsorgen geöffnet werden. DNAse/RNAse-freie sterilen Röhrchen, Tipps und Reagenzien zu verwenden.

(1) Zellkultur

  1. Wachsen die HeLa-Zelllinie und zwei Aussetzung Mantel Zelle Lymphom Zelllinien, Granta-519 und Jeko-1, in DMEM mit 10 % FBS und 100 U/mL Penicillin/Streptomycin in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 ° C. Die Zellen 01:10 verdünnen und zählen mit einem Partikel Zähler14.
  2. Für RNA-Extraktion Platte 500.000 Zellen/Brunnen in einem 6-well-Platte (2 mL Medien pro Well). Nach der Inkubation für 24 h sammeln Sie RNA aus den Zellen.

2. RNA-Extraktion

  1. Ernte der Zellen
    Hinweis: Mit Ausnahme der Zentrifugationsschritt führen Sie die aufgeführten Schritte in einer Gewebekultur-Haube zu Sterilität.
    1. Für Aufhängung Zellen (Jeko-1 und Granta-519):
      1. Übertragen Sie die Zellen (zusammen mit 2 mL der Medien) auf eine 15 mL-Tube und Zentrifugieren bei 1.725 x g für 5 min. Aspirat Medien und verlassen die Zelle Pellet in den Boden des Röhrchens.
      2. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 50 µL 1 x Phosphat Buffered Saline (PBS). Jede Probe in 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch 500 µL monophasisch Phenol und Guanidin-Herstellung-Reagenz hinzufügen. Gut mischen und lassen bei Raumtemperatur (RT) für 5 min beim invertierenden Microcentrifuge Schlauch alle 1 Minuten.
    2. Für anhaftende Zellen (HeLa):
      1. Aspirieren Sie Zellkulturmedien aus jedem Brunnen. Fügen Sie 1 mL PBS in jede Vertiefung Schmutz abwaschen.
      2. Entfernen der PBS und 500 µL monophasisch Phenol und Guanidin-Herstellung-Reagenz in jede Vertiefung.
      3. 5 min mit sanftes Schaukeln bei RT inkubieren. Auf einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch übertragen.
  2. Zell-Lyse
    1. Frieren Sie das Phenol und Guanidin erfolgt Zelle Gemisch bei-20 ° C für 1 h.
      Hinweis: Die Mischung kann bei-20 ° C über Nacht oder bis benötigt gelassen werden.
    2. Phenol und Guanidin erfolgt Zelle Masse auf Eis auftauen. Die Microcentrifuge Schlauch in einer PCR-Kapuze 100 µL Chloroform hinzufügen. Vortex ist die Probe für 10-15 s bis die Mischung, rosa und undurchsichtig. Inkubieren Sie die Probe auf dem Eis (bei 4 ° C) für 15 min.
    3. Zentrifugieren Sie die Probe für 15 min bei 20.800 x g und 4 ° C. Entfernen Sie vorsichtig die obere farblose wässrige Phase (~ 200 µL) und die Übertragung zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
  3. RNA-Niederschlag
    1. Jede Probe ein gleiches Volumen von Isopropanol hinzufügen. Fügen Sie 1 µL des Coprecipitant (siehe Tabelle der Materialien), jeweils als Träger für die RNA zu handeln und helfen die RNA in den nachfolgenden Schritten zu visualisieren. Inkubation der Probe bei-80 ° C für mindestens 4 h. Für beste Ergebnisse Inkubation über Nacht bei-80 ° C.
    2. Übertragen Sie die Probe auf einer gekühlten Zentrifuge. Zentrifuge für 35 min bei 20.800 x g / 4 ° C; die RNA wird als ein blauer Fleck auf dem Boden des Röhrchens angezeigt. Entfernen Sie vorsichtig das Isopropanol aus der Probe. Fügen Sie 500 µL von 80 % Ethanol und Aufschwemmen der Pellets durch kurz aufschütteln für 3 s.
    3. Zentrifuge der Probe bei 20.800 x g bei RT 5 min das Ethanol aus der Probe entfernen Lassen Sie die Probe an der Luft trocknen für ca. 10 min. Aufschwemmen die Probe in 35 µL RNAse-freies Wasser. Legen Sie auf einem Heizblock (65 ° C) für 5 min um sicherzustellen, dass die RNA vollständig in Lösung ist, und sofort das Rohr auf dem Eis.
    4. Bestimmen Sie die Konzentration des Gesamt-RNS mit einem Spektralphotometer, wie zuvor beschrieben, außer 1,5 µL der Probe RNA anstelle von 1 µL15verwenden. Optional laufen Sie 1 µg Gesamt-RNS auf einem 1 % Agarosegel zu bestimmen, die Integrität der RNA.

(3) DNase-Behandlung

  1. Führen Sie nach der Quantifizierung der RNA DNAse-Behandlung auf die Gesamt-RNS zu jeder genomischen DNA zu erniedrigen. Fügen Sie für jede Probe die folgenden Reagenzien aus dem RNAse-freie DNAse-Kit 20 µL Gesamt Reaktion in einem separaten Microcentrifuge Schlauch mischen zu machen hinzu:
    1. Mix 2 µL DNase 10 X Reaktion Puffer mit 4,4 µg Gesamt-RNA. Auf insgesamt 14 µL mit Wasser zu bringen.
    2. Fügen Sie 2 µL RNase-freie DNAse. Inkubation bei 37 ° C für 30 min in Anwesenheit von 2 µL RNase-Inhibitor (aus dem Reverse Transcription Kit).
    3. Fügen Sie 2 µL Stopplösung und Wärme auf einem Heizblock für 10 min bei 70 ° C, das Enzym DNAse zu inaktivieren.
      Hinweis: DNAse-Behandlung ist optional.

(4) cDNA Synthese

Für eine endgültige Reaktionsvolumen von 50 µL:

  1. Für eine endgültige Reaktionsvolumen von 50 µL: Transfer 22 µL der DNase RNA behandelt, um eine neue Röhre oder Transfer 4 µg von Gesamt-RNS mit Zusatz von Wasser auf ein Gesamtvolumen von 22 µL zu einem neuen Schlauch. Fügen Sie 2 µL der T7-Oligo-dT25 Primer von 10 µM Primer Lösung. Die Sequenz für die T7-Oligo-dT25 Grundierung ist 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 ".
  2. Fügen Sie aus dem Reverse Transcription Kit 2 µL RNase-Inhibitor (20 U/µL), 8 µL des Puffers Reaktion 5 X 4 µL 10 mM dNTPs und 2 µL Reverse Transkriptase (200 U/µL hinzu).
    Hinweis: Richten Sie eine Reaktion ohne Reverse Transkriptase als Negativkontrolle zu handeln.
  3. Inkubieren Sie bei 42 ° C für 1 h Transfer direkt zum Eis. Erhitzen Sie das Rohr bei 75 ° C für 5 min und das Rohr auf Eis.

(5) Primer Suche nach Fusion gen Transcript

  1. Besser gekleideteres design
    1. Download der cDNA-Sequenz aus dem Ensemble Genom Browser (ENST00000360839.6/NM_017747), und eine Region innerhalb der ORF das Ziel Transkript (ANKHD1) stromaufwärts von der Stopp-Codon zu identifizieren. Kopieren und einfügen die gesamte Region (bis zu 700 Nukleotide) mit Sequenzen stromaufwärts von der Stopp-Codon in der Sequenz Eintrag Region die Primer-Design-Software (< Https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).
    2. Wählen Sie die Option Show kundenspezifisch anfertigen und 10 für die Anzahl der Zündkapseln, dass das System (Ergebnisse, die zurückgegeben) generieren soll und lassen Sie alle anderen Parameter auf den Standardwert zurückgesetzt.
    3. Wählen Sie fünf forward Primer und zwei umgekehrte Zündkapseln, die sich nicht überschneiden. Bestellen Sie Grundierungen und rekonstruieren mit RNAse/DNAse-freies Wasser, eine Endkonzentration von 10 µM. Weitere Informationen zu allgemeinen besser gekleideteres Design für PCR sind an anderer Stelle behandelt16.
  2. PCR, potenzielle Primer für den Einsatz in folgenden 3' Rennen zu identifizieren
    Hinweis: Um die endgültige vorwärts Primer zu verwenden, in der Reaktion zu bestimmen, testen Sie die gestalteten Primer indem Sie verschiedene Kombinationen von forward und reverse Primer für regelmäßige PCR in einer PCR-Haube einrichten.
    1. Übertragen Sie die cDNA (2 µL) auf ein frisches 0,5 mL PCR Rohr. Fügen Sie 1 µL der forward Primer und 1 µL der rückwärts-Primer (aus einer 10 mM-Grundierung-Lösung). Machen Sie bis zu 12,5 µL, indem 8,5 µL Nuklease-freies Wasser. 12,5 µL 2 x PCR-Gel Master Mix hinzufügen.
    2. Verwenden Sie die folgenden PCR Radfahren Thermik: 95 ° C für 2 min gefolgt von 29 Zyklen von 95 ° C für 30 s, 60 ° C für 30 s und 72 ° C für 1 min. der letzte Zyklus bei 68 ° C 7 min eingestellt.
    3. Laufen Sie nach der PCR Produkte auf einem 1 % Agarose-Gel mit Interkalation Bromid befleckt. Details der Elektrophorese sind mit ein paar Modifikationen17wie zuvor beschrieben.
      1. Lösen Sie 1 g Agarose in 100 mL Puffer Tris-Acetat (TAE) in einen 250-mL-Kolben. Kochen Sie in der Mikrowelle.
      2. Abkühlen lassen für 1 min und 7,5 µL Interkalation Bromid-Lösung (10 mg/mL Brühe) in einer Dampfhaube hinzufügen. Mischen Sie gut durch Schütteln der Flasche und gießen Sie in eine horizontale Gel-Apparat. Lassen Sie bei RT in der Dunstabzugshaube für mindestens 30 min erlauben das Gel zu festigen.
      3. Decken Sie das Gel mit 1 X TAE-Puffer und laden Sie 10 µL des PCR-Produkts auf das Agarosegel zusammen mit 3 bis 5 µL DNA Molekulargewicht Leiter. Bei 175 V für 10 min. visualisieren die Produkte mit einem Imager laufen Sie, und ob weitere Trennung der Produkte erforderlich sind, führen Sie das Gel für eine weitere 5-10 min.
  3. Auswahl von verschachtelten Zündkapseln für 3' Rennen
    1. Analysieren Sie die Ergebnisse der Agarosegel PCR Primer auswählen, die eine ausgeprägte, starke, einzelne PCR-Band haben. Verwenden den 5'-die meisten Primer (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3 ") zusammen mit dem T7 OligodT25 Primer in der ersten PCR ausführen.
    2. Wählen Sie die verschachtelte Grundierung, die flussabwärts die erste Fibel befindet (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3 "), und verwenden Sie es mit dem T7-Primer (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3") im zweiten Satz der PCR-Reaktionen.

6. Optimierung 3' Rennen der 3' UTR mit Hilfe von zwei verschiedenen Enzymen zuordnen

Hinweis: Gab es eine Zunahme der Vielfalt der DNA-Polymerasen für PCR verwendet; Daher wollten wir standard-Bedingungen zu bestimmen, die angewendet werden können, auch wenn verschiedene Enzyme für 3'-RACE-PCR-Reaktionen. Die reverse Primer für jede Abschrift sind konstant gehalten; die einzigen Änderungen sind in die verschachtelte forward Primer, die spezifisch für das Ziel-Protokoll sind.

  1. Protokoll 1:3 "Rennen mit einem veränderten DNA-Polymerase aus Pyrococcus Furiosus (Pfu)
    1. Erste PCR
      1. Übertragen Sie 1 µL cDNA zu einem PCR-Schlauch zu, und fügen Sie 5 µL 10 X Pfu Reaktion Puffer. Fügen Sie 1 µL der erste verschachtelte forward Primer, 1 µL T7 OligodT25 Grundierung und 1 µL von dNTPs (aus einer 10 mM-Lösung).
      2. Machen Sie bis zu 49 µL Gesamtvolumen von 40 µL Wasser hinzufügen. 1 µL der Pfu DNA Polymerase hinzufügen und gut verrühren. Führen Sie die PCR mit dem PCR-Profil in Tabelle 1.
    2. Zweite PCR
      1. Übertragen Sie 2 µL der Produkte aus der ersten PCR zu einem neuen PCR-Schlauch und vermischen Sie sich mit 5 µL 10 X PfuUltra II Reaktion Puffer. Fügen Sie 1 µL der zweiten verschachtelten PCR-Primer, 1 µL der T7 Grundierung und 1 µL von dNTPs (10 mM-Lösung).
      2. Machen Sie bis zu 49 insgesamt µL Reaktionsvolumen durch 39 µL Wasser hinzufügen. Fügen Sie 1 µL der Pfu DNA Polymerase. Führen Sie die PCR mit dem gleichen PCR-Profil als das erste PCR Setup (Tabelle 1).
  2. Protokoll 2:3 "Rennen mit einem chimeric DNA-Polymerase bestehend aus einem DNA-bindende Domäne verschmolzen zu einem Pyrococcus-wie Korrekturlesen Polymerase PCR-master-Mix
    1. Erste PCR
      1. Übertragen Sie 1 µL cDNA auf ein PCR-Rohr. Fügen Sie 1 µL der erste verschachtelte forward Primer und 1 µL T7 OligodT25 Grundierung. Machen Sie bis zu 25 µL, indem 22 µL Wasser.
      2. 25 µL 2 x PCR Master Mix hinzufügen und gut verrühren. Nutzungsbedingungen der PCR Radfahren in Tabelle 2beschrieben.
    2. Zweite PCR
      1. Übertragen Sie 2 µL der Produkte aus der ersten PCR auf eine neue PCR-Rohr. Fügen Sie 1 µL der zweiten verschachtelten PCR-Primer zusammen mit 1 µL der T7-rückwärts-Primer.
      2. Machen Sie bis zu 25 µL, indem 22 µL Wasser. 25 µL 2 X PCR Master Mix hinzufügen. Führen Sie die PCR mit dem gleichen PCR-Profil als das erste PCR Setup (Tabelle 2).

7. Überprüfen Sie die zweite PCR-Produkt von 3' Rennen.

  1. Nehmen Sie 5 bis 10 µL der zweiten PCR-Produkt (sowie Produkt aus der ersten Runde der PCRs sofern das Transkript reichlich bemessen ist) und laufen auf einem Agarosegel. Richten Sie das Gel und führen Sie die Elektrophorese wie oben beschrieben (Schritte 5.2.3.1., 5.2.3.3). Visualisieren Sie die Ergebnisse auf ein Imager.

8. Produkt Reinigung und Sequenzierung

  1. Reinigen Sie die Gel-PCR-Produkte von der zweiten PCR mit dem Gel und PCR-Fragment DNA-Clean-Up System entsprechend des Herstellers Protokoll.
  2. Führen Sie Sanger Sequenzierung (Alternativ senden Sie das Gel gereinigt, PCR-Produkt-Proben und entsprechende Sequenzierung Primer zur Sequenzierung Labor). Analysieren Sie die Sequenzierungsdaten nach Sanger Sequenzierung.
  3. Sequenz-Analyse Software herunterladen (siehe Tabelle der Materialien) und die Trace-Dateien in die Software importieren. Verwendung der einzelnen reine Basis QVs (Werte), die Basis zu erhalten rufen Sie Informationen18. Das Chromatogramm mit hochwertigen Spuren zur Ansicht herunterladen.
    Optional: Das Gel gereinigtes Produkt kann geklont werden mit einer entsprechenden Klonen Kit und isolierten Klone für Sanger geschickt Sequenzierung.

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Representative Results

Verschachtelte Forward Primer suchen:

Das Agarosegel von Abbildung 1 zeigt zwei unterschiedliche PCR-Gelprodukte (Bahnen 1 und 2), welche das gleiche Grundierung aber verschiedene reverse Primer weiterleiten. Bahn 3 hat ein eindeutig identifizierbares PCR-Produkt und hat eine ausgeprägte vorwärts- und Grundierung. Die ideale Primer für die PCR-basierten Reaktion zu verwenden sind diejenigen, die eine unterschiedliches PCR-Produkt (Bahn 3) geben. Der forward Primer verwendet in den Bahnen 1 und 2 verleiht der stärkste Band und gibt die größte PCR-Produkte (erwartet) und dient als erste forward Primer. Die zweite verschachtelte Grundierung für die zweite Gruppe von PCR-Reaktionen in 3' RACE ist die vorwärts Grundierung von Spur 3.

Verschiedene DNA-Polymerasen verwendet in 3' Rennen produzieren ähnliche Ergebnisse:

Zwei verschiedene DNA-Polymerasen produziert die gleiche Größe PCR-Produkte trotz verschiedenen PCR-Radsport-Zustände für die 3'-RACE (Abbildung 2). Es gibt nur eine ausgeprägte Band für das erwartete PCR-Produkt. Alle von der Minus Reverse Transkriptase Negativkontrollen (-) haben keine Band zeigt keine genomische Kontamination der RNA in cDNA-Synthese sowie nachfolgende nachgeschaltete Reaktionen verwendet.

Sanger-Sequenzierung ergibt sich:

Die PCR-Produkte wurden Gel gereinigt und schickte für Sanger Sequenzierung. Die Ergebnisse in Abbildung 3A zeigt einen Teil einer Sequenz Chromatograph von Sanger Sequenzierung. Eine repräsentative Sequenz gibt den Speicherort des Stopp-Codon, vermeintliche Polyadenylation Signal sowie die Spaltstelle und Poly (A) Rute im Rennen Produkt 3' (Abb. 3 b).

Figure 1
Abbildung 1: Identifizierung von zwei verschachtelte gen spezifische forward Primer in 3' Rennen verwenden. Dargestellt ist ein Beispiel für PCR-Produkte von verschiedenen Kombinationen des Gens spezifisch nach vorne und reverse Primer mit HeLa cDNA auf einer Interkalation Bromid gefärbten Agarosegel mit dem Molekulargewicht (Mw) Leiter laufen. Bahnen 1 und 2 sind PCR-Produkte von der gleichen Gen spezifischen forward Primer aber verschiedene reverse Primer. Die Pfeile zeigen auf das erwartete PCR-Produkt für jede Fahrspur. Neben der Band für das erwartete PCR-Produkt ist eine weitere Band. Die einzelnen PCR-Produkt in Bahn 3 ist von einer unterschiedlichen Gen spezifischen verschachtelte vorwärts und rückwärts Primer und zeigt die einzelnen erwartete Band.

Figure 2
Abbildung 2: Überprüfung der 3' RACE Produkte aus dem zweiten Satz der PCR-Reaktionen. Produkte aus der zweiten PCR-Reaktion mit (A) Pfu DNA Polymerase und (B) Chimeric DNA Polymerase wurden auf einem Agarosegel mit Interkalation Bromid ausgeführt. Spuren von (-) dargestellt sind aus der Negativkontrolle Probe für jede Zelllinie cDNA Synthese von RNA in Abwesenheit des Enzyms Reverse Transkriptase durchgeführt wurde. Bahnen 1 und 2 sind PCR-Produkte von biologischen Wiederholungen für jede Zelllinie. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Zuordnung der PCR-Produkte von 3' Rennen. (A) A Teil einer Sequenz Chromatogramm eines Gel gereinigt 3' Rennen Produktes zeigt das vorhergesagte Polyadenylation Signal und die Lage der Poly-Schwanz. (B) Vertreter Sequenzen aus Sanger-Sequenzierung-Daten zeigt das Stopp-Codon, Polyadenylation Signal (PAS), die Spaltung und Anhaftung Website der Poly-Schwanz sowie Teile des Poly (A) Rute Sequenzen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Zyklus-Schritt Temperatur und Dauer Anzahl der Zyklen
Anfängliche Denaturierung 95 ° C für 3 min 1
Anfängliche Glühen und Erweiterung 50 ° C für 5 min und 72 ° C für 10 min 1
Subcyles (Denaturierung, Glühen und Erweiterung) 95 ° C für 40 s, 50 ° C für 1 min und 72 ° C für 3 min 20
Letzten Zyklus (Denaturierung, Glühen und Erweiterung) 95 ° C für 40 s, 50 ° C für 1 min und 72 ° C für 15 min 1
Halten 4 ° C, ∞

Tabelle 1: Pfu DNA Polymerase PCR Radfahren Bedingungen für 3' Rennen.

Zyklus-Schritt Temperatur und Dauer Anzahl der Zyklen
Anfängliche Denaturierung 98 ° C für 3 min 1
Anfängliche Glühen und Erweiterung 50 ° C für 5 min und 72 ° C für 10 min 1
Subcyles (Denaturierung, Glühen und Erweiterung) 98 ° C für 30 s, 1 min, 50 ° C und 72 ° C für 4 min. 20
Letzten Zyklus (Denaturierung, Glühen und Erweiterung) 98 ° C für 30 s, 1 min, 50 ° C und 72 ° C für 15 min 1
Halten 4 ° C, ∞

Tabelle 2: Chimeric DNA Polymerase PCR Radfahren Bedingungen.

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Discussion

Trotz des Aufkommens der massiven parallelen Sequenziertechnologien auf Basis gen von gen bleibt 3' Rennen immer noch die einfachste und wirtschaftlichste Methode zur Identifizierung der PAS und Nukleotide angrenzend an das Poly-Heck. Die hier beschriebene Anpassung erweitert mit 3' Rennen sowohl verstärken als auch Karte Sequenzen, die einen Teil des ORF, das Stopp-Codon und die gesamte 3' UTR der ANKHD1 mRNA Abschrift enthalten. Ein großer Vorteil von 3' RACE ist, dass Produkte von 3' Rennen mit ein paar kleinen Anpassungen in anderen Vektoren nachgelagerten Verhör der 3' UTR-Funktion einschließlich der MiRNA-targeting, Stabilität-Assays sowie anderen mechanistischen Assays zu erleichtern geklont werden können. Dies kann durch die Aufnahme Beschränkungsenzymsites in den verschachtelten Grundierung Sequenzen9,10. Einstellungen können vorgenommen werden, sollen nur die 3' UTR ohne irgendwelche Sequenzen vom ORF für das Klonen für 3' UTR funktionelle Assays5.

Ein wichtiger Faktor für den Erfolg der 3'-RACE ist die Entwicklung von verschachtelten Zündkapseln, die das gen des Interesses abzielen. Die cDNA-Sequenzen aus dem Ensembl Genome Browser werden empfohlen, um die besten Regionen ohne Polymorphismen zu identifizieren, um optimale Primer zu entwickeln. Idealerweise leiten mehrere verschachtelte Primer sowie mindestens zwei umgekehrte Primer im gen des Interesses siebenden können mit standard-PCR, um die besten zwei verschachtelte gen spezifische Primer verwenden zu identifizieren. In dieser Studie gab die erste Gen spezifische vorwärts Fibel ausgewählt für 3' Rennen zunächst zwei Bands mit standard-PCR im Labor routinemäßig eingesetzt. Leider war die besser gekleideteres Design durch die bedeutende Zahl der SNPs in der Niederschrift der Interesse begrenzt. SNPs in der Ziel-Niederschrift führen Diskrepanz zwischen Primer und dem Ziel, die ineffiziente Glühen und Verstärkung führen kann, und auf eine minimale19reduziert werden sollte. Die Anwesenheit von mindestens vier SNPs in einer Zündkapsel oder das Auftreten einer Kombination von fünf Fehlanpassungen (3 in 1 Grundierung und zwei in der anderen) vollständigen Hemmung der PCR-Reaktion führen kann, und daher die einzige Möglichkeit ist, mehr Primer20zu entwerfen. Statt entwerfen mehr Zündkapseln zu einem einzigen Band für den Standard verwendeten PCR Primer Suche in Experimenten hier berichtet, wurden die PCR-Radsport-Zustände und der DNA-Polymerasen verwendet anschließend in 3' Rennen verändert um die Wahrscheinlichkeit zu optimieren Abrufen einer bestimmter Bandes. Die Denaturierung Temperatur stieg auf 98 ° C für eines der DNA-Polymerasen (ein Anstieg von 95 ° C in die Primer-Suche verwendet). Für beide DNA-Polymerasen verwendet in 3' RACE-PCR, die erste Denaturierung Dauer wurde erhöht auf 3 min statt der empfohlenen 30 s bis 2 min um die cDNA-Vorlage vollständig zu denaturieren. Die T7-Oligo-dT25 Grundierung ist zum Beispiel, möglicherweise schwach Sekundärstrukturen Form vorhergesagt, was die Verfügbarkeit von Primern21reduzieren kann. Erhöhung der anfänglichen Denaturierung Länge und Temperatur bricht alle Sekundärstrukturen und hilft ergeben die einzelnen spezifischen Band nach dem letzten Zyklus von 3' Rennen. Darüber hinaus war die unspezifische Band leichter als die erwarteten Bands, was darauf hindeutet, dass es bei höheren PCR-Zyklen (bis zu 35 Zyklen); erschienen Begrenzung der PCR-Zyklen auf nur 20 reduziert die Verstärkung der unspezifischen Band.

Ein weiteres Potenzial der 3' Rennen, wie andere PCR-basierten Reaktionen, ist unvollständig Verstärkung der Ziel-Region-22. Daher wurde für beide thermophilen Enzyme der ersten Anlasstemperatur bei 50 ° C für 5 min zum Ausglühen der Primer an das Ziel zu optimieren und darauf folgte eine erste Erweiterung Temperatur bei 72 ° C für 10 min. Die endgültige PCR-Zyklus für jedes Enzym hatte eine letzte Verlängerungszeit von 15 min bei 72 ° C. Diese Erweiterung Schritte waren länger als die von den Herstellern von DNA-Polymerasen empfohlen. Der lange Verlängerung (Dehnung) Schritt ermöglicht vollständige Synthese von unvollständigen Amplifikate ermöglichen Vollauszug der Anfangs- und Endwert Verstärkung Produkte16.

PCR-Schritte, die in 3' Rennen auftreten sind sehr empfindlich, so dass sie genomischer DNA (oder anderen DNA-Kontaminationen) anstelle der Ziel-mRNA-Transkript, wodurch mehrere unerwartete Bands auf dem Gel22erkennen können. Ein Weg, um Kontaminationen zu vermeiden ist, führen Sie die PCR-Arbeit in einem engagierten PCR-Haube, Handschuhe, und verwenden Sie saubere Reagenzien und autoklaviert sterilen Röhrchen und pipette Tipps. In regelmäßigen PCR können vorwärts und rückwärts Primer gestaltet werden, sodass befinden sie sich verschiedenen Exons (über Intron Primer); auf diese Weise würde eine ungewöhnlich große PCR-Produkt bedeuten, dass eine Region, die ein Intron verstärkt worden. Jedoch kann dies nicht immer möglich sein, wenn nur die 3' UTR-Sequenz, befindet sich innerhalb der gleichen terminal Exon 3' Rennen Verstärkung soll. Alternativ kann die RNA mit DNAse Enzym vor cDNA Synthese vorbehandelt werden. Die T7 Oligo dT25 Grundierung die Reverse Transkriptase Reaktion statt eine zufällige Hexanucleotide für erste Strang cDNA Synthese von RNA Prime verringert auch Verstärkung der genomischen Produkte. Nicht zuletzt die Einrichtung einer Negativkontrolle (die "–" Bahnen in Abbildung 2), wo die cDNA Synthese in Abwesenheit der reversen Transkriptase eingerichtet ist, wird dringend empfohlen. Das Steuerelement wird identische Schritte Unternehmen, um die anderen Proben in den nachfolgenden 3' RACE-Verfahren unterzogen. Das Vorhandensein einer Band in diesem Steuerelement kennzeichnet potenzielle genomische DNA-Verunreinigung.

Trotz der genannten Herausforderungen ist 3' Rennen ein mächtiges Werkzeug bei der Abbildung 3' enden auf Basis einzelner Gene. Das Aufkommen der Technologie der nächsten Generation führte zu einer Erhöhung im Repertoire der Transkripte, die alternative 3' aus alternative Polyadenylation, die kann oder kann nicht bedeuten enden, alternatives Spleißen. Die Komplexität in Krebszellen hinzu, chromosomale Rearrangements sind häufig und in onkogenen gen Fusion Produkte23führen können. Die Fusion zwischen den beiden Genen kann beinhalten den ORF oder in einigen Fällen beinhalten nur Sequenzen innerhalb der 3' UTR9,10. Darüber hinaus gibt es auch verbunden/co-transcribed Gene, die gleichzeitig transkribiert werden, sondern können in verschiedenen Proteinen11übersetzt werden. 3' Rennen kann angepasst werden, alle diese einzigartige, abnorme Abschriften sowie normale Protokolle zuordnen. Dies ist wichtig, weil diese abnorme Transkripte können am Ende als Erkrankung spezifische Biomarker oder Angriffspunkte für bestimmte Medikamente, z.B., das Medikament Imatinib zielt die BCR-ABL1 Fusionsgen bei Krebs.

Daher ist 3' Rennen eine äußerst vielseitige Technik, die verwendet werden, um normale Transkripte zu verstärken, Roman 3' wo und neues Gen Fusionen innerhalb der 3' UTR5,9zu identifizieren. In diesem Bericht wurde 3' Rennen zur verstärken und ordnen Sie das Stopp-Codon, PAS und die gesamte 3' UTR der ANKHD1 Abschrift mit verschiedenen DNA-Polymerasen. Die beschriebene Vorgehensweise kann verwendet werden, 3' Ende jeder Polyadenylated Transkript zugeordnet.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir würden gerne Bettine Gibbs für ihre technische Hilfe zu bestätigen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HeLa cells ATCC CCL-2 Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cells ATCC CRL-3006 Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cells DSMZ ACC-342 Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F6178 Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/Streptomycin ThermoFisherScientific 15140122 Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlue Ambion AM9545 Coprecipitant.
DMEM ThermoFisherScientific 10569044 Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-Water ThermoFisherScientific AM9938 Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution Corning 21-030 1X PBS.
Chloroform Sigma  Aldrich C7559-5VL
2-propanol Sigma Aldrich I9516
Reagent Alcohol Sigma Aldrich 793175 Ethanol
Ethidium Bromide solution Sigma Aldrich E1510
TRIzol Reagent ThermoFisherScientific 15596026 Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix Amresco N867 2X PCR-to-Gel Master Mix  containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTP Amresco N557
RQ1 RNase-Free DNase Promega M6101 Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X) New England BioLabs B7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer ThermoFisherScientific F531S 2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase Agilent Technologies 600670 Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription Kit Thermo Fischer K1691 Used for  reverse transcription of mRNA into  cDNA synthesis. Kit includes  Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder 5 Prime 2500360 Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III Alpha Innotech Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight Ladder New England BioLabs N3233L Molecular weight DNA ladder.
Vortex Mixer MidSci VM-3200
Mini Centrifuge MidSci C1008-R
Dry Bath MidSci DB-D1
NanoDrop 2000C ThermoFisherScientific ND-2000C Spectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System BioRad 1704469 Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power Supply BioRad 1645050 Power supply for gel electrophoresis.
Agarose Dot Scientific AGLE-500
Mastercycler Gradient Eppendorf 950000015 PCR thermocycler.
Centrifuge Eppendorf 5810 R
Centrifuge Eppendorf 5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System Promega A9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot  TOP10 Chemically Competent E. coli cells ThermoFisherScientific K280020
MyPCR Preparation Station Mystaire MidSci MY-PCR24 Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hood ThermoFisherScientific Fume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle Counter Beckman Coulter 6605698 Particle counter. For counting cells before plating  for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0 Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific) Software to analyze Sanger sequencing data.

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Genetik Ausgabe 133 Transkripte 3' Ende 3' schnelle Verstärkung der cDNA enden (3'-RACE) Polymerase-Kettenreaktion Polyadenylation Signal (PAS) polyadenylation
Anpassung der 3' endet rasche Verstärkung der CDNA Transkripte in Krebs zuordnen
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Masamha, C. P., Todd, Z. Adapting 3' … More

Masamha, C. P., Todd, Z. Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer. J. Vis. Exp. (133), e57318, doi:10.3791/57318 (2018).

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