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JoVE Journal Genetics
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Genetics

Prova il ruolo dei plasmidi multicopia nell'evoluzione della resistenza agli Antibiotico

Published: May 2, 2018 doi: 10.3791/57386
Automatic Translation
1,2, 3, 4
1Department of Animal Health, Universidad Complutense de Madrid, 2Visavet Health Surveillance Centre, Universidad Complutense de Madrid, 3Department of Zoology, University of Oxford, 4Department of Microbiology, Hospital Universitario Ramon y Cajal (IRYCIS) and CIBERESP

Summary

Qui presentiamo un metodo sperimentale per testare il ruolo dei plasmidi multicopia nell'evoluzione della resistenza agli antibiotico.

Abstract

Plasmidi multicopia sono estremamente abbondanti nei procarioti, ma il loro ruolo nell'evoluzione batterica rimane capita male. Recentemente abbiamo dimostrato che l'aumento nel numero di copia del gene per cellula fornito dai plasmidi multicopia potrebbe accelerare l'evoluzione dei geni del plasmide-codificati. In questo lavoro, vi presentiamo un sistema sperimentale per testare la capacità di plasmidi multicopia di promuovere l'evoluzione. Utilizzando metodi di biologia molecolare semplice, abbiamo costruito un sistema di modello dove un gene di resistenza agli antibiotici può essere inserito in Escherichia coli MG1655, il cromosoma o su un plasmide multicopia. Usiamo un approccio sperimentale evoluzione di propagare i diversi ceppi sotto aumento delle concentrazioni di antibiotici e misuriamo la sopravvivenza delle popolazioni batteriche nel corso del tempo. La scelta della molecola antibiotica e il gene di resistenza è quindi che il gene solo può conferire resistenza attraverso l'acquisizione di mutazioni. Questo approccio "evolutivo salvataggio" fornisce un metodo semplice per verificare il potenziale dei plasmidi multicopia per promuovere l'acquisizione della resistenza agli antibiotico. Nel passaggio successivo del sistema sperimentale, le basi molecolari della resistenza agli antibiotico sono caratterizzate. Per identificare le mutazioni responsabili dell'acquisizione della resistenza agli antibiotico usiamo profonda sequenziamento del DNA dei campioni ottenuti da cloni e intere popolazioni. Infine, per confermare il ruolo delle mutazioni del gene sotto studio, ricostruirli in background parentale e testare il fenotipo di resistenza dei ceppi risultante.

Introduction

Resistenza agli antibiotici nei batteri è un problema di salute importante1. A un livello fondamentale, la diffusione della resistenza agli antibiotico nei batteri patogeni è un semplice esempio dell'evoluzione attraverso la selezione naturale2,3. In parole povere, l'uso di antibiotici genera la selezione di ceppi resistenti. Un problema chiave nella biologia evolutiva, pertanto, è di comprendere i fattori che influenzano la capacità delle popolazioni batteriche di evolvere la resistenza agli antibiotici. Esperimenti di selezione sono emerse come uno strumento molto potente per studiare la biologia evolutiva dei batteri, e questo campo ha prodotto incredibili intuizioni in una vasta gamma di problemi evolutivi4,5,6. In evoluzione sperimentale, popolazioni batteriche avviate da un unico ceppo parentale in serie sono attraversate in condizioni definite e strettamente controllate. Alcune delle mutazioni che si verificano durante la crescita di queste culture aumentare la forma fisica batterica, e questi diffondere attraverso le culture tramite la selezione naturale. Durante l'esperimento, campioni delle popolazioni sono periodicamente criogenicamente conservati per creare un record di fossili congelato non in evoluzione. Un ampio numero di approcci può essere utilizzato per caratterizzare in evoluzione di popolazioni batteriche, ma i due metodi più comuni sono saggi di fitness, che misura la capacità dei batteri evoluti per competere contro i loro lontani antenati e sequenziamento del genoma intero, che è utilizzato per identificare i cambiamenti genetici che l'adattamento in auto. A seguito di lavoro pionieristico di Richard Lenski e colleghi7,8, l'approccio standard in evoluzione sperimentale è stato quello di sfidare un numero relativamente piccolo di popolazioni replicare (in genere < 10) con adattamento a un nuovo sfida ambientale, come ad esempio nuove fonti di carbonio, la temperatura o un fago predatorio.

Infezioni causate da batteri resistenti agli antibiotici diventano un grosso problema quando la resistenza è abbastanza alta che non è possibile aumentare le concentrazioni di antibiotiche a livelli letali nei tessuti del paziente. I clinici sono quindi interessati a ciò che permette ai batteri di evolvere la resistenza ad alte dosi di antibiotico che si trovano sopra questa concentrazione di antibiotico di soglia, il punto di interruzione clinica. Come studiare sperimentalmente questo? Se un piccolo numero di popolazioni batteriche è sfidato con un'alta dose di antibiotico, come in uno stile di Lenski esperimento, quindi il risultato più probabile è che l'antibiotico guiderà tutte le popolazioni all'estinzione. Allo stesso tempo, se la dose di antibiotico utilizzato è bassa, sotto la concentrazione inibitoria minima (MIC) del ceppo parentale, allora è improbabile che popolazioni batteriche si evolveranno clinicamente rilevanti livelli di resistenza, soprattutto se resistenza comporta un costo grande. Un compromesso tra questi due scenari consiste nell'utilizzare un "salvataggio evolutivo" esperimento9,10,11. In questo approccio, un numero molto elevato di culture (in genere > 40) è contestato con dosi di antibiotici che aumentano nel tempo, in genere raddoppiando la concentrazione di antibiotica ogni giorno12. Il segno distintivo di questo esperimento è che qualsiasi popolazione che non si evolve la resistenza aumentata sarà guidato all'estinzione. La maggior parte delle popolazioni che si sono sfidate in questo modo saranno guidate estinte, ma una piccola minoranza persisterà evolvendosi elevati livelli di resistenza. In questa carta, indichiamo come questo disegno sperimentale può essere utilizzato per studiare multicopia plasmide contributo all'evoluzione della resistenza.

I batteri acquisire resistenza agli antibiotici attraverso due itinerari principali, le mutazioni cromosomiche e l'acquisizione di elementi genetici mobili, per lo più plasmidi13. Plasmidi gioca un ruolo chiave nell'evoluzione della resistenza agli Antibiotico, perché essi sono in grado di trasferire geni di resistenza tra i batteri da coniugazione14,15. Plasmidi possono essere divisi in due gruppi secondo la loro dimensione e biologia: "più piccoli", con numero di alta copia per cellula batterica e "grandi", con bassa copiare numero16,17. Il ruolo dei plasmidi grande nell'evoluzione della resistenza agli antibiotico è stata ampiamente documentato perché essi comprendono plasmidi coniugativi, che sono fattori chiave della diffusione di resistenza e resistenza multi tra batteri15. Piccoli plasmidi multicopia anche sono estremamente comuni in batteri17,18, ed essi spesso codice per geni di resistenza agli antibiotici19. Tuttavia, il ruolo dei piccoli plasmidi multicopia nell'evoluzione della resistenza agli antibiotico è stato studiato in misura minore.

In un recente lavoro, abbiamo proposto che plasmidi multicopia potrebbero accelerare l'evoluzione dei geni che portano aumentando i tassi di mutazione genica dovuta al maggior numero di copia del gene per cellula12. Utilizzando un modello sperimentale con Escherichia coli ceppo MG1655 e il β-lactamase gene blaTEM-1 è stato indicato che plasmidi multicopia accelerato il tasso di comparsa di TEM-1 mutazioni che conferiscono resistenza alla terza generazione ceftazidime cefalosporina. Questi risultati hanno indicato che i plasmidi multicopia potrebbero svolgere un ruolo importante nell'evoluzione della resistenza agli antibiotico.

Qui, presentiamo una descrizione dettagliata del metodo abbiamo sviluppato per studiare l'evoluzione multicopia plasmide-mediata della resistenza agli antibiotico. Questo metodo ha tre diverse fasi: primo, inserimento del gene in esame in un plasmide multicopia o il cromosoma del batterio ospite. In secondo luogo, utilizzare dell'evoluzione sperimentale (salvataggio evolutiva) per valutare il potenziale dei diversi ceppi di adattarsi alla pressione selettiva. E terzo, determinare la base molecolare sottostante plasmide-mediata evoluzione usando il DNA sequencing e ricostruendo le mutazioni sospetta individualmente nel genotipo parentale.

Infine, anche se il protocollo descritto qui è stato destinato per studiare l'evoluzione della resistenza agli Antibiotico, si può sostenere che questo metodo potrebbe essere generalmente utile per analizzare l'evoluzione delle innovazioni acquisite dalle mutazioni in qualsiasi multicopia gene di plasmide-codificati.

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Protocol

1. costruzione dell'apparato sperimentale, codifica il Gene di resistenza agli antibiotici

Nota: Qui MG1655 di e. coli è stato usato come il ceppo destinatario del gene di resistenza antibiotica plasmide o cromosoma-codificati. Il gene di resistenza agli antibiotici è codificato in cromosoma o un plasmide multicopia in un ceppo altrimenti isogeniche (Figura 1).

  1. Inserimento del gene di resistenza agli antibiotici a λ dei fagi integrazione sito (attB)20 del cromosoma di MG1655.
    1. Amplificare 500 bp-lungo regioni su entrambi i lati del sito cromosomico attB mediante PCR. Utilizzo di oligonucleotidi YbhC-F (5'-CCTGTACCGTACAGAGTAAT-3') e attB-R (5'-GCCCGCCACCCTCCGGGCCGGTATAAAAAAGCAGGCTTCA-3') per la regione di omologia sinistra e attB-F (5'-AGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTATACTAACTTGAGCGAAA-3') e YbhB/R (5'- TGGCGATAATATTTCACCGC-3') per quello giusto. Amplificare il gene di resistenza diTEM-1 blautilizzando primers Tem1-pBAD-F (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3') e Tem1-pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3'). Disegnare primers con circa 20 bp (nel 5' UTR) della sequenza mostrando complementarità al frammento che sta per essere fusa a.
    2. Fusibile di regioni di omologia per il prodotto PCR del gene resistenza agli antibiotici (compresa la regione del promotore) utilizzando isotermici Assemblea21, a 50 ° C per 30 min.
    3. Electroporate MG1655 cellule contenenti plasmide pKOBEG.
      Nota: pKOBEG è un vettore termosensibile che contiene il λ rosso macchinari, promuovendo gli scambi allelico basati su omologia tra il cromosoma e di prodotti PCR22.
      1. Utilizzare 1 µ l di prodotto dal passaggio 1.1.223 in 40 µ l di celle electrocompetent in cuvette di 2 mm a 4 ° C e 2,5 kV. Risospendere le cellule in 1 mL di brodo LB + 0,2% arabinosio per mantenere l'espressione del λ rosso macchinari.
      2. Trasferire il volume totale in una provetta di microfuge e incubare 2 ore a 30 ° C (temperatura permissiva per pKOBEG) con intenso scuotimento (200 giri/min in un agitatore orbitale) per consentire l'espressione fenotipica dei marcatori di resistenza inserita nel cromosoma.
      3. Piastra le cellule su LB agar che contengono l'antibiotico adatto per selezionare per il gene di resistenza agli antibiotici (ampicillina o carbenicillina a 100 mg/l per blaTEM-1).
    4. Piastra di 100 µ l su una piastra di Petri e spin giù il resto del volume, e risospendere in 100 µ l di brodo LB fresco e piatto si su un'altra piastra di Petri. Incubare per una notte a 42 ° C.
      Nota: Questa temperatura è non permissivi per la replicazione del pKOBEG. Le colonie in grado di crescere in queste condizioni avrà perso pKOBEG e presenterà il gene di resistenza integrato nel sito attB (per semplicità si chiamerà questo ceppo MG1655::resA da qui su).
    5. Test per la perdita di pKOBEG replicando le colonie di interesse in piastre con cloramfenicolo (antibiotico contro cui pKOBEG contiene un indicatore di resistenza).
      Nota: La mancanza di crescita nelle piastre di cloramfenicolo alla temperatura permissiva di 30 ° c è indicativo dell'assenza del plasmide.
    6. Al fine di verificare i cloni, PCR amplificano la costruzione utilizzando primer esterno YbhC-Extern (5'-TTTGTGACCAGAAGACCGCA-3') e YbhB-Extern (5'-CTCATCAGTAACGATCTGCG-3'), verificare, mediante elettroforesi su gel, la dimensione corretta del amplicon e sequenza la prodotto purificato per assicurare che la sequenza del gene inserito sia corretta.
  2. Inserire il gene di resistenza agli antibiotici in un plasmide multicopia.
    Nota: Poiché plasmidi con numero di copie di altissima tendono a imporre una forte riduzione nella forma fisica host batterica, si consiglia l'uso di plasmidi multicopia con un'origine naturale di replica, ad esempio p3655 (pSU18T-pBADgfp2, ColE1-tipo origine di replica24). Questi plasmidi di solito presentano un numero di copia moderata di circa 15-20 copie per cellula.
    1. PCR amplificare il gene di resistenza agli antibiotici di scelta (tra cui la regione del promotore), il prodotto PCR di fosforilare e lega i alla dorsale della PCR amplificati del plasmide:
      1. PCR amplificano il gene di resistenza agli antibiotici; per blaTEM-1 utilizzare primer Tem1-pBAD-F (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3') e Tem1-pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3').
      2. Fosforilare il prodotto purificato utilizzando della chinasi di polinucleotide T4, seguendo le istruzioni del produttore.
      3. PCR amplificano la spina dorsale del plasmide usando un ad alta fedeltà della polimerasi e oligonucleotidi pBAD-F (5'-CGTTGATCGGCACGTAAGAG-3') e pBAD-R (5'-AAACGACGGCCAGTGCCAAG-3').
      4. Lega i due frammenti di PCR utilizzando T4-ligasi seguendo le linee guida del produttore.
    2. Electroporate, come descritto in precedenza, 40 µ l di celle electrocompetent Escherichia coli DH5-α con un massimo di 1 µ l di prodotto di legatura e selezionare sugli antibiotici adatti per il gene di resistenza agli antibiotici (ampicillina o carbenicillina a 100 mg/L per blaTEM-1) e la spina dorsale del plasmide.
      Nota: Completare LB con arabinosio qui è inutile.
    3. Estrarre il plasmide utilizzando il kit commerciale mini-preparazione di scelta del lettore:
      1. Raccogliere 5 mL di una coltura durante la notte mediante centrifugazione a 12.000 x g a temperatura ambiente. Risospendere le cellule in 250 µ l di soluzione di risospensione e mescolare bene. Aggiungere 250 µ l di soluzione di lisi e mescolare bene. Aggiungere 350 µ l di neutralizzazione e mescolare bene.
      2. Trasferire il surnatante nella colonna di associazione DNA fornita con il kit, centrifugare per 1 min e scartare il flusso attraverso. Lavare due volte la colonna con 500 µ l di soluzione di lavaggio, centrifugazione per 1 minuto e scartando l'attraversamento a ogni lavaggio. Centrifugare la colonna vuota per ulteriori 1 min rimuovere il tampone di lavaggio residua.
      3. Inserire la colonna in una provetta pulita e aggiungere 50 µ l di acqua ultra-pura per la membrana per eluire il DNA purificato. Centrifugare per 1-2 min e raccogliere il flusso attraverso che contiene il plasmide purificato. Sequenza del gene di interesse nel plasmide utilizzando primers da fuori la sequenza inserita per confermare che la sequenza è corretta e che nessuna mutazione sono presente nel gene di resistenza prima gli esperimenti di evoluzione di Sanger.
    4. Una volta verificata la sequenza, electroporate il plasmide nel ceppo di e. coli MG1655, come descritto in precedenza.
      Nota: Questo produce ceppo MG1655/pRESA.

2. evolutivo Rescue approccio ad evolversi sperimentalmente la resistenza agli antibiotici (Figura 1)

  1. Striscia fuori i ceppi in fase di studio sulle piastre di LB: MG1655::resA e MG1655/pRESA oltre il ceppo parentale suscettibile, MG1655.
    Nota: Plasmide pRESA dovrebbe essere stabile in MG1655, c'è nessuna necessità di aggiungere antibiotici per le piastre LB. Tassi di mutazione in e. coli sono abbastanza bassi, quindi una volta verificata la costruzione non è necessario verificare la sequenza di plasmide ad ogni passo.
  2. Preparare le piastre da 96 pozzetti con 200 µ l di LB in ciascun pozzetto e inoculare 48 colonie isolate di ogni ceppo in pozzetti indipendenti (una piastra per ceppo). Incubare le piastre durante la notte a 37 ° C e 200 giri/min. Tenere una scorta congelata di queste popolazioni fondatrici.
    Nota: Per prevenire e controllare per cross-contaminazione della coltura in piastre da 96 pozzetti, utilizzare un design piatto della scacchiera di intercalanti pozzetti inoculati con medium senza batteri in tutta la piastra a 96 pozzetti. Utilizzare questo disegno piastra durante l'intero sviluppo sperimentale.
  3. Iniziare l'esperimento evolutivo salvataggio inoculando 2 µ l da ogni pozzetto delle piastre con le popolazioni del fondatore in nuove piastre da 96 pozzetti con 198 µ l di LB in ciascun pozzetto con una sub concentrazione di antibiotico in fase di studio. Per l'approccio evolutivo salvataggio inizia con ¼ o 1/8 della concentrazione inibitoria minima (MIC, determinato precedentemente25) dell'antibiotico in LB per ciascuno dei tre ceppi e raddoppiare la concentrazione del quotidiano antibiotico. Utilizzare questo approccio per massimizzare le possibilità delle popolazioni di acquisire resistenza mutazioni26. Incubare le piastre a 37 ° C e 200 giri/min per 20 h.
    Nota: Misurare il pernottamento OD delle popolazioni fondatore. Se ci sono differenze significative nella OD tra ceppi correggere l'inoculo iniziale per avviare l'esperimento con lo stesso numero di cellule per pozzetto.
  4. Ogni giorno, misurare il diametro esterno di ogni popolazione dopo una notte cultura ed eseguire un trasferimento delle culture, come descritto al punto 2.3, a nuove piastre da 96 pozzetti con doppio della concentrazione dell'antibiotico rispetto al giorno prima. Incubare le piastre 20 h a 37 ° C e 200 giri/min.
    Nota: Il fattore di diluizione di 1: 100 produce circa 6-7 generazioni al giorno.
  5. In parallelo, è necessario propagare controllare le popolazioni di ogni ceppo nelle stesse condizioni come descritto ai punti 2.3 e 2.4, ma in assenza di antibiotici.
    Nota: Controllare le popolazioni di aiutare a discriminare tra mutazioni derivanti a causa della presenza di antibiotici e di mutazioni generale aiutando i batteri di adattarsi alle condizioni sperimentali. Parallele mutazioni derivanti in assenza di antibiotici sono suscettibili di essere aiutare i batteri di adattarsi alle condizioni sperimentali e non correlate alla resistenza agli antibiotico.
  6. Tenere traccia del numero delle popolazioni sopravvissute, ogni giorno, misurando l'assorbanza a una lunghezza d'onda di 600 nm (OD) delle culture utilizzando un lettore di piastra.
    Nota: I valori di densità ottica inferiore a 0,1 indicano l'estinzione della popolazione. Vedere la Figura 2 per un esempio di curve di sopravvivenza.
  7. Tenere una scorta congelata di tutte le popolazioni periodicamente (ogni 3-5 giorni).
  8. Utilizzare test log-rank [pacchetto "sopravvivenza" in RStudio (versione 0.99.486)] per determinare le differenze statistiche nella sopravvivenza delle popolazioni di diversi ceppi nel corso del tempo sotto la crescente concentrazione di antibiotici12.
    Nota: Questo esperimento determinerà se plasmidi multicopia potenziare l'evoluzione della resistenza agli antibiotico per la particolare antibiotico e gene in esame.

3. base molecolare dell'evoluzione della resistenza agli antibiotici (Figura 1)

  1. Eseguire estrazioni di DNA totale da un numero rappresentativo di popolazioni e cloni tra ceppi e trattamenti. Comprendono i ceppi parentali (MG1655, MG1655::resA e MG1655/pRESA) per essere in grado di rilevare le mutazioni accumulando durante l'esperimento.
    Nota: Per esempi di kit di estrazione del DNA, vedere la tabella dei materiali. Ogni kit contiene diversi protocolli; seguire le istruzioni del produttore.
  2. Quantificare la concentrazione e la qualità del DNA. Ci sono diversi metodi per determinare la concentrazione e la qualità del DNA. Determinare la qualità della misura dei rapporti di assorbanza 260 nm/280 nm e 260 nm/230 nm. Utilizzare un colorante fluorescente, di legame al DNA per misurare la concentrazione di DNA seguendo le istruzioni del produttore, e l'elettroforesi del gel dell'agarosi per confermare che non c' non è Nessuna degradazione del DNA o RNA contaminazione.
  3. Sequenziamento di DNA profondo uso da campioni di intere popolazioni e singoli cloni di indagare le basi genetiche della resistenza agli antibiotico.
    Nota: Abbiamo condotto sequenziamento tutti presso il Wellcome Trust Centre for Human Genetics, Oxford, UK. Per maggiori dettagli vedere San Millan et al. 201612.
  4. Utilizzare il breseq 0.26.1 pipeline27,28 per rilevare le mutazioni, utilizzando la modalità di polimorfismo per valutare la frequenza delle mutazioni nella popolazione. Confrontare i diversi genomi evoluti al genoma parentale per rilevare le mutazioni che si sono accumulate durante l'esperimento.
  5. Confronta le mutazioni accumulate in parallelo nelle popolazioni di controllo con quelle delle popolazioni si è evoluto sotto la crescente concentrazione di antibiotici per differenziare tra mutazioni aiutando i batteri di adattarsi alle condizioni sperimentali ( quelli hanno trovato nelle popolazioni di controllo) e coloro che sono coinvolti nella resistenza agli antibiotici (quelli trovati esclusivamente in popolazioni sottoposte alla pressione antibiotica).
    Nota: Il numero di mutazioni parallele è solitamente basso, così diverse mutazioni parallele fra i trattamenti è facilmente valutabile. A parte le mutazioni nel gene della resistenza agli antibiotici in fase di studio che è molto probabile trovare altre mutazioni associate resistenza antibiotica nel cromosoma, tali mutazioni in porins o efflusso sistemi12.
  6. Ricostruire le mutazioni nel gene della resistenza agli antibiotici in ceppo parentale utilizzando lo stesso approccio come sezione 1 del presente protocollo. Seguire i punti 1.1 e 1.2 del protocollo per introdurre le nuove mutazioni in background parentale (utilizzando i geni evoluti come un modello PCR). Analizzare i fenotipi di resistenza agli antibiotici di queste nuove costruzioni per confermare il ruolo delle mutazioni.

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Representative Results

Nel nostro lavoro precedente, è stata studiata l'evoluzione del β-lactamase gene blaTEM-1 verso che conferiscono resistenza alla terza generazione cefalosporina ceftazidime12 . Questo gene è stato scelto perché, anche se TEM-1 non conferisce resistenza a ceftazidime, mutazioni nel blaTEM-1 possono ampliare la gamma di attività di TEM-1 per idrolizzare cefalosporine come ceftazidime29. Le mutazioni in enzimi di resistenza agli antibiotici come β-lattamasi o aminoglicoside modificando gli enzimi che conduce ai cambiamenti nella loro gamma di attività sono comuni29,30. Questo sistema sperimentale è ideale per esplorare l'evoluzione di questo tipo di enzimi. Per una relazione dettagliata di un esperimento riuscito seguendo questo protocollo si veda San Millan et al. 201612.

Qui, un esempio dei possibili esiti di questo sistema sperimentale è presentato per illustrare il protocollo (Nota che i dati utilizzati in questo esempio non sono reali). Per studiare il ruolo potenziale di multicopia plasmidi nell'evoluzione del gene di resistenza agli antibiotici in studiano in questo esempio (chiamiamolo resA), sviluppiamo il sistema sperimentale seguendo il protocollo descritto sopra, sezione 1. Gli esperimenti producono tre ceppi: MG1655, MG1655::resA e MG1655/pRESA. L'evoluzione della resistenza a due antibiotici ß-lattamici diversi (ceftazidime e meropenem) è stato testato seguendo i passaggi descritti nella sezione 2 del protocollo. La figura 2 Mostra le curve di sopravvivenza delle popolazioni oggetto di studio. In questo esempio, c'è un aumento significativo nella sopravvivenza di popolazioni appartenenti a MG1655/pRESA in evoluzione a ceftazidime rispetto a quelli da MG1655 o MG1655::resA (test log-rank, P< 0,05). D'altra parte, nel caso di meropenem, non ci sono nessuna differenza significativa nella sopravvivenza delle popolazioni appartenenti ai ceppi diversi (test log-rank, P> 0.05). Di conseguenza, questi risultati suggeriscono che la presenza di gene resA in un plasmide multicopia rafforza l'evoluzione della resistenza a ceftazidime, ma non a meropenem.

Nel passaggio finale dell'esperimento, la base molecolare della resistenza agli antibiotico è studiata, come spiegato nella sezione 3 del protocollo. In primo luogo, il sequenziamento del DNA rivelerà le mutazioni nella resA che potrebbero essere responsabili del fenotipo di resistenza. E in secondo luogo, la ricostruzione delle mutazioni di resA nella MG1655 parentale (sia nel cromosoma e plasmide) sarà confermare o scartare ruoli: il fenotipo di resistenza agli antibiotici.

Figure 1
Figura 1 . Rappresentazione schematica delle diverse fasi del protocollo. Da sinistra a destra: (i) costruzione dell'apparato sperimentale: MG1655, MG1655::resA e MG1655/pRESA. Cromosoma batterico è rappresentato in marrone, il plasmide in blu e il gene di resA in rosso. (ii) approccio di salvataggio evolutiva ad evolversi sperimentalmente la resistenza agli antibiotico: diverse popolazioni di diversi ceppi vengono propagate in aumento della concentrazione dell'antibiotico. (iii) analisi delle basi molecolari della resistenza agli antibiotico: campioni di sequenziamento del DNA dalle popolazioni evolute e cloni, rilevazione delle mutazioni di resistenza agli antibiotici e la ricostruzione di queste mutazioni nel ceppo parentale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Nella figura 2. Curve di sopravvivenza con aumento delle concentrazioni di antibiotici. Rappresentazione del numero di popolazioni vitali appartenenti ai ceppi MG1655, MG1655::resAe MG1655/pRESA nel corso del tempo. 48 popolazioni di ogni ceppo sono state propagate in aumento delle concentrazioni di antibiotici ceftazidime e meropenem, a partire da 1/8 del microfono il giorno 1 e il raddoppiamento della concentrazione dell'antibiotico ogni giorno. La linea verticale rossa tratteggiata rappresenta il MIC degli antibiotici in fase di studio. Si noti che, nel caso di ceftazidime, ci sono differenze significative nella sopravvivenza delle popolazioni appartenenti a diversi ceppi nel tempo (test log-rank, P< 0,05). Fondamentalmente, solo popolazioni portando il plasmide sono in grado di sopravvivere fino a alto livello concentrazioni di antibiotico. D'altra parte, nel caso di meropenem, non ci sono nessuna differenza significativa nella sopravvivenza delle popolazioni nel tempo (test log-rank, P> 0.05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Vi presentiamo un nuovo protocollo che unisce la biologia molecolare, evoluzione sperimentale e sequenziamento del DNA profondo destinato per studiare il ruolo dei plasmidi multicopia nell'evoluzione della resistenza agli antibiotico nei batteri. Sebbene questo protocollo combina tecniche provenienti da diversi campi, tutti i metodi necessari per svilupparlo sono semplici e possono essere eseguiti in un laboratorio di microbiologia regolari. I passaggi più critici nel protocollo sono probabilmente la costruzione di ceppi di sistema il modello e la ricostruzione delle mutazioni osservate dopo l'evoluzione sperimentale (che vengono eseguiti utilizzando il metodo stesso esatto). Tuttavia, il sistema isotermico Assemblea21, semplifica notevolmente questo protocollo qualsiasi utente con un livello intermedio di esperienza in biologia molecolare possibile implementarlo.

Un altro passaggio fondamentale del protocollo è l'evoluzione sperimentale sotto aumento delle concentrazioni di antibiotici. Ad esempio, questo protocollo inizia l'esperimento con ¼-1/8 del microfono dei ceppi e quindi raddoppiando la concentrazione di antibiotico ogni giorno. Tuttavia, un più basso tasso di variazione antibiotico potrebbe aumentare la possibilità di salvataggio evolutivo da estinzione26. Di conseguenza, il tasso di variazione delle concentrazioni di antibiotiche è uno dei parametri che possono essere modificati per promuovere l'evoluzione della resistenza agli antibiotico.

Analisi e sequenziamento del DNA sono anche gli aspetti chiave del design sperimentale. Risultati sono più semplici quando l'ordinamento viene eseguita su campioni di DNA sia da intere popolazioni singoli cloni, in diversi momenti nell'esperimento. Risultati da popolazioni di sequenziamento rivelerà differenze generali nei profili di mutazione tra trattamenti, nonché spazza selettiva di mutazioni benefiche nel tempo e potenziali eventi di interferenza clonale. Quando si analizzano sequenze da popolazioni, è meglio filtrare le mutazioni che mai ha superato 10% frequenza in ogni popolazione. Sequenze da singoli cloni contribuire a confermare i risultati ottenuti dalle popolazioni e, soprattutto, rivelano le specifiche combinazioni fra le diverse mutazioni osservate a livello della popolazione. Queste associazioni specifiche possono aiutare a scoprire interazioni epistatiche tra mutazioni, che svolgono un ruolo critico nell'adattamento batterico31.

Utilizzando questo metodo, abbiamo recentemente dimostrato che plasmidi multicopia accelerano l'evoluzione della resistenza agli Antibiotico, in primo luogo aumentando la frequenza di comparsa di mutazioni novelle e quindi amplificando l'effetto delle mutazioni a causa di dosaggio del gene maggiore12 . Pertanto, abbiamo sviluppato il metodo come strumento per indagare l'evoluzione della resistenza agli Antibiotico, ma può avere una gamma molto più ampia di applicazioni. Vale a dire, questo sistema potrebbe essere utilizzato per studiare la capacità di qualsiasi gene batterico ad evolvere verso una funzione nuova o migliorata in modo più generale. Questo sistema potrebbe essere utilizzato, ad esempio, per testare la capacità di un'enzima/via metabolica di utilizzare di nuovo carbonio substrati32. Inoltre, potrebbe essere utilizzato invece di hypermutators (batteri con un difetto nei sistemi cellulari coinvolti nella riparazione del disadattamento del DNA) per studiare l'evoluzione adattiva in batteri, evitando il bias mutational introdotto da hypermutators.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dall'Instituto de Salud Carlos III (Plan Estatal de I + D + io 2013-2016): concede CP15-00012, PI16-00860 e CIBER (CB06/02/0053), co-finanziato dal Fondo europeo di sviluppo regionale ' un modo per raggiungere l'Europa ' (FESR). JAE è supportato dal programma Atracción de talento del governo della regione di Madrid (2016-T1/BIO-1105) e I + D Excelencia di spagnolo Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (BIO2017-85056-P). ASM è supportato da un Miguel Servet Fellowship da Instituto de Salud Carlos III (MS15/00012) co-finanziato dal Fondo sociale europeo The "Investiamo nel vostro futuro" (FSE) e del FESR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thermocycler BioRad C1000
Electroporator BiorRad 1652660
Electroporation cuvettes Sigma-Aldrich Z706078
NanoDrop 2000/2000c Thermo Fisher Scientific ND-2000 Determine DNA quality measuring the ratios of absorbance 260nm/280nm and 260nm/230nm
Incubator Memmert UF1060
Incubator (shaker) Cole-Parmer Ltd SI500
Electrophoresis power supply BioRad 1645070 Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis chamber BioRad 1704405 Agarose gel electrophoresis
Pippettes Biohit 725020, 725050, 725060, 725070
Multi-channel pippetes Biohit 728220, 728230,
728240
Plate reader Synergy HTX BioTek BTS1LF
Inoculating loops Sigma-Aldrich I8388
96-well plates Falcon 351172
LB BD Difco DF0446-17-3
LB agar Fisher scientific BP1425-500
Phusion Polymerase Thermo Fisher Scientific F533S
Gibson Assembly New England Biolabs E2611S
Resctriction enzymes Fermentas FastDigest
Antibiotics Sigma-Aldrich
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 Plasmid extraction kit
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120 gDNA extraction kit
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69506 gDNA extraction kit
Electroporation cuvettes Sigma-Aldrich Z706078
Petri dishes Sigma-Aldrich D9054
Cryotubes ClearLine 390701
96-well plates (-80ºC storage) Thermo Fisher Scientific 249945
QuantiFluor dsDNA System Promega E2670 Quantification of DNA concentartion
Agarose BioRad 1613100 Agarose gel electrophoresis
50x TAE buffer BioRad 1610743 Agarose gel electrophoresis
T4 Polynucleotide Kinase Thermo Fisher Scientific EK0031
T4 DNA Ligase Thermo Fisher Scientific EL0014

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References

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Genetica problema 135 plasmide resistenza agli Antibiotico evoluzione salvataggio evolutiva plasmidi multicopia mutazione evoluzione sperimentale
Prova il ruolo dei plasmidi multicopia nell'evoluzione della resistenza agli Antibiotico
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Escudero, J. A., MacLean, R. C., San … More

Escudero, J. A., MacLean, R. C., San Millan, A. Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance. J. Vis. Exp. (135), e57386, doi:10.3791/57386 (2018).

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