Summary
Ett protokoll presenteras för samtidigt utvinna metaboliter, proteiner och lipider från ett enda jordprov, möjliggör reducerat prov förberedelse gånger och aktivera multi-miska masspektrometri analyser av prover med begränsade kvantiteter.
Abstract
Masspektrometri (MS)-baserade integrerade metaproteomic, metabolomiska och lipidomic (multi-miska) studier förändrar vår förmåga att förstå och beskriva mikrobiella samhällen inom miljömässiga och biologiska system. Dessa mätningar även möjliggör bättre analyser av komplexa jord mikrobiella samhällen, som är den mest komplexa mikrobiella system kända hittills. Multi-miska analyser, men har prov förberedelse utmaningar, eftersom separata extraktioner behövs vanligen för varje miska studie, därmed kraftigt förstärka en förberedelsetid och mängden prov krävs. För att lösa denna begränsning, skapades en 3-i-1 metod för samtidig utvinning av metaboliter, proteiner och lipider (MPLEx) från samma jordprov genom att anpassa en lösningsmedelsbaserad strategi. Detta MPLEx protokoll har visat sig vara både enkel och robust för många typer av prov, även när utnyttjas för begränsade mängder av komplexa jordprover. Metoden MPLEx aktiverad också mycket snabb multi-miska mätningarna behövs för att få en bättre förståelse av medlemmarna i varje mikrobiell gemenskapen, medan utvärdera de förändringar som sker vid biologiska och ekologiska störningar.
Introduction
Utvärdera jord mikrobiella samhällen har stor betydelse för att förstå kol cykling och klimat förändring. Nyare studier har emellertid betonat svårigheter, till exempel bristen på sekvenserat genomet för bakterieflora i olika jordtyper och funktionen okänd för många av de proteiner som upptäckts. Dessa utmaningar resultatet på grund av jord att vara gemenskapens mest komplexa mikrobiella känt hittills1,2,3. Multi-miska analyser, som kombinerar resultaten från gjorts, metatranscriptomic, metaproteomic, metabolomiska och lipidomic studier, har nyligen genomförts i ett flertal jord studier att få en större förståelse i Mikroberna som är närvarande, medan få omfattande information om de molekylära förändringar som sker på grund av miljömässiga störningar1,4,5. En utmaning med multi-miska studier är att masspektrometri (MS)-baserat metaproteomic, metabolomiska och lipidomic mätningar kräver vanligtvis en specifika extraheringen för varje miska MS kompatibel6,7 , 8 , 9. dessa exakta förfaranden göra deras genomförande ytterst svårt eller omöjligt när endast en begränsad mängd prov finns. Dessa utmaningar har föranlett oss att undersöka en samtidig metabolit, protein och lipid utvinning (MPLEx) metod kan använda mindre provvolymer eller massorna, förbättra noggrannheten och ge snabbare prov förberedelserna för alla tre analyser 10. hittills, det finns inga alternativa jord utvinning förfaranden som kan uppnå alla dessa mål.
För att aktivera global multi-miska analyser av ett enda jordprov, var en ekologisk vätskeextraktion protokollet baseras på kloroform, metanol och vatten separationer utnyttjad10. Denna metod utvecklades ursprungligen för totala lipid extraktioner9,11 och mer nyligen ändrats för samtidiga utvinning av metaboliter, proteiner och lipider från en enda prov12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30, möjliggör mindre prov kvantitet och experimentell variabilitet10. I MPLEx protokoll är kloroform inte blandbar med vatten, vilket utgör grunden för trifasiskt kemisk separation av provet beståndsdelar i olika fraktioner. Den översta vattenhaltiga fasen innehåller därför de hydrofila metaboliter, följt av en protein-disk, och sedan ett lipidskikt i den nedre kloroformfasens (figur 1). När MPLEx appliceras på de flesta jordar, partikulära rester ackumuleras på botten av provtagning rören och kan kastas efter alla lager samlas. Varje jordart kan vara olika, dock, och i mycket organisk jord såsom torv, jord skräp stannar i mellanskiktet och inte faller till botten av provtagning röret. MPLEx ger flera fördelar när isolera flera molekyl skriver från samma prov som 1) mindre prov kvantiteter kan användas för multi-miska analyser, 2) multi-miska extraktioner från samma prov minskningen övergripande experimentella variabilitet, och (3) större antal prover kan förberedas mycket snabbare för högre genomströmning studier10. Tillsammans dessa fördelar är avgörande för att ge bättre mätning kapacitet för utvärdering av jordprover och deras komplexa mikrobiella samhällen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Mycket våta jordar kan vara förpackat i frystorkat skick före extraktion utan nackdel för effektiviteten av utvinningen. Våt jord kan också användas men bör övervägas när du lägger till reagenser på specifika förhållanden.
Obs: Det rekommenderas att använda 20 g torr jord vikt per utvinning, som måste delas mellan två 50 mL rör (max 10 g jord per 50 mL tub). Extraktioner kan skalas upp eller ned beroende tillgängliga urvalet.
Obs: Torr jordprover kan vara siktas genom en 3 mm skärm för att homogenisera och ta bort små rötter och stenar. Inte sikten våt jordprover, som provet kommer att fastna i skärmen.
1. jord Cell Lysis och utvinning av metaboliter, proteiner och lipider (Timing ~ 1 d)
- Per 20 g jordprov, väg upp 10 g i två separata 50 mL rör som är metanol/kloroform kompatibel. Vara ytterst försiktig med rör valt, som kloroform kommer att läcka de flesta plaster, förorenar proverna. Använd glas närhelst möjligt eller plast rör tillverkade av polypropylen eller polytetrafluoreten (PTFE).
Obs: Hålla jorden på is och lika cool som möjligt under de första stegen för vägning och homogenisering. - Tillsätt 10 mL kloroform-tvättade rostfritt stål och garnet pärlor i varje rör. På is, tillsätt 4 mL kallt ultrarena vatten (se Tabell av material för reningssystem) till varje rör (ett prov split mellan två rör) och överför proverna i en ishink till spiskåpa.
- Med 25 mL glas serologiska pipett snabbt Tillsätt 20 mL iskallt 2:1 kloroform: metanol (v/v).
Försiktighet: Kloroform: metanol har akut potentiella hälsoeffekter: hudirritation, möjliga kemiska brännskador, och irritation i andningsorganen. Det kan påverka njurarna, levern och hjärtat. Använd lämplig skyddande Glasögon, kläder och handskar och alltid arbeta i dragskåp. - Dra åt locken och vortex i lösning. 2:1 choloroform:methanol hjälper bryta ner cellväggen hos prokaryoter och även inaktiverar enzymatiska aktiviteter.
- Koppla rören till 50 mL tub vortex bilagor och horisontellt virvel för 10 minuter vid 4 ° C inuti ett kylskåp om möjligt. Sedan placera proverna inuti en-80 ° C frys för ~ 15 min för att svalna av dem helt.
- Med hjälp av en sond någon sonikator inuti dragskåp, Sonikera varje prov med en 6 mm (1/4 ”) sond på amplituden 60% för 30 s varje på is.
Varning: Det rekommenderas att använda ett ljud avta kapsling och öra skydd medan sonicating. Hög spänning är närvarande i strömkabeln leverans och hög frekvens. Undvik att vidröra botten eller sidor av provet fartyget med en aktiv sond; Det kan spricka eller smälta plasten. - Placera proverna i-80 ° C frysen för ~ 15 min, som sonicating kan generera en hel del värme.
- Upprepa steg 1,5-1,7.
Obs: Kontrollera att proverna bo kall i hela förfarandet lysis. - Centrifugera proverna vid 4000 x g i 5 min, 4 ° C. Vid denna punkt, separeras provet i lagrets övre metabolit, protein mellanlagret, och lägre lipidskikt (och kvarvarande skräp pellets). Se figur 1.
- Placera proverna på isen i en ishink och inuti ett dragskåp och med 10 mL glas serologiska pipett, ta bort övre metabolit lagren från två 50 mL rören i en stor glasflaska.
Obs: Undvik att aspirera någon av lagrets protein in i pipetten; vid behov kan du lämna ett litet lager av metaboliten. - Något luta 50 mL röret för att frigöra protein mellanskiktet så att det är gratis flytande vid lägre lipidskiktet. Med en ren rostfritt stål platt-head lab spatel, försiktigt scoop båda av de protein mellanläggen och placera dem tillsammans i en ny 50 mL tub.
- Med 25 mL glas serologiska pipett bort de lägsta lipid-lagrarna i en stor glasflaska.
Obs: Försök att undvika blivande jordpartiklar; dock vissa jord skräp och partiklar aspirerade längs med lipider kommer att tas bort vid ett senare tillfälle. - Ventilerande membran över toppen av metaboliten och lipid injektionsflaskor av glas och torka i en vakuum koncentrator tills torrhet (lipider ~ 4-5 h, metaboliter över natten).
- Att protein prov röret och kvarvarande skräp pellet rören, tillsätt 20 mL av iskall metanol till varje och vortex. Detta görs till skräp pellets att skölja av kloroform innan du försöker solubilize något möjligt kvarvarande protein ur skräp innan gungade det.
- Centrifugera det skräp pellets och protein interlayer vid 4000 x g i 5 min, 4 ° C, då Häll upp metanol i en riskavfallsbehållare inuti ett dragskåp.
- Frysa protein och skräp pellets i flytande kväve och torka i en lyophilizer (med en collector temperatur kan-105 ° C på grund av metanol med en mycket låg fryspunkt-98 ° c) för ~ 2 timmar.
Obs: Torka inte alltför pellets, som de kommer att vara svårare att solubilize. - Tillsätt 10 mL av protein lösbarhet buffert (4% SDS, 100mM DTT (DL-Ditiotreitol) i 50mM tris buffert, pH 8,0; se Kompletterande reagens Set-up) till protein fungerar röret och 20 mL till varje skräp pellets.
Försiktighet: SDS orsakar akut toxicitet och är brandfarliga. Det är en huden, ögonen och luftvägarna irriterande. Använd handskar och skyddsglasögon. - I dragskåp, sond Sonikera proverna på 20% amplitud för 30 s för att bringa dem i lösning. Vortex i 2 min.
- Placera protein fungerar provet i en lab tube rotator för 30 min vid 300 rpm, 50 ° C, för att solubilize proteinet.
- Horisontellt vortex skräp proverna för en ytterligare 10 min att lysera eventuella kvarvarande intakta celler, sedan rotera med protein fungerar proven för de återstående 20 min.
- Centrifugera alla prover vid 4500 x g i 10 min, rumstemperatur (RT), och samla in supernatanten från varje rör per prov i två 50 mL rör.
- Tillsätt 10 mL av lösbarhet buffert till protein fungerar pelleten, sedan Sonikera och vortex tillbaka till lösning och centrifugera som tidigare.
- Kombinera supernatanterna till två 50 mL rören lika och centrifugera vid 8000 x g i 10 min, 4 ° C, i en fast vinkel hink rotor.
Obs: En sista centrifugering är nödvändigt att ta bort överdriven kontaminerande humusämnen. - Häll upp supernatanterna i två 50 mL rör så att det finns 30 mL i varje. Sedan, med 10 mL glas serologiska pipett, tillsätt 7,5 mL av TCA (triklorättiksyra) till varje rör. Vortex till lösning. Detta gör 20% TCA i varje 30 mL prov (justera),
Varning: TCA är frätande, giftiga och kan orsaka brännskador på huden. Använd handskar och skyddsglasögon. - Placera proverna i-20 ° C frys för 2 h till över natten.
Obs: Proteiner kommer vanligtvis fällningen inom 1 h men kan vara kvar över natten (upp till 18 h).
Obs: Låt inte TCA utvinning gå längre än 18 h på grund av eventuell syra hydrolys av protein. Om provet är frysta, Tina den på is; Låt inte provet värma upp förbi blidväder. - För att pellets utfällda proteinet, Centrifugera provet vid 4500 x g i 10 min, 4 ° C och Dekantera supernatanten i avfall.
- Tillsätt 10 mL 100% iskall aceton till varje protein pellets, vortex och kombinera som pellets i en tub.
- Centrifugera röret som innehåller den kombinerade pellets (med en balans), och sedan Dekantera supernatanten i avfall.
Försiktighet: Aceton kan orsaka andningsorgan och hud- och ögonirritation, och är en brandfarlig vätska och ånga. Bär skyddsglasögon handskar och en labbrock, arbeta i dragskåp. - Tvätta pelleten två gånger med 1,5 mL aceton och slutligen överföra till en 2 mL rör för sista spin vid 10 000 x g i 5 min.
- Dekantera supernatanten i avfall och låt pelleten lufttorka inverterad på en papper torka i ett dragskåp för ~ 20 min eller under en kväve ström tills pelleten något börjar spricka.
- Tillsätt 100-200 µL av protein lösbarhet bufferten, beroende på storleken på pelleten.
Obs: Hålla volymen av lösbarhet buffert tillsätts provet så låg som möjligt. Efterföljande Filter hjälpt prov förberedelse (FASP) kan bara använda upp till 50 μL av solubilized prov per kolumn. något måste mer vara uppdelad i flera FASP kolumner. - Sonikera och vortex pelleten i lösning. Observera att provet kan vara trögflytande på grund av humusämnen utfällning tillsammans med proteinet, som kommer att avlägsnas med en efterföljande centrifugering.
- Skaka provet i en inkubator/shaker för 30 min vid 300 rpm, 40 ° C, för att solubilize proteinet till lösning och gå vidare till protein matsmältningen.
- Snapin frysa provet i flytande kväve och förvaras i-80 ° C tills redo för protein matsmältningen.
2. lipid förberedelse (Timing ~ 20 min)
- När lipid proverna är torra, Lägg 200 μL av 2:1 kloroform: metanol till injektionsflaskan, vortex i lösning och överföring i ett 1,5 mL polypropylen rör, lägga till en ytterligare 200 μL av glas injektionsflaska, vortex och Pipettera de återstående lipider och överföra till röret.
- Centrifugera skräp ur provet vid 12 000 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Över supernatanten till en lipid glasflaska och förvaras vid-20 ° C fram till LC-MS/MS-analys (ytterligare Detaljer för LC-MS/MS i Kompletterande metoder).
- Om proverna inte kan analyseras omedelbart efter beredning, behöver lipider lagras i lösningsmedel vid-20 ° C att förhindra oxidation och nedbrytning.
3. metabolit förberedelse och derivatisering (Timing ~ 5 h)
- Dagen efter utvinning, ta bort metabolit proverna från Speed Vac och förvara torrt vid-20 ° C tills den för derivatisering och analys på GC. Om inte kör metaboliterna på en GC, sedan förbereda dem med hjälp av lämpliga protokollet för instrumentet.
- Omedelbart före derivatizing metaboliter för analys på GC, överföra dem från de stora glasflaskor genom att lägga till 200 μL av metanol, vortexa och lägga till ett 1,5 mL polypropylen rör. Upprepa en gång.
- Centrifugera röret på 12 000 x g i 10 min, 4 ° C. Överför supernatanten till mindre injektionsflaskor av glas, tillsätt ett ventilerande membran till toppen, och helt torr i en Speed Vac.
- Derivatize metaboliter genom att lägga till 20 µL av methoxyamine lösning prov injektionsflaskan och virvel för 30 s på en vortexer på medellång hastighet.
Varning: Methoxyamine hydrochloride orsakar svåra brännskador och allvarliga ögonskador, kan ge allergi vid hudkontakt. Bär skyddsglasögon, handskar och labbrock, och arbeta i dragskåp. - Använd ett bad någon sonikator för att säkerställa urvalet är helt upplöst.
- Inkubera provet i en inkubator med kondens förebyggande lock bibehålls vid 37 ° C i 1 h 30 min med 1000 rpm skakar.
- Vänd injektionsflaskan en gång Blanda proverna med kondenserad droppar vid cap ytan. Snurra provet ner vid 1 000 x g i 1 min, RT.
- Utföra Silylering genom att lägga till 80 µL (med en spruta) av N-metyl - N-(trimetylsilyl) trifluoroacetamide med 1% trimethylchlorosilane. Virvel för 10s.
Varning: MSTFA + 1% TMCS kan orsaka frätskador på hud, allvarliga ögonskador och specifik organtoxicitet, och är en brandfarlig vätska och ånga. Bär skyddsglasögon, handskar och labbrock, och arbeta i dragskåp. - Inkubera provet i en inkubator med kondens förebyggande lock bibehålls vid 37 ° C i 30 min med 1000 rpm skakar.
- Vänd injektionsflaskan en gång Blanda proverna med kondenserad droppar vid cap ytan.
- Snurra provet ner under 5 minuter vid 2000 x g, RT.
- Över reagerade lösningen i injektionsflaskorna lämpliga för GC-MS analys.
4. protein matsmältningen (Timing ~ 1 d)
- Centrifugera provet vid 15 000 x g i 5 min, RT, till pellet eventuellt skräp.
- Utföra Filter-Aided--Provberedning (FASP) för matsmältningen använder FASP Kit (se Tabell för material) följande modified tillverkarens instruktioner31,32:
- Tillsätt 400 μL av 8 M urea bufferten i en FASP kolumn (500 μL 30K MWCO spin filter).
- När provet avslutats centrifugering Pipettera bort supernatanten (kassera pelleten) och lägga till upp till 50 μL av provet i den 400 μL av 8 M urea i kolumnen.
Obs: Lägg bara upp till 50 μl prov per kolumn. Om det finns mer än 50 μl prov, använda flera kolumner och kombinera peptiderna efter matsmältningen. Det är bäst att lämna denna volym så låg som möjligt (30 µL är perfekt) för att säkerställa FASP kolumn tar bort alla SDS som dramatiskt kan störa massa spec analys. - Placera kolumnen i den medföljande 1,5 mL rör och centrifugera provet vid 14 000 x g för 30 min, RT.
- Ta bort genomströmmande i avfall och tillsätt 400 μL av 8 M urea till kolumnen och centrifugera igen.
- Upprepa föregående steg en gång för sammanlagt 3 urea sköljningar.
Notera: Se till att provet går nära torrhet på kolumnen, om det finns någon mer än ~ 30 µL kvar på filtret efter varje dragning, fortsätta centrifugering. - Tillsätt 400 μL av 50 mM NH4HCO3 och centrifugera vid 14 000 x g i 20 min, kassera avfall och upprepas en gång.
- Överföra kolumnerna till en ren 1,5 mL centrifugrör.
- Tillsätt 75 μl av trypsin matsmältningen buffert till kolumner och inkubera vid 37 ° C för 3 h i en inkubator med kondens förebyggande lock på 750 rpm.
- Tillsätt 40 µL 50 mM NH4HCO3 till kolumner.
- Centrifugera provet vid 14 000 x g i 15 min att samla peptiderna i röret samtidigt hög molekylvikt föroreningar ovanpå kolumnen.
- Tillsätt 40 μl 50mM NH4HCO3 kolumn och centrifugera igen.
- Ignorera kolumnen, torra ned peptiderna i röret i en hastighet på ~ 30 µL och BCA assay (Bicinchoninic acid protein assay kit, se Tabell för material) Vac och peptiderna.
- Alternativt utföra en sanering steg om SDS föroreningar misstänks (synliga bubblor)33. En fast fas utvinning måste göras efteråt om du väljer detta alternativ. Detaljerad information om den här saneringen finns i de Kompletterande metoder.
- Späd provet för MS analys eller eventuellt gå vidare till HPLC fraktionering (nästa två steg).
- För att fractionate, Späd prover till en volym på 400 µL med 10 mM ammonium formate buffert (pH 10,0).
- Lösa en C18 kolonnen (se Tabell för material) genom att separera på 0,5 mL/min med en HPLC-system med mobila faser (A) 10 mM ammonium formate, pH 10,0 och (B) 10 mM ammonium formate, pH 10,0/acetonitril (10:90).
- Justera övertoningens från på 100% A till 95% A över de första 10 min, 95% A till 65% A över min 10 till 70, 65% A till 30% A över min 70 till 85, underhålla på 30% A över min 85 till 95.
- Re jämvikta med 100% A över min 95 till 105 och håll på 100% A tills min 120.
- Samla in fraktioner varje 1,25 min (96 fraktioner över hela övertoningen) och slutligen kombinera varje rad för totalt 12 prover eller varannan rad för 24 prover (var och en med n = 8 eller n = 4 fraktioner poolade).
- Torka alla fraktioner under vakuum och tillsätt 15 µL av ultrarent vatten till varje för lagring vid-20 ° C fram till LC-MS/MS-analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När protokollet MPLEx användes för att utvinna molekyler ur Kansas infödda prairie jord (en Mollisol jord), föreskrivs de tre exemplar analyserna resultat 3376 peptider, 105 lipider och 102 polära metaboliter (alla unika identifieringar). Medan MPLEx protokollet har varit väl etablerade för allmänna utvinning av lipider och metaboliter12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21,22,23,24,25,26,27 ,28,29,30,34, dess jämförelsen till gemensam jord protein utvinning metoder för mikrobiella analyser, såsom jord protein utvinning Kit (se tabellen Material) och SDS (sodium dodecyl sulfate) extraktioner35, utvärderas ytterligare här. För att bedöma dessa tekniker, var Kansas infödda prairie jord proteiner extraheras med varje inställning och analyseras direkt med omvänd fas LC-MS/MS med ett UPLC system tillsammans med en hybrid quadrupole/Orbitrap masspektrometer. Detaljerad information om Metodparametrarna som finns i de Kompletterande metoder. Den resulterande experimentella peptiden MS/MS spectra från varje utvinning metod jämfördes med förutspådda peptid sekvenser från företrädaren Kansas infödda prairie metagenome2 använda en stränga MS-spektral sannolikhet cutoff GF + 1 x 10 -10 36 , 37 och en massa fel brytpunkten på mindre än 5 ppm. Det bör noteras att de analyter som utvinns ur jorden med protokollet MPLEx är lämpliga för MS-baserade studier och andra analysmetoder. När först jämföra tre replikerar de kända metoder för MoBio och SDS, endast 12% av peptiderna överlappade mellan de två teknikerna visar komplexiteten i mikrobiell gemenskapen och olika utvinning effekter (figur 2). Vid jämförelse av MPLEx med MoBio och SDS extrakt upptäcktes också ~ 38% av de peptider som observerats med metoden MPLEx när du använder de SDS eller MoBio extraktioner (figur 2). Med tanke på antalet arter i Kansas jord bakteriell gemenskapen och dess metagenome2, överlappningen av peptid identifieringar är rimligt och på grund av dess komplexitet, kombinationen av metoder extrakt mer peptider än varje ensam 35. också, eftersom dessa prover var ofraktionerat och analyseras av endast 1-dimensionella LC-MS/MS, extremt hög prov komplexiteten var eventuellt orsakar vissa bias i upptäckt på grund av olika peptid koncentrationer utvinns av varje inställning. Protokollet MPLEx har också kopplats till andra jordtyper såsom permafrost och våtmarker, och i alla fall preliminära proteomiska resultaten är av samma kvalitet som de Kansas infödda prairie jord-data som presenteras här.
Breda tillämpligheten av den MPLEx metoden, tidigare utvärderats med hjälp av en rad olika prover, inklusive archaeon Sulfolobus acidocaldarius, en unicyanobacterial konsortiet38, mus hjärnans cortex vävnad, mänsklig urin, och bladen från Arabidopsis thaliana (figur 2)10. För alla prover utom A.thalianaär urea extraktioner det vanligaste sättet att extrahera proteiner, så de användes som kontrollstrategi för utvärdering. A. thaliana MPLEx resultaten jämfördes med en extraktion utförs med triklorättiksyra (TCA) eftersom växten bladen är rika på fenolföreningar som behöver tas bort innan MS analyser39. I alla fall liknade antalet proteiner som observerats från metoden MPLEx för kontroller10, som anger dess nytta för många olika provtyper. Dessutom fanns det inga trender som är associerad med klasserna specifikt protein som extraheras i alla provtyper (inklusive mark). Därför gör breda tillämpligheten av MPLEx på ett flertal biologiska och ekologiska system det en lovande strategi.
Figur 1. En schematisk visar MPLEx processen, i vilken metaboliter, proteiner och lipider utvinns samtidigt från samma jordprov för MS analyser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Venn-diagram som illustrerar peptid överlappning för en rad olika prover som utvinns med hjälp av MPLEx och en standard urea-baserade protein utvinning metod normalt utförs. Data från MPLEx utvinning av archaeon S.acidocaldarius, unicyanobacterial consortium, mänsklig urin, mus hjärnans cortex och A.thaliana växt lämnar anpassad från Nakayasu, E. S. et al. 201610. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det är viktigt att notera att inte alla laboratorier har samma tillgängliga utrustning så vissa metoder, till exempel lysis steget kan anpassas. Här använder vi vortexa och sonicating, men användningen av en stor 50 mL pärla visp skulle fungera. Om det inte finns en lyophilizer med en collector temperatur kan-105 ° C, kan då prover torkas under en kväve-ström. Även jordtyper varierar kraftigt och kan innehålla sand, silt, lera, torv och loam (etc.), och de kan också variera beroende på pH, salthalt och organiskt rikedom. Var och en av dessa avvikelser kan ha en inverkan på protokollet, så det är viktigt att vara flexibel och göra justeringar vid behov. Dock är det viktigt, att de nyckeltal och procentsatser förblir desamma.
Protokollet MPLEx visar mycket lovande för tillämpning i många biologiska och ekologiska system och möjligheten att aktivera multi-miska analyser av jord mikrobiella samhällen. Tidigare jämförelser av MPLEx till andra extraktion protokoll för olika system illustreras en hög grad av peptid överlappning10. Man konstaterade dock begränsningen var att MPLEx inte var tillämplig på blod plasmaproteiner som behöver vara uttömda. I dessa fall var utfällda proteiner inte väl identifieras av antikropparna i kolumnerna immunodepletion behövs för bred täckning av det plasma proteomet. Mer utvinning standardmetoder bör därför användas under dessa omständigheter. En ytterligare begränsning för metoden MPLex utvinning är att det inte urskiljs mellan intracellulär och extracellulär protein, men detta är sant för alla andra jord protein extraktion protokoll samt.
I detta manuskript gav MPLEx resultat för 3376 peptider, 105 lipider och 102 polära metaboliter i Kansas infödda prairie jord med extraktion och analys metoder beskrivs i protokollet-avsnittet. Bättre överlappning observerades mellan peptiderna utvinns i kontroll- och MPLEx metoder av individuella system jämfört med jord mikrobiell gemenskapen (figur 2). Detta är inte en begränsning, men en konsekvens av att arbeta med de extremt komplicerade jord mikrobiella samhällena. Dessa resultat är ytterligare noterat som välkända jord utvinning tekniker för SDS och MoBio inte överlappar varandra väl antingen på grund av den fantastiska mångfald och svårigheter utvinna jord proteiner lika. Intressant, protokollet MPLEx tillåtna identifiering av mer totala peptider än SDS eller MoBio och också upptäckt ytterligare komponenter inte sett i antingen analys.
Dessa observationer gör MPLEx en mycket lovande teknik för att arbeta med små prover storlekar, minska övergripande multi-miska experimentella variabilitet och minska prov förberedelsetid. Fördelarna som möjligt med MPLEx titta om du vill aktivera multi-miska funktioner och analyser som krävs för storskaliga mikrobiell gemenskapens undersökningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Nathan Johnson för hans hjälp i förberedelserna siffrorna. Denna forskning stöddes av det Pan-omics-Program som finansieras av US Department of Energy's Office av biologiska och miljöforskning (genomisk Science Program), Microbiomes i övergången (MinT) laboratorium riktad forskningsutveckling Initiativ på Pacific Northwest National Laboratory, liksom de nationella institut för hälsa nationella institutet av Environmental Health Sciences (R01 ES022190) och NIH (P42 ES027704). KEBJ vill tacka R21 HD084788 för ekonomiskt stöd för att utveckla och validera nya multi-miska utvinning tekniker. Detta arbete utfördes i den W. R. Wiley miljömässiga Molecular Sciences laboratorium (EMSL), en DOE nationella vetenskapliga användaren anläggning på Pacific Northwest National Laboratory (PNNL). PNNL är ett nationellt laboratorium för flera program drivs av Battelle för DOE under kontrakt DE-AC06-76RL01830.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | Stored at -20°C !Caution chloroform has acute potential health effects, skin irritation and possible chemical burns, irritation to the respiratory system, may affect the kidneys, liver, heart. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Stored at -20°C !Caution Methanol may cause respiratory tract, skin and eye irritation, may damage the nerves, kidneys and liver. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Purified water from Millipore | Milli-Q | Water purification system. | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L6026 | !Caution SDS causes acute toxicity and is flammable. It is a skin, eye and airway irritant. Wear gloves and safety glasses. |
| Soil protein extraction kit | MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen | 30000-20 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| 1M Trizma HCL | Sigma-Aldrich | T2694 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T0699 | !Caution TCA is caustic, toxic and may cause skin burns. Wear gloves and safety glasses. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | Stored at -20°C !Caution Acetone may cause respiratory tract and skin and eye irritation. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses gloves and a lab coat, work in a fume hood. |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | !Caution Urea is an eye and skin irritant, use gloves and safety glasses |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830 | |
| Trypsin | Promega | V528A | 20µg vials |
| Bicinchoninic acid protein assay kit | Pierce | 23227 | |
| Ammonium Formate | Sigma-Aldrich | 09735 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | !Caution Acetonitrile is a skin and eye irritant. Highly flammable. Wear gloves and safety glasses. Work in a fume hood. |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | !Caution TFA is extremely hazardous in case of skin contact, eye contact, ingestion and inhalation. May produce tissue damage particularly on mucous membranes of eyes, mouth and respiratory tract. Skin contact may produce burns. Wear gloves, lab coat, safety glasses and work in a fume hood. |
| Methoxyamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 226904 | !Caution Methoxyamine hydrochloride causes severe burns and serious damage to eyes, may cause sensitization by skin contact. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | !Caution Pyridine can cause skin and eye irritation, central nervous system depression. Vapor may cause flash fire. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane | Sigma-Aldrich | 69478 | !Caution MSTFA + 1% TMCS can cause skin corrosion, serious eye damage and specific target organ toxicity. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Milli-Q water purification system | Millipore | model MPGP04001 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Probe sonicator | FisherBrand | model FB505 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | model 5810R | |
| 50mL tube swinging bucket rotor | Eppendorf | A-4-44 | |
| 50mL fixed angle rotor | Eppendorf | FA-45-6-30 | |
| Balance | OHAUS | model V22PWE150IT | |
| Serological pipette controller | Eppendorf | 12-654-100 | |
| 10mL, 25mL glass serological pipettes | FisherBrand | 13-678-27F, 13-678-36D | |
| Thermomixer with Thermotop | Eppendorf | 5382000015, 5308000003 | |
| 0.9 – 2.0 mm blend stainless steel beads | NextAdvance | SSB14B | |
| 0.15 mm garnet beads | MoBio | 13122-500 | |
| Magnetic stir plate | FisherBrand | 11-100-16SH | |
| Magnetic stir bar | FisherBrand | 14512130 | |
| pH paper strips, pH range 0–14 | FisherBrand | M95903 | |
| 15mL, 50mL conical polypropylene centrifuge tube | Genesee Scientific | 21-103 21-108 | chloroform compatible |
| 50mL vortex attachment | MoBio | 13000-V1-50 | |
| Ice bucket | FisherBrand | 02-591-44 | |
| 27.25x70mm glass vials | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Breathe Easier plate membranes | Midwest Scientific | BERM-2000 | |
| Alcohol wipes | Diversified Biotech | BPWP-1000 | |
| Heater shaker incubator | Benchmark, Incu-Shaker Mini | ||
| Analog rotisserie tube rotator | SoCal BioMed, LLC | 82422001 | |
| Filter-Aided-Sample-Prep kit | FASP; Expedeon | 44250 | |
| Microplate reader | Biotek, EPOCH | ||
| -20 Degree Celsius Freezer | Fisher | 13986149 | |
| -80 Degree Celsius Freezer | Stirling Ultracold | SU78OUE | |
| Q-Exactive ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Agilent 7890A gas chromatograph coupled with a single quadrupole 5975C mass spectrometer | Agilent Technologies, Inc. | ||
| LTQ-Orbitrap Velo | Thermo Scientific | ||
| Waters NanoEquityTM UPLC system | Millford, MA | ||
| 250mL media bottle | FisherBrand | 1395-250 | |
| Waters vial | Waters | 186002805 | |
| Glass MS sample vial and inserts | MicroSolv | 9502S-WCV, 9502S-02ND | |
| Glass HPLC vial and snap caps | MicroSolv | 9512C-0DCV, 9502C-10C-B | |
| HPLC 96-well plate | Agilent | 5042-6454 | |
| Large glass vial 27.25x70mm | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Lyophilizer | Labconco | 7934021 | |
| Polished stainless steel flat head spatula | Spoonula; FisherBrand | 14-375-10 | |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 34721 | |
| XBridge C18, 250x4.6 mm, 5 μM with 4.6x20 mm guard column | Waters | 186003117, 186003064 | |
| Agilent 1100 series HPLC system | Agilent Technologies | G1380-90000 | |
| 1.7mL centrifuge tube | Sorenson | 11700 | |
| Hamilton Glass Syringes, 5mL, 50µL and 250µL | Hamilton | 81517, 80975, 81175 | |
| Pasteur Pipettes | FisherBrand | 13-678-20A | |
| Pasteur Pipette Bulbs | Sigma-Aldrich | Z111597 | |
| Bath Sonicator | Branson 1800 Ultrasonic Cleaner | ||
| Vacuum Centrifuge | Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System | ||
| MicroSpin Columns, C18 Silica | The Nest Group | SEM SS18V |
References
- Hultman, J., et al. Multi-omics of permafrost, active layer and thermokarst bog soil microbiomes. Nature. 521, 208-212 (2015).
- White, R. A. 3rd, et al. Moleculo long-read sequencing facilitates assembly and genomic binning from complex soil metagenomes. mSystems. 1, (2016).
- White, R. A., Callister, S. J., Moore, R. J., Baker, E. S., Jansson, J. K. The past, present and future of microbiome analyses. Nat Protoc. 11, 4-8 (2016).
- Ritchie, M. D., Holzinger, E. R., Li, R., Pendergrass, S. A., Kim, D. Methods of integrating data to uncover genotype-phenotype interactions. Nat Rev Genet. 16, 85-97 (2015).
- Jansson, J. K., Baker, E. S. A multi-omic future for microbiome studies. Nat Microbiol. 1, (2016).
- Domon, B., Aebersold, R. Options and considerations when selecting a quantitative proteomics strategy. Nat Biotechnol. 28, 710-721 (2010).
- Marx, V. Targeted proteomics. Nat Methods. 10, 19-22 (2013).
- Roberts, L. D., Souza, A. L., Gerszten, R. E., Clish, C. B. Targeted metabolomics. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 30, Unit 30 32 31-24 (2012).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226, 497-509 (1957).
- Nakayasu, E. S., et al. MPLEx: a Robust and Universal Protocol for Single-Sample Integrative Proteomic, Metabolomic, and Lipidomic Analyses. mSystems. 1, (2016).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Pomraning, K. R., et al. Multi-omics analysis reveals regulators of the response to nitrogen limitation in Yarrowia lipolytica. BMC Genomics. 17, 138 (2016).
- Tisoncik-Go, J., et al. Integrated Omics Analysis of Pathogenic Host Responses during Pandemic H1N1 Influenza Virus Infection: The Crucial Role of Lipid Metabolism. Cell Host Microbe. 19, 254-266 (2016).
- Kyle, J. E., et al. Uncovering biologically significant lipid isomers with liquid chromatography, ion mobility spectrometry and mass spectrometry. Analyst. 141, 1649-1659 (2016).
- Lovelace, E. S., et al. Silymarin Suppresses Cellular inflammation by inducing reparative stress signaling. J Nat Prod. 78, 1990-2000 (1990).
- Kim, Y. M., et al. Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms. Front Microbiol. 6, 209 (2015).
- Pomraning, K. R., et al. Comprehensive Metabolomic, Lipidomic and microscopic profiling of Yarrowia lipolytica during lipid accumulation identifies targets for increased lipogenesis. PLoS One. 10, e0123188 (2015).
- Huang, E. L., et al. The fungus gardens of leaf-cutter ants undergo a distinct physiological transition during biomass degradation. Environ Microbiol Rep. 6, 389-395 (2014).
- Deatherage Kaiser, B. L., et al. A Multi-Omic View of Host-Pathogen-Commensal Interplay in Salmonella-Mediated Intestinal Infection. PLoS One. 8, e67155 (2013).
- Kim, Y. M., et al. Salmonella modulates metabolism during growth under conditions that induce expression of virulence genes. Mol Biosyst. 9, 1522-1534 (2013).
- Ansong, C., et al. A multi-omic systems approach to elucidating Yersinia virulence mechanisms. Mol Biosyst. 9, 44-54 (2013).
- Bordbar, A., et al. Model-driven multi-omic data analysis elucidates metabolic immunomodulators of macrophage activation. Mol Syst Biol. 8, 558 (2012).
- Hu, Z. P., et al. Metabolomic response of human skin tissue to low dose ionizing radiation. Mol Biosyst. 8, 1979-1986 (2012).
- Perera, R., et al. Dengue virus infection perturbs lipid homeostasis in infected mosquito cells. PLoS Pathog. 8, e1002584 (2012).
- Gao, X., et al. A reversed-phase capillary ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) method for comprehensive top-down/bottom-up lipid profiling. Anal Bioanal Chem. 402, 2923-2933 (2012).
- Sorensen, C. M., et al. Perturbations in the lipid profile of individuals with newly diagnosed type 1 diabetes mellitus: Lipidomics analysis of a Diabetes Antibody Standardization Program sample subset. Clin Biochem. 43, 948-956 (2010).
- Diamond, D. L., et al. Temporal proteome and lipidome profiles reveal hepatitis C virus-associated reprogramming of hepatocellular metabolism and bioenergetics. PLoS Pathog. 6, e1000719 (2010).
- Alquier, T., et al. Deletion of GPR40 impairs glucose-induced insulin secretion in vivo in mice without affecting intracellular fuel metabolism in islets. Diabetes. 58, 2607-2615 (2009).
- Ding, J., et al. Application of the accurate mass and time tag approach in studies of the human blood lipidome. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 871, 243-252 (2008).
- Rasmussen, A. L., et al. Systems virology identifies a mitochondrial fatty acid oxidation enzyme, dodecenoyl coenzyme A delta isomerase, required for hepatitis C virus replication and likely pathogenesis. J Virol. 85, 11646-11654 (2011).
- Manza, L. L., Stamer, S. L., Ham, A. J., Codreanu, S. G., Liebler, D. C. Sample preparation and digestion for proteomic analyses using spin filters. Proteomics. 5, 1742-1745 (2005).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat Methods. 6, 359-362 (2009).
- Zhou, J. Y., et al. Simple sodium dodecyl sulfate-assisted sample preparation method for LC-MS-based proteomics applications. Anal Chem. 84, 2862-2867 (2012).
- Anderson, J. C., et al. Decreased abundance of type III secretion system-inducing signals in Arabidopsis mkp1 enhances resistance against Pseudomonas syringae. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 6846-6851 (2014).
- Chourey, K., et al. Direct cellular lysis/protein extraction protocol for soil metaproteomics. J Proteome Res. 9, 6615-6622 (2010).
- Kim, S., Gupta, N., Pevzner, P. A. Spectral probabilities and generating functions of tandem mass spectra: a strike against decoy databases. J Proteome Res. 7, 3354-3363 (2008).
- Kim, S., Pevzner, P. A. MS-GF+ makes progress towards a universal database search tool for proteomics. Nat Commun. 5, 5277 (2014).
- Cole, J. K., et al. Phototrophic biofilm assembly in microbial-mat-derived unicyanobacterial consortia: Model systems for the study of autotroph-heterotroph interactions. Front Microbiol. 5, (2014).
- Isaacson, T., et al. Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues. Nat Protoc. 1, 769-774 (2006).
