本文介绍了一种利用高分辨率呼吸测定法测量果蝇透化胸段耗氧量的方法。与传统的线粒体分离技术相比，该技术所需组织量极少，且获得的结果更具生理相关性。
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摘要
摘要
果蝇Drosophila melanogaster是代谢研究中一种新兴的模式生物。事实上，果蝇具有与人类器官同源的结构，拥有高度保守的代谢通路，并且寿命相对较短，可在较短时间内研究多种基本的生命机制。然而，令人惊讶的是，细胞代谢所必需的关键机制之一——线粒体呼吸作用——在该模型中尚未得到充分研究。这可能是因为通常测量果蝇线粒体呼吸需要大量个体，且实验结果的可重复性较低。本文介绍了一种利用极少果蝇组织精确测定线粒体耗氧量的方法。该方法中，分离果蝇胸部组织，并通过锋利的镊子进行机械穿孔，同时使用皂苷进行化学透化处理，从而使不同化合物能够穿过细胞膜并调节线粒体呼吸。透化处理后，采用一套实验流程评估电子传递系统（ETS）中各复合物氧化不同底物的能力，以及其对解偶联剂和多种抑制剂的反应。与传统的线粒体分离方法相比，该方法具有诸多优势：由于线粒体仍与其他细胞组分相互作用，且线粒体形态得以保持，因此更接近生理状态；此外，样品制备更快速，实验结果具有高度可重复性。将果蝇作为代谢研究模型的优势与线粒体呼吸功能评估相结合，可揭示重要的新见解，尤其是在果蝇处于不同环境或病理生理条件下时。
引言
果蝇Drosophila melanogaster作为遗传学研究的模式生物已有超过一个世纪的历史1。对这种生物的研究不仅推动了关于伴性遗传2、突变率3、神经系统发育以及细胞命运决定等基础科学知识的重大进展4，而且近年来还成为研究阿尔茨海默病和帕金森病等疾病机制的重要工具5,6。此外，果蝇也是研究衰老过程的常用模型，因其可在短时间内大量繁殖且寿命较短。果蝇还具有与人类器官同源的结构，例如心脏、卵细胞（类似肝细胞）、脂肪体（功能类似于肝脏和白色脂肪组织）、胰岛素分泌细胞（相当于胰腺β细胞），以及运输代谢物的血淋巴（类似于脊椎动物的血液）7。此外，中间代谢的核心通路（包括胰岛素/类胰岛素生长因子信号通路和雷帕霉素靶蛋白-TOR通路）在进化上也高度保守7。基于上述原因，近年来果蝇被广泛用于揭示调控代谢的基本机制，尤其是在糖尿病等人类代谢性疾病的病理条件下8。代谢的一个重要组成部分是线粒体，它整合多种代谢通路，并通过氧化磷酸化过程（OXPHOS）执行生命中最关键的生物学功能之一....
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方案
1. 试剂准备
- 准备以下溶液用于组织的解剖和透化。
- 配制保存液：2.77 mM CaK2EGTA、7.23 mM K2EGTA、5.77 mM Na2ATP、6.56 mM MgCl2、20 mM 牛磺酸、15 mM Na2磷酸肌酸、20 mM 咪唑、0.5 mM 二硫苏糖醇，以及 50 mM K-MES，pH 7.1（可于 -20 °C 保存）。
- 配制皂苷溶液：将 5 mg 皂苷溶于 1 mL 保存液中（每日新鲜配制）。
- 准备以下溶液用于呼吸作用的测定。
- 配制呼吸介质：120 mM KCl、5 mM KH2PO4、3 mM HEPES、1 mM EGTA、1 mM MgCl2 和 0.2% BSA（w/v），pH 7.2。
- 配制底物、解偶联剂和抑制剂。将所有底物溶于 H2O 中，将解偶联剂 FCCP 及除丙二酸盐（溶于 H2O）外的所有抑制剂溶于无水乙醇中。大多数底物及丙二酸盐需进行中和处理（见材料表）。本方案中所列所有浓度均为 2 mL 测定腔内的终浓度。
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结果
使用上述方案测定线粒体耗氧量的代表性轨迹图如下所示 图2. 注入孵育 chamber 中并与透化的肌肉纤维一同孵育的丙酮酸和苹果酸，用于测定复合体 I 泄漏呼吸（CI-LEAK respiration）， 即，当电子传递链中的复合体 I（CI）被丙酮酸和苹果酸经三羧酸循环氧化产生的 NADH 激活时。在此呼吸速率下，线粒体耗氧主要用于补偿质子漏 即，当ATP合酶不活跃时，质子从膜间隙跨膜进入线粒体基质（LEAK）30当加入ADP后，ATP合酶被激活，电子从复合物I（complex I）传递至复合物IV（complex IV），同时将ADP磷酸化为ATP（CI-OXPHOS），导致线粒体耗氧量增加。OXPHOS偶联比率计算为CI-OXPHOS与CI-LEAK的比值，通常被视为评估线粒体质量及线粒体偶联状态的良好指标。30. 在果蝇中，该比值应至少超过 6.0（
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讨论
本研究描述了一种在测量黑腹果蝇线粒体耗氧量之前进行样品制备的方法。该方法的建立旨在克服使用线粒体分离方案所涉及的多种问题，特别是在实验耗时和所需个体数量方面的局限。本实验不采用通常需要从多个个体获取大量组织的线粒体分离方法，而是以少量黑腹果蝇胸段的透化肌纤维为材料进行。在本方案中，仅需三个个体即可获得理想结果。因此，可以在不同时间点进行线粒体耗氧量的测量，因为同步化少量同龄且同性别果蝇的实验操作更为可行。
首先，为了获得较低的实验结果变异性，应使用相同年龄、性别、品系且在相同条件下培养的黑腹果蝇（图6），因为呼吸作用会随着果蝇的年龄、性别、基因型和饮食而发生变化。执行本实验方案中最关键的步骤是胸节的透化处理。操作必须迅速，以避免组织降解；同时必须确保胸节充分透化，以获得最大化的氧气消耗速率。为验证透化操作是否正确完成，并确认线粒体在透化后仍保持结构和功能的完整性，需采用OXPHOS偶联比（CI-OXPHOS/CI-LEAK，图3）以及对细胞色素c的响应（图4）作为质量控制指标。在操.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC，发现基金）和蒙克顿大学向 NP 提供的资助支持。LHB 感谢加拿大卫生研究院（CIHR）、新不伦瑞克创新基金会（NBIF）和蒙克顿大学提供的经费支持。EHC 的工作得到了加拿大阿尔茨海默病协会、脑加拿大、加拿大自然科学与工程研究委员会、加拿大乳腺癌基金会、新不伦瑞克创新基金会、新不伦瑞克健康研究基金会以及蒙克顿大学的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 高分辨率呼吸测量仪 Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | 启动 O2K 呼吸测量仪套件 |
| O2K-滴定套装 | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | 不同体积的 Hamilton 注射器 |
| Datlab 软件 | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | 用于数据采集和分析的软件 |
| 细尖无磁镊子 | VWR | 82027-400 | |
| Secura225D-1S-DQE | Sartorius AG, Goettingen, Germany | 半微量天平（由多家公司分销） | |
| Drosophila melanogaster 野生型 w1118 | Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA | 储存条件：24 °C | |
| 乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸 | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA 储存条件：室温 |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | 注意：对金属具有腐蚀性，急性毒性，皮肤腐蚀，严重眼损伤，急性水生毒性。 储存条件：室温 |
| CaCO3 | Sigma-Aldrich | C4830 | 储存条件：室温 |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | 储存条件：-20 °C |
| MgCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | M9272 | 储存条件：室温 |
| 牛磺酸 | Sigma-Aldrich | T0625 | 储存条件：室温 |
| Na2磷酸肌酸 | Sigma-Aldrich | P7936 | 储存条件：-20 °C |
| 咪唑 | Sigma-Aldrich | I5513 | 储存条件：室温 |
| 二硫苏糖醇 | Sigma-Aldrich | D0632 | 储存条件：2–8 °C |
| MES 水合物 | Sigma-Aldrich | M8250 | 储存条件：室温 |
| 来自皂荚树皮的皂苷 | Sigma-Aldrich | S7900 | 皂苷 储存条件：室温 溶液配制：5 mg 溶于 1 mL 保存液中。每日新鲜配制。 |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | 储存条件：室温 |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | 储存条件：室温 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | 储存条件：室温 |
| BSA | Sigma-Aldrich | 05470 | 储存条件：2–8 °C |
| Na2S2O4 | Sigma-Aldrich | 157953 | 连二亚硫酸钠。注意：自热性物质和混合物，急性毒性，急性水生毒性，慢性水生毒性。 储存条件：室温 |
| 丙酮酸钠 | Sigma-Aldrich | P2256 | 丙酮酸盐 储存条件：2–8 °C 溶液配制：溶于 MilliQ 水中。每日新鲜配制。 |
| L-(-)-苹果酸 | Sigma-Aldrich | M1000 | 苹果酸盐 储存条件：室温 溶液配制：溶于 MilliQ 水中，用 KOH 中和后于 -20 °C 保存。 |
| 腺苷-5'-二磷酸单钾盐水合物 | Sigma-Aldrich | A5285 | ADP 储存条件：-20 °C 溶液配制：溶于 MilliQ 水中，用 KOH 中和后于 -80 °C 保存。 |
| 马心细胞色素 c | Sigma-Aldrich | C7752 | 细胞色素 c 储存条件：-20 °C 溶液配制：溶于 MilliQ 水中，于 -20 °C 保存。 |
| L-脯氨酸 | Sigma-Aldrich | P0380 | 脯氨酸 储存条件：室温 溶液配制：溶于 MilliQ 水中，于 -20 °C 保存。 |
| 琥珀酸钠二碱六水合物 | Sigma-Aldrich | S2378 | 琥珀酸盐 储存条件：室温 溶液配制：溶于 MilliQ 水中，用 HCl 中和后于 -20 °C 保存。 |
| sn-甘油-3-磷酸双(环己胺)盐 | Sigma-Aldrich | G7886 | 甘油-3-磷酸盐 储存条件：-20 °C 溶液配制：溶于 MilliQ 水中，用 HCl 中和后于 -80 °C 保存。 |
| 羰基氰-4-(三氟甲氧基)苯腙 | Sigma-Aldrich | C2920 | FCCP。注意：急性毒性，皮肤致敏，慢性水生毒性。 储存条件：室温 溶液配制：溶于无水乙醇中。置于玻璃瓶中于 -20 °C 保存。 |
| 鱼藤酮 | Sigma-Aldrich | R8875 | 注意：急性毒性，皮肤刺激，眼刺激，特定靶器官毒性（呼吸系统），急性水生毒性，慢性水生毒性。 溶液配制：溶于无水乙醇中。置于避光瓶中于 -20 °C 保存。 |
| 丙二酸 | Sigma-Aldrich | M1296 | 丙二酸盐。注意：急性毒性，严重眼损伤。 储存条件：室温 溶液配制：溶于 MilliQ 水中，用 KOH 中和。每日新鲜配制。 |
| 来自Streptomyces sp的抗霉素 A | Sigma-Aldrich | A8674 | 抗霉素 A。注意：急性毒性，急性水生毒性，慢性水生毒性。 储存条件：-20 °C 溶液配制：溶于无水乙醇中，于 -20 °C 保存。 |
| N,N,N′,N′-四甲基-p-苯二胺 | Sigma-Aldrich | T7394 | TMPD 储存条件：室温 溶液配制：溶于 MilliQ 水中，置于避光瓶中于 -20 °C 保存。 |
| (+)-L-抗坏血酸钠 | Sigma-Aldrich | A4034 | 抗坏血酸盐 储存条件：室温 溶液配制：溶于 MilliQ 水中，置于避光瓶中于 -20 °C 保存。 |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 | 叠氮化钠。注意：急性毒性（经口和经皮），特定靶器官毒性（脑），水生毒性，慢性水生毒性。 溶液配制：溶于 MilliQ 水中，于 -20 °C 保存。 |
参考文献
- Stephenson, R., Metcalfe, N. H. Drosophila melanogaster: a fly through its history and current use. The journal of the Royal College of Physicians of Edinburgh. 43 (1), 70-75 (2013).
- Morgan, T. H. An attempt to analyze the constitution of the chromosomes on the basis of sex-limited inheritance in Drosophila. Journal o....
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