Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Double-stranded RNA orale afleveringsmethoden voor het opwekken van RNA-interferentie in het floëem en Hemipteran insecten Plant-sap-voeding

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57390
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Invasive Insect Biocontrol and Behavior Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2Horticultural Research Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

Summary

Dit artikel demonstreert nieuwe technieken ontwikkeld voor mondelinge levering van double-stranded RNA (dsRNA) via de vaatbundels weefsels van planten voor RNA-interferentie (RNAi) in het floëem sap voederen van insecten.

Abstract

Floëem en plant sap voeding insecten invasie van de integriteit van gewassen en vruchten te halen voedingsstoffen, in het proces schadelijk voor voeding bestemde gewassen. Hemipteran insecten account voor een aantal economisch grote plagen van planten die leiden schade aan gewassen tot door het eten van floëem sap. De bruine marmorated hilare (BMSB), Halyomorpha Kizil Irmak (Wantsen: Schildwantsen) en de Aziatische citrus psyllid (ACS), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) zijn hemipteran insectenplagen geïntroduceerd in Noord-Amerika, waar ze zijn een invasieve landbouw plaag voor hoogwaardige specialiteit, rij, en stapelvezels gewassen en citrusvruchten, evenals een overlast plaag wanneer ze binnenshuis aggregaat. Insecticide resistentie in vele soorten heeft geleid tot de ontwikkeling van alternatieve methoden van pest managementstrategieën. Double-stranded RNA (dsRNA)-gemedieerde RNA-interferentie (RNAi) is een gen silencing mechanisme voor functioneel genomisch studies met mogelijke toepassingen als een instrument voor het beheer van insectenplagen. Exogenously gesynthetiseerde dsRNA of Klein Mengend RNA (siRNA) kan leiden tot zeer efficiënte gene zwijgen door de afbraak van endogene RNA, dat homoloog aan die gepresenteerd. Effectieve en ecologische gebruik van RNAi als moleculaire biopesticides voor biocontrol van hemipteran insecten vereist de in vivo levering van dsRNAs via voeding. Hier tonen we methoden voor levering van dsRNA aan insecten: laden van dsRNA in groene bonen door onderdompeling en absorberen van gen-specifieke dsRNA met mondelinge bezorging via ingestie. We hebben ook niet-transgene plant levering benaderingen met behulp van naalden sprays, wortel kletsnat, kofferbak injecties evenals kleikorrels, die allemaal essentieel voor duurzame release van dsRNA kan worden geschetst. Efficiënte levering door oraal ingenomen dsRNA werd bevestigd als een effectieve dosering voor het opwekken van een aanzienlijke afname van de expressie van gerichte genen, zoals juvenile hormoon acid-O-methyltransferase (JHAMT) en vitellogenin (Vg). Deze innovatieve methoden vertegenwoordigen strategieën voor levering van dsRNA gebruiken in gewasbescherming en overwinnen van de uitdagingen op milieugebied voor gewasbescherming.

Introduction

Hemipteran insecten omvatten enkele van de meest economisch belangrijke plagen van agriculturebecause van hun vermogen om te bereiken van verhoogde bevolkingsgroei en ziektes bij planten verspreiden. De BMSB, H. Kizil Irmak Stål, is een invasieve plaag die per ongeluk werd geïntroduceerd in het westelijk halfrond in Allentown, Pennsylvania uit Azië (China, Taiwan, Korea en Japan) met de eerste waarneming in 19961gemeld. Sinds de invoering ervan, BMSB is geconstateerd in 43 landen met de hoogste populaties in de Mid-Atlantische (DE, MD, PA, NJ, VA, en WV), alsook in Canada en Europa, en vormt een potentiële bedreiging voor de landbouw2. Als een polyfage plaag, kunnen BMSB teweeg brengen schade aan ongeveer 300 geïdentificeerde plant gastheren met inbegrip van hoogwaardige gewassen zoals appels, druiven, sierplanten, zaadgewassen, sojabonen en maïs. Schade veroorzaakt vooral vanwege de wijze van het voeden lacerate en flush genoemd waar het dier doorboort het gewas van de host met de naald-achtige stilet toegang te krijgen tot de voedingsstoffen uit de vaatbundels weefsels2,3. BMSB is ook een overdekt ongedierte zoals zij woonplaats in woonruimtes zoals scholen vinden kunnen en huizen tijdens herfst en winter2. Chemische stoffen en aeroallergens uitgebracht door BMSB werden gemeld aan illegale allergische reactie in fruit gewas werknemers. BMSB kunnen ook bijdragen tot de allergische ziekte leiden tot conjunctivitis, contactdermatitis en rhinitis in gevoelige personen4,5. Een ander hemipteran insect, de ACS, D. citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), is een ernstige plaag van citrusvruchten, en stuurt het floëem-beperkte-bacteriën (Candidatus Liberibacter asiaticus) veroorzaken Huanglongbing (HLB), beter bekend als zoals citrus vergroening ziekte6,7. HLB werd voor het eerst gemeld uit Zuid-China en heeft zich verspreid naar 40 verschillende Aziatische, Afrikaanse, Oceanië, Zuid- en Noord-Amerikaanse landen7. Citrus "vergroening" is een wereldwijd probleem met het bedreigen van de economische en financiële verliezen als gevolg van verlies van citrusvruchten; Vandaar, beheer van ACS-landen wordt overwogen van het grootste belang ter voorkoming en bestrijding van HLB.

Maatregelen voor doeltreffende controle op deze insectenplagen gewoonlijk vereist de toepassing van chemische bestrijdingsmiddelen die relatief kort zijn geleefd. Chemische insecticide bestrijdingsstrategieën vaak gebrek aan veilige milieumanagement strategieën of gevoeligheid als gevolg van bestrijdingsmiddelen weerstand in8,9van de populaties van de pest is afgenomen. Vandaar, de biologische bestrijding van plagen met moleculaire biopesticides is een mogelijke alternatief, maar het gebruik ervan blijft wereldwijd bescheiden, en verschillende soorten parasitoïden (b.v. Trisolcus japonicus) kunnen ook gelden als natuurlijke biologische besturingselementen. RNAi is een potentieel opkomende technologie voor het beheer van invasieve insectenplagen met moleculaire biopesticides10. RNAi is een goed beschreven gene regelgevende mechanisme dat de effectieve posttranscriptional gen tot zwijgen brengen van endogene vergemakkelijkt evenals de invasie van dsRNAs in een reeks specifieke wijze, die uiteindelijk tot de regulering van de expressie van genen op het mRNA leidt niveau11,12. Kort, wanneer exogene dsRNA is geïnternaliseerd in een cel die het tot siRNAs wordt verwerkt door een lid van de superfamilie van de RNase III bidentate nuclease, Dicer, die is evolutionair bewaard in wormen, vliegen, planten, schimmels en zoogdieren13, genoemd 14 , 15. deze 21-25 nucleotide siRNA duplexen vervolgens worden afgewikkeld en geïntegreerd in het RNA-geïnduceerde silencing complex (RISC) RNAs begeleiden. Dit complex RISC-RNA kan Watson-Crick basis koppeling naar de complementaire doelgroep mRNA; Dit leidt uiteindelijk tot splitsing door de Argonaute proteïne, een multi-domein eiwit met een RNase H-achtige domein, die degradeert de bijbehorende mRNA en vermindert eiwit vertaling, waardoor posttranscriptional gene silencing16 , 17 , 18.

RNAi voor gewasbescherming vereist de invoering van dsRNA in vivo te zwijgen van het gen van belang, waardoor het activeren van de siRNA pathway. Verschillende methoden die zijn gebruikt voor dsRNA levering aan insecten en insecten cellen voor het opwekken van systemische RNAi omvatten voeding10,19, inweken van20,21, microinjection22, vervoerders zoals liposomen 23, en andere technieken24. RNAi was eerste aangetoond in Caenorhabditis elegans unc-22 genexpressie door brand zwijgen op te leggen en Mello25, gevolgd door knockdown in expressie van de Gekroesde genen bij Drosophila melanogaster26. Eerste functionele studies gebruikt microinjection dsRNA om in te leveren insecten, zoals Apis mellifera22,27, Acyrthosiphon pisum28, Blattella germanica29, H. Kizil Irmak30en Lepidoptera insecten (herzien door Terenius et al. 31). microinjection is voordelig voor het leveren van een nauwkeurige en precieze dosis op de site van belangstelling voor het insect. Zij dergelijke septische lekke banden expressie van immuun verwante genen als gevolg van trauma32, vandaar uitlokken kunnen, uitgesloten zijn bruikbaarheid in de ontwikkeling van de agrarische biopesticides.

Een andere methode van het leveren van dsRNA in vivo is door inweken, waarbij inname of absorptie van dsRNA door schorsing van dieren of cellen in het algemeen in extracellulaire opslagmedium met dsRNA. Soaking is gebruikt voor het efficiënt opwekken van RNAi in Drosophila S2 weefselkweek cellen voor de remming van Downstream-van-Raf1 (DSOR1) mitogeen-geactiveerd proteïne kinase kinase (MAPKK)20, evenals in C. elegans om te zwijgen van de POS-1 gene33. DsRNA geleverd met inweken is echter minder efficiënt voor het opwekken van RNAi ten opzichte van microinjection20. RNAi gemedieerde monddood maken in een kauwen insect werd het eerst getoond in de westerse maïswortelboorder (WCR) (Diabrotica virgifera virgifera) door de dsRNA infusie in een kunstmatige agar dieet10. Eerdere rapporten hebben methoden om te leveren dsRNA toegediend in natuurlijke diëten specifiek voor geleedpotigen34samengevat. Deze methoden voor het afleveren wilden verder relatief effectief naar kunstmatige vormen van levering; zoals het geval van de tseetseevlieg (Glossina morsitans morsitans), waar gelijke knockdown van een immuun-gerelateerde gen werd waargenomen wanneer dsRNA werd geleverd via bloedmeel of microinjected35. Ook levering van dsRNA via druppels in licht bruin apple nachtvlinder (Epiphyas postvittana)36,37larven Koolmot (Plutella xylostella), evenals honing bijen38,39 geïnduceerde efficiënte RNAi. Meest effectieve RNAi experimenten in hemipteran hebben injectie van dsRNA40 gebruikt omdat mondelinge levering van dsRNA in hemipteran insecten lastig is omdat het moet worden geleverd door middel van de waardplant vascular weefsels. Effectieve RNAi werd ook waargenomen in de ACS-landen en glazig-gevleugelde scherpschutter dwergcicade (GWSS), Homalodisca vitripennis: dsRNA werd geleverd door middel van citrus en wijnstokken die had dsRNA geabsorbeerd in de vaatbundels weefsels via root kletsnat, naalden sprays, kofferbak injecties of absorptie door stekken41,42,43,44,45,46. Dit resulteerde ook in het eerste octrooi voor dsRNA tegen de ACS (2016, ons 20170211082 A1). Levering van siRNA en dsRNA gebruikend dragers zoals nanodeeltjes en liposomen zorgt voor stabiliteit en stijgingen van de geleverde dsRNA werkzaamheid zijn snel opkomende23,47,48,49 ,,50. Een nieuwe klasse van nanoparticle gebaseerde leverende voertuigen voor nucleïnezuren voor in vitro en in vivo die specifiek voor therapeutische toepassingen immense potentieel geven kunnen als geschikte levering51 vectorenwerd samengevat. Nanodeeltjes als een leveringsvoertuig voor dsRNA kan hebben nadelen zoals oplosbaarheid, hydrophobicity of beperkte bioaccumulatie52, maar een geschikt polymeer hulp levering deze nadelen kan compenseren. Ontwikkeling en het gebruik van het zelf leveren nucleotiden zijn ook genaamd 'antisense oligonucleotides', die één gestrande RNA/DNA duplexen46in opkomst.

Vitellogenesis bij geleedpotigen is een sleutel proces beheersing van de voortplanting en gereglementeerd door juvenile hormoon (JH) of ecdysone, welke zijn de belangrijkste inductoren van Vg synthese door het lichaamsvet; de Vg is uiteindelijk opgepikt door de ontwikkelingslanden oöcyt via Vg receptor gemedieerde endocytose53. VG is een groep polypeptiden gesynthetiseerd extraovarially, die essentieel is voor de ontwikkeling van het grote ei eidooier eiwit, vitellin54,55, en daarom is het belangrijk in de reproductie en veroudering56. VG heeft met succes in nematoden57 is het zwijgen opgelegd, alsmede in de honingbij (Apis mellifera) waar RNAi uitputting van Vg gemedieerde werd waargenomen in volwassenen en eieren22. RNAi gemedieerde posttranscriptional gen tot zwijgen brengen van Vg was getest omdat men dacht dat de uitputting zou leiden tot een waarneembare fenotypische effect zoals verminderde vruchtbaarheid en vruchtbaarheid, om te kunnen helpen bij het BMSB controle. De JHAMT-gen dat codeert voor de S-adenosyl-L-methionine (SAM)-afhankelijke JH zure O-methyltransferase, katalyseert de laatste stap van de JH biosynthese pathway58. In dit traject farnesyl pyrofosfaat (FPP) opeenvolgend van farnesol, omgevormd naar farnesoic zuur, gevolgd door conversie van methyl farnesoate naar JH door JHAMT. Dit traject is geconserveerd in insecten en andere geleedpotigen specifiek voor de metamorfose, een proces dat ontwikkelingsachterstand wordt gereguleerd door hormonen59,60,,61. In B. morisuggereren JHAMT genexpressie en de JH biosynthetic activiteit in de Corpora allata dat er sprake is van cruciaal belang voor de beëindiging van JH biosynthese58de transcriptionele onderdrukking van het JHAMT -gen. Daarom werden de genen JHAMT en Vg geselecteerd voor gerichte uitputting met behulp van RNAi. RNAi werd ook getest in citrusbomen voor controle van de ACS-landen en GWSS. Citrusbomen werden behandeld met dsRNA via root kletsnat, stammen van de kraan (trunk injecties), evenals naalden sprays met dsRNAs tegen insecten specifieke arginine kinase (AK) afschriften42,44. De actuele toepassing van dsRNA werd ontdekt over het bladerdak van citrusbomen, met vermelding van efficiënte levering via de planten vascular weefsels, en heeft geleid tot verhoogde sterfte in ACS-landen en GWSS41,42, 45.

In de huidige studie, hebben we een methode voor het bezorgen van natuurlijke dieet voor behandelingen zoals dsRNA vastgesteld. Deze nieuw ontwikkelde techniek werd later gebruikt voor de JHAMT en Vg silencing mRNA met behulp van gen-specifieke dsRNAs in BMSB nimfen als aangetoond eerder62. Deze nieuwe levering protocollen hier gedemonstreerd vervangt conventionele RNA levering systemen die gebruik maken van actuele sprays of microinjections. Groenten en fruit, stam kraan, bodem drenken en klei sorbents in kunnen worden gebruikt voor de levering van dsRNA, die is cruciaal voor de verdere ontwikkeling van biopesticide beheer op het gebied van ongediertebestrijding en pathogenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. BMSB fokken

  1. Achterzijde BMSB insecten per standaard lab praktijk en eerder beschreven63.
  2. ACS (D. citri) insecten op Citrus macrophylla in een kas (22 ° C) en het natuurlijke licht te verhogen. Gebruik van volwassen ACS, op ongeveer 5-7 dagen post eclosion.

2. selectie van Gene regio's en In Vitro synthese van dsRNA

  1. Selecteer specifieke genen aan BMSB van eerder gepubliceerde transcriptome profielen32.
  2. Zorgen dat de regio's van belang geselecteerd variëren tussen 200 tot 500 basenparen.
  3. Uitvoeren van polymerase-kettingreactie (PCR) met behulp van de voorwaarden die hieronder zijn beschreven voor het genereren van de fragmenten die zijn gekoppeld aan de geselecteerde gen van belang van genomic DNA. Zie tabel 1 voor de gen-specifieke oligonucleotides.
    1. PCR reactie: combineren In een tube van de PCR 0,25 mL, 5 µL van 10 X 4 µL van dNTP mengsel (elke 2.5 mM), PCR Buffer, 2 µL van DNA sjabloon (50 ng/µL), 2,5 µL van inleidingen 1 en 2 (10 µM), 0,25 µL van de polymerase van DNA (5 U/µL) , en DNase/RNase gratis water maximaal 50 µL.
    2. PCR voorwaarde: cyclus van de PCR-reactie om te versterken van de regio van belang bij 95 ° C gedurende 3 min, gevolgd door 30 cycli van 98 ° C voor 10 s, 55 ° C gedurende 30 s, 72° C gedurende 1 min. Incubate de reactie bij 72 ° C gedurende een extra 10 min. zuiveren de PCR reactie met behulp van een zuivering kit.
  4. De verkregen PCR fragmenten verder versterken met specifieke primers gene geflankeerd door de T7 RNA polymerase promotor volgorde (5'-GAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA-3') genoemd als eerdere62.
  5. LacZ gen als een negatieve controle (mock) gebruiken voor RNAi.
    Opmerking: LacZ is een gen dat β-galactosidase versterkt van genomic DNA Escherichiacoli codeert (de inleidingen gebruikt zijn vermeld in tabel 1).
  6. In vitro transcriptie zodanig dat deze dsRNA als beschreven eerdere62uitvoeren
  7. Ontbinden en resuspendeer de resulterende dsRNA in 150 µL DNase/RNase gratis water, meten van de concentratie en opslaan bij-80 ° C voor toekomstig gebruik.

3. levering van dsRNA met sperziebonen

  1. Selecteer vroeg 4th instar BMSB nimfen uitgebroed uit hetzelfde ei massa en verhongeren ze voor 24 h vóór dsRNA voeden.
  2. Selecteer slanke gecertificeerde biologische groene bonen (Phaseolus vulgaris L.) en wassen met 0,2% natriumhypochloriet-oplossing gedurende 5 minuten.
    Opmerking: Slanke groene bonen werden geselecteerd zodat de bonen kunnen gemakkelijk worden ondergebracht in de buizen 2 mL microcentrifuge.
  3. 3 keer wassen met ddH2O en laat lucht droog.
  4. Trim de sperziebonen vanaf het einde van de kelk tot een totale lengte van 7,5 cm met behulp van een schone scheermesje.
  5. Dompel de gewassen en bijgesneden groene bonen in een tube van het GLB-minder 2 mL microcentrifuge met 300 µL van bedieningsoplossing (een 1:10 verdunning van groene voedselkleuring (ingrediënten: Water, propyleenglycol, Fd & C geel 5, Fd & C Blue 1 en Propylparaben als conserveermiddel)).
  6. Make verdunningen van het in vitro gesynthetiseerd LacZ, JHAMT of Vg dsRNAs door verdunnen 5 µg of 20 µg in 300 µL van RNase/DNase gratis water aan opbrengst eindconcentraties van 0.017 µg/µL of 0.067 µg/µL, respectievelijk.
  7. Dompel de gewassen en bijgesneden groene bonen in een tube van het GLB-minder 2 mL microcentrifuge met 300 µL van dsRNA oplossing (uit stap 3.6).
  8. Wikkel en verzegel de randen van de buizen van de microcentrifuge omsluiten de ondergedompeld bonen te vermijden van verdamping van de dsRNA-oplossing en om te voorkomen dat de dieren de microcentrifuge buis.
  9. Plaats deze buizen op een rechte manier bij kamertemperatuur gedurende 3 uur om de dsRNA oplossing worden geladen tijdens de green bean door capillaire werking.
  10. Plaats deze buizen in schone kweekvat (polypropyleen). Plaats drie uitgehongerd 4th instar BMSB nimfen in de kweekvat.
  11. Omgaan met drie dieren per cultuur vaartuig elk met drie groene bonen met groene voedsel kleuren of dsRNA oplossing. Het handhaven van de insecten op 25 ° C en 72% relatieve vochtigheid, onder een 16 L: 8D fotoperiode in een broedmachine.
  12. Toestaan dat de insecten te voeden op de groene bonen (ondergedompeld en geabsorbeerd met dsRNA) voor 5 dagen maar vullen met vers diëten van dsRNA behandeling groene parels na 3 dagen.

4. real-time kwantitatieve (qPCR) analyse van gen expressie volgende RNAi gemedieerde Silencing in BMSB

  1. Het meten van het effect van RNAi op de niveaus van transcript expressie door qPCR.
  2. Isoleren van totaal RNA van de dsRNA behandelde dieren en de cDNA62synthetiseren.
  3. Instellen van de reacties van de qPCR met een real-time PCR-systeem en de inleidingen die zijn vermeld in tabel 1. Gebruik de volgende qPCR fietsen voorwaarde: 95 ° C gedurende 10 minuten gevolgd door 40 cycli van 95 ° C voor 15 s, 60 ° C gedurende 1 min, samen met dissociatie stap met inbegrip van 95 ° C gedurende 15 s, 60 ° C gedurende 1 min, 95 ° C gedurende 15 s , en 60 ° C gedurende 15 s.
  4. Bepalen van de qPCR-normen: gebruik de seriële verdunning van cDNA bereid uit totaal RNA als een norm voor de kwantificering van een normale dier is geïsoleerd.
  5. Gebruik BMSB 18s RNA als een interne standaard om te corrigeren voor verschillen in RNA terugwinning van weefsels32.

5. naalden Spray toepassing in grote ingemaakte citrusbomen en zaailingen

Opmerking: Planten van de citrus cultivar 'Carrizo' citrange (Citrus sinensis XPoncirus trifoliata, Rutaceae) werden onderhouden in een kas onder natuurlijke licht en temperatuur, geteeld in 1.2 L containers. De planten waren constant gesnoeid ter bevordering van de groei van nieuwe naalden shoots, genaamd 'flush'. ACS verkiest te voeden en oviposition op de nieuwe groei van citrus64.

  1. Selecteer planten of zaailingen en geef ze geen water voor 2-3 dagen voorafgaand aan het gebruiken om te laten de bodem uitdrogen te vochtig, maar niet helemaal droog.
  2. Met behulp van een hand pomp spray fles een 200 mL dsRNA oplossing (0,5 mg/mL) van toepassing op de lagere luifel (figuur 4A).
    Opmerking: Voorbereiding van de hierboven genoemde dsRNA oplossingen in DNase/RNase gratis water.
  3. Na het spuiten van toepassing, toestaan dat de toegepaste dsRNA-oplossing voor het volledig door de bladeren worden geabsorbeerd.
    Opmerking: Citrusbomen geabsorbeerd de toegepaste dsRNA, en vervolgens bladeren uit beide nieuwe groei of uit de takken die werden gedekt vóór toepassing, werden gehaald; de dsRNA was aantoonbaar met behulp van qPCR en toonde systemische beweging in de tree top luifel bladeren in 3-4 h44,45,46.
  4. Proef de nieuwe groei van eerder bekroond bomen na 25-40 dagen door het verzamelen van ongeveer 10 vanaf de toppen van vier takken vertrekt. Extract van de totale RNA en analyseren door omgekeerde transcriptie PCR (RT-PCR) en qPCR voor de aanwezigheid van de trekker van de toegepaste dsRNA gebruikend de inleidingen die in tabel 1 beschreven methoden46.
    Opmerking: De sample collectie, totaal RNA isolatie, RT-PCR, en qPCR werden uitgevoerd als eerder beschreven46.
  5. Op dezelfde manier spuiten topisch 10 mL dsRNA aan de lagere regio van een zaailing of kleine ingegoten boom gebladerte.
    Opmerking: Hemipteran insecten (ACS-landen en GWSS) kregen voeding toegang normaal bij 24 h, post behandelingen op nieuwe groei (bladeren) die had niet direct gespoten, of die weken later groeide, of hele planten. Dit produceerde insecten welke getest positief voor de dsRNA op 3, 6 en 10 dagen, post voeden.

6. bodem/Root kletsnat toepassing in grote of kleine ingegoten citrusbomen en zaailingen

  1. Selecteer planten of zaailingen en geef ze geen water voor 2-3 dagen voorafgaand aan het gebruiken om te laten de bodem uitdrogen te vochtig maar niet helemaal droog (Hiermee wordt luchtruim te houden van de vloeibare oplossing worden toegepast).
  2. Voeg 1 liter dsRNA oplossing (0,2 mg/mL) op de bodem van grote potplanten (ongeveer 2,5 m) en voeg 1 L water (chaser) na 1 h.
  3. 100 mL dsRNA oplossing (1,33 mg/mL) op de bodem van 1 m hoog ingegoten bomen in gedeeltelijk droge bodems van toepassing.
  4. Toepassing voor kleine zaailingen, 10 mL dsRNA oplossing (1 mg/mL) op de bodem van de kegels of de kale wortels (figuur 4B, C).
  5. Laat de planten die de dsRNA oplossing toegepast als een bodem kletsnat ontvangt te genieten voor 30 min. Dan gelden de enige behandeling gewoon water om te helpen absorptie door wortels (20 mL voor planten in de gele containers), of 100 mL als grotere plant potten > 1 gallon.
    Opmerking: Topisch toegepast dsRNA aan gebladerte resulteerde in detectie op meest distale uiteinden van de takken binnen 3-6 h post behandelingen, tonen van systemische beweging door bomen. Nieuwe groei takken testte positief voor dsRNA bij 60-90 dagen post behandelingen. Stekken vindt u in een dsRNA bioassay44voeden met insecten (ACS-landen en GWSS).

7. stam Tap (Tree Trunk injectie) toepassing in grote ingemaakte citrusbomen en zaailingen

  1. Selecteer citrus zaailingen, nieuw, of ongeveer 3,5 jaar oude installaties voor het injecteren met behulp van de stengel dsRNA kraan (trunk injecties) methode.
  2. Boor gaten in de citrus planten met behulp van een boor en een 10 mm boor, verzorgen maximaal 2 cm, of ongeveer de helft van de diameter van de stam.
  3. Wikkel het koperen puntje van elke injector 4 - 6 keer met een brede strook van 0.6 cm (¼ inch) van de sluiting van de film om te voorkomen lekkage in de buurt van de tip.
  4. Vul de boomstam injectoren met 6 mL (1,7 mg/mL) dsRNA oplossing verdund in DNase/RNase gratis water (aangeduid als gekleurde oplossing hier).
  5. Injecteren van de oplossing in de stam van de boom en laat de injector in de kofferbak voor 6-10 h dat de absorptie van de dsRNA-oplossing. Laat de insecten te voeden op de stekken uit behandelde bomen op 3, 10 en 30 dagen na de behandeling.
    Opmerking: De dsRNA geïnjecteerd met de kofferbak injectie methode persistent gemaakt in de bomen voor een periode van 30-60 dagen41,42,44. Validatie voor RNAi werd uitgevoerd door qPCR met behulp van de inleidingen die zijn vermeld in tabel 1.

8. dsRNA behandeld kleikorrels voor levering aan insecten door bodem

  1. Giet de klei absorberend in een conische buis van 50 mL tot de maatstreep aan 35 mL (ongeveer 30 g Klei absorberende) op de buis.
  2. Giet 20 mL verdund in DNase/RNase gratis water (100 µg/mL) dsRNA-oplossing in de buis te bevochtigen van alle de absorberend. Cap de conische buis, uiteinde van de buis om te helpen verwijderen van de lucht, en de buis van het GLB.
  3. Plaats de buis rechtop en laat het staan voor 1-2 min voor de klei-deeltjes op te vangen van de oplossing.
  4. Voeg genoeg dsRNA doordrenkte klei in de bodem mix te vullen een pot 1 gallon.
  5. Meng en draai de bodem met de hand om grondig Meng de dsRNA doordrenkte klei in de bodem.
  6. Gebruik deze bodem te verpotten zaailingen geselecteerd voor de dsRNA-behandeling.
  7. De bodem met gewoon water zonder dsRNA 200 mL water. Na 30 min tot 1 h, volgen met 100 mL van gewoon water. Zet de plant op een normale water geven programma na 24 uur.
  8. Test 4-6 blaadjes van de behandelde potplanten met klei sorbents en dsRNA elke maand na de behandeling voor dsRNA door het verzamelen van de meest apicale bladeren van nieuwe plantengroei.
    Opmerking: Planten of stekjes uit deze behandelde planten worden gevoed met insecten na 24 h behandeling post en geweest kundig voor levering RNAi voor maximaal een jaar aan insecten (niet-gepubliceerde gegevens).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Plantaardige gemedieerde dsRNA levering via voeding in BMSB 4th instar nimfen werd getest voor de ontwikkeling van moleculaire biopesticides met behulp van RNAi voor invasieve insectenplagen. BMSBs feed via hun naald-achtige stylets door een mechanisme bekend als lacerate en leegmaken, waardoor aanzienlijke schade aan gewassen. Slanke biologische sperziebonen, P. vulgaris L., werden gebruikt om te testen of nutriënten of dsRNA kon worden verstuurd in vivo naar BMSB via voeding3. Segmenten van de groene bonen werden ondergedompeld in DNase/RNase gratis water of een oplossing van water en groene voedselkleuring levering in BMSB (figuur 1A) testen. De groene voedselkleuring werd gebruikt als een visuele indicatie te imiteren dsRNA. Het vaatweefsel van de groene bonen waren verzadigd met groene voedselkleuring als gevolg van de stroom van groen gekleurde oplossing via het floëem door capillaire actie62. BMSB nimfen werden gezien op de segmenten van de groene bonen voeden door het invoegen van hun stylets in de vaatbundels weefsels van de groene bonen (figuur 1B). Groen gekleurde uitscheidingsproducten druppels werden waargenomen na dagen 2 en 3 in insecten die werden gevoed op bonen verzadigd met groene voedsel kleuren die aangeeft het geleverde materiaal was oraal ingenomen en doorgegeven via de darm voor de uitscheiding (Figuur 1 c, D ).

Vervolgens testten wij als belangrijke uitputting van gerichte genexpressie werd uitgevoerd met behulp van de green bean gemedieerde levering van BMSB specifieke dsRNA via ingestie in BMSB. Green bean segmenten werden ondergedompeld en geabsorbeerd een oplossing van 0.067 µg/µL (20 µg in 300 µL van DNase/RNase gratis water) of 0.017 µg/µL (5 µg in 300 µL van DNase/RNase gratis water) van in vitro gesynthetiseerd dsRNA specifiek voor BMSB JHAMT en Vg , respectievelijk. Groene bonen werden ook ondergedompeld in water alleen, 0.067 µg/µL of 0.017 µg/µL LacZ dsRNA (Mock) als respectieve besturingselementen. Transcript niveaus werden geëvalueerd aan de hand van qPCR die aangeeft dat uitdrukking van JHAMT en Vg mRNA was aanzienlijk verminderd in vivo door bijna 4,5 - en 2.2-fold, respectievelijk (figuur 2A, B). Derhalve betekenen de resultaten dat dsRNA kan worden geleverd via de vaatbundels weefsels van groene bonen voor het opwekken van succesvolle RNAi.

Een ander hemipteran pest, de harlekijn bug (HB) (Murgantia histrionica), die schade aan gewassen ook getest veroorzaakt werden als succesvolle levering van voedingsstoffen of dsRNA behandelingen kan worden geleverd met behulp van de groente cole gemedieerde levering. De 4th instar HB nimfen mochten waardplanten baby boerenkool (Brassica oleracea var. viridis) ondergedompeld in water of in een oplossing van water met groene voedselkleuring. Resultaten aangegeven dat HB gevoed en ingeslikt de groene voedselkleuring, die is gebleken uit hun groen gekleurde uitscheidingsproducten, ten opzichte van HB die ingenomen de groenten ondergedompeld in water, dat had duidelijk uitscheidingsproducten (Figuur 3).

Additionele technieken voor de tijdelijke levering van dsRNA van spuiten of wortel/bodem resultaten onderdompelen in dsRNA opname in alle van de plantaardige weefsels65,66. Spuitbare RNAi gebaseerde producten zijn in ontwikkeling en mogelijk beschikbaar spoedig in afwachting van goedkeuring. Levering van dsRNA in de velden met behulp van sprays of wortel kletsnat kan steun bij het beheer van invasieve insecten42,67. Full-size citrusbomen en zaailingen werden blootgesteld aan de dsRNA hetzij door naalden spray, hetzij door bodem of blote wortel drenken, respectievelijk (Figuur 4). Resultaten aangegeven dat dsRNAs geleverd door beide sprays of bodem/kale wortel kletsnat kon worden opgespoord in Citrus planten (2,5 m hoog) voor 7 weken post een eenmalige blootstelling 2 g dsRNA42. Aflevering en inname van psyllid dsRNA-AK (20 ng/µL) verhoogd sterfte van de psyllid met 30-45% (Figuur 4 d)42.

In vitro transcriptie dsRNA efficiënt kan worden afgeleverd bij polyfage insecten met behulp van stam kraan (trunk injecties) van gene specifieke dsRNA rechtstreeks in de vaatbundels weefsels van de plant, die kan worden verkregen door de insecten wanneer preying op dergelijke planten44 (Figuur 5). Voor citrus bomen die werden blootgesteld aan de dsRNA door kofferbak injecties, kon de dsRNA worden opgespoord in leeftijd citrus planten (ongeveer 1 meter hoog) voor 7 weken na een enkele blootstelling met behulp van 6 mL dsRNA 1,7 mg/mL in een oplossing van DNase/RNase gratis water (figuur 5A B). Floëem-voeding hemipteran insecten mochten vervolgens deze gastheerplanten dsRNA behandeld als waardplanten. Het wordt aangenomen dat de dsRNA met succes werd toegediend en bewoog zich door het vaatstelsel van de citrus planten voor inname door ACS, die sterfte bij toediening op dsRNA-AK42aangetoond.

Bioassays zijn ontwikkeld van 2008 tot 2012, gescreend over een breed scala aan potplanten en getoond om dsRNA levering op een wijze waarbij planten kunnen absorberen en translocate de dsRNA voor systemische dsRNA verspreiding41,42 . Één methode maakt gebruik van een absorberende onderdeel van klei met dsRNA adsorptie in de klei-matrix; Dit omvat een breed scala aan kleien, Fuller van aarde, zeoliet, en anderen, als goed als andere absorberende materialen, cellulose, agars, bioplastics, etc. Clay deeltjes stof gratis nucleïnezuur dragers die kunnen worden gebruikt zijn voor het leveren van actieve ingrediënten zoals dsRNA aan bodems voor plant opname- en uiteindelijk de levering aan insecten (Figuur 6). De complexe klei kan ook chemisch worden geconfigureerd om de dsRNA uit specifieke pH of Ionische voorwaarden vrij te geven. Clay methoden voor het afleveren van dsRNA in planten hebben aangetoond dat bieden dsRNA in ingemaakte citrus bomen en andere planten voor meer dan 14 maanden (gegevens niet worden weergegeven). Deze levering systeem kan worden gebruikt om te wijzigen van de eigenschappen van de plant, zoals de kleuren van de bloem, planthoogte (dwerggroei) of anderen. Op dit moment is het primaire gebruik van deze methode voor de ontwikkeling van een effectief insecten pest en de bestrijding van ziekteverwekkers (virus) of het beheer. De aanpak kan kosteneffectief voor kinderdagverblijven en huiseigenaren, en is een niet-transgene methode.

Figure 1
Figuur 1 . Levering van voedingsstoffen of dsRNA via groene bonen. (A) segmenten van slanke biologische groene bonen werden ondergedompeld en geabsorbeerd de oplossing in een tube voor het microcentrifuge van 2 mL met 300 µL van ddH2O alleen of ddH2O met groene voedselkleuring, gedurende 3 uur. Drie 4th instar BMSB nimfen waren uitgehongerd voor 24u en geplaatst in kweekvaten samen met 3 groene bonen per vaartuig. (B) BMSB als waardplanten segmenten van sperziebonen ondergedompeld in water door de piercing door de groene bonen te bereiken de voedingsstoffen met hun stylets. (C) dag 2 van de BMSB voeding bioassay, pijlen duiden uitscheidingsproducten. (D) dag 3; Verhoogde BMSB uitscheidingsproducten (aangeduid met pijl) waargenomen post inname van een oplossing van ddH2O en groen voedsel kleuren via groene bonen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 . Kwantitatieve analyse van de RT-PCR voor het meten van het niveau van de chat-kopie na RNAi-gemedieerde uitputting van JHAMT en Vg in BMSB. Totaal RNA van 3 individuele BMSB 4th instar nimfen die gevoed zijn met JHAMT (A) 20 µg (0.067 µg/µL) en Vg (B) 5 µg (0.017 µg/µL) dsRNAs in 300 µL van ddH2O door segmenten van sperziebonen geleverd, werd geïsoleerd en de transcript niveaus werden gemeten door qPCR. LacZ dsRNA (Mock) diende als een negatieve controle. BMSB 18s RNA werd gebruikt als een interne standaard om te corrigeren voor verschillen in RNA herstel van weefsels. Resultaten gerapporteerd zijn bij drie biologische replicatieonderzoeken en foutbalken geven SEM. Een one-way variantieanalyse (ANOVA) werd uitgevoerd om de statistische significantie van gegevens, p < 0,0001 te testen. Resultaten van Ghosh et al. gereproduceerd 62 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 . Mondelinge levering van behandeling in Harlequin bug (M. histrionica ) met behulp van baby boerenkool. Organische baby boerenkool waren met 0,2% natriumhypochloriet gewassen, geknipt en ondergedompeld in een tube voor het GLB-minder microcentrifuge van 2 mL met 300 µL van oplossing (A) DNase/RNase gratis ddH2O of (B) DNase/RNase gratis ddH2 O oplossing met groene voedselkleuring, voor een periode van 3 h. Drie 4e instar HB nimfen waren uitgehongerd gedurende 24 uur in kweekvaten geplaatst en kunnen deze boerenkool waardplanten voor 3 dagen. Witte pijlen geven aan uitscheidingsproducten waargenomen op het voeden van de post van de dag 3. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 . Naalden spray en wortel kletsnat toepassing in citrusbomen en zaailingen. De geselecteerde planten of zaailingen voorafgaande te gebruiken zijn niet gedrenkt voor 2-3 dagen om te laten de bodem uitdrogen te vochtig, maar niet helemaal droog. (A) de bomen werden eerst bijgevuld en 200 mL dsRNA oplossing (0,5 mg/mL) in DNase/RNase gratis water werd toegepast met de hand pomp spray fles op de lagere luifel. (B) dsRNA 100 mL oplossing (1 mg/mL) in DNase/RNase gratis water werd toegepast op de bodem van zaailingen in gedeeltelijk droge bodems. (C) 100 mL dsRNA oplossing (1 mg/mL) in DNase/RNase gratis water werd toegepast op de kale wortels van zaailingen voor ongeveer 3 h. (D) ACS voeden met zaailingen die had dsRNA geabsorbeerd door de kale wortels, toonde verhoogde sterfte van de ACS. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 . Citrus zaailing tree trunk injectie. Citrus zaailingen ongeveer 1 meter hoog waren geïnjecteerd met 1,7 mg/mL dsRNA. (A) Boor gaten in citrus zaailingen met behulp van een 10 mm diameter boor de injector invoegen in de stengel van de plant. De blootgestelde koperen tip voor elke injector was gewikkeld met een brede strook van 0.6 cm (¼ inch) voor het afdichten van film ter voorkoming van lekkage. (B) injectoren gevuld met 6 mL gekleurde oplossing werden toegepast op de stengel ("trunk") van de zaailingen. Injectoren bleven in plaats voor ongeveer 6-10 h voor volledige opname van de oplossing. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6 . Klei bodem amendement levering van dsRNA in planten door bodem. Een nieuwe lijn van het leveren van materiaal: klei, die is een stof vrije nucleïnezuur drager voor gebruik in het leveren van actieve ingrediënten zoals dsRNA aan bodems voor opname in planten en uiteindelijk in insecten. (A) ongebakken klei en (B) gebakken klei met tolerantie/waterretentie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Potentiële H. Kizil Irmak doelgenen
Toetreding Grootte Gene naam/homologie
XP_014293026.1 491 Vitellogenin-A1-achtige (Vg) (Mogelijk isoforms: vitellogenin-2-achtige isovorm X1 XP_014291483.1; vitellogenin-2-achtige isovorm X2 XP_014291484.1).
XP_014290953.1 545 Juvenile hormoon acid-O-methyltransferase-achtige (JHAMT) (Mogelijk homolog: juveniele hormoon acid-O-methyltransferase XP_014283772.1).
Inleidingen
PCR
Gene naam/homologie De naam van de primer Volgorde
VG BMSB Vitellog P2 F CAATTTGATCCACCGACTGTT
VG BMSB Vitellog P2 R CCGCATGAATCTTACTCTGGA
JHAMT BMSB JH P1 F GGATGCTTATGAATAATCCAG
JHAMT BMSB JH P1 R GTATAGGATTGCCATTTTGG
T7 PCR
VG T7 BMSB Vitellog P2 4263 F GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCAAAGTTGGAAGGGAATGA
VG T7 BMSB Vitellog P2 4753 R GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCGCATGAATCTTACTCTGGA
JHAMT BMSB JH T7 P1 F GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGATGCTTATGAATAATCCAG
JHAMT BMSB JH T7 P1 R GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTATAGGATTGCCATTTTGG
LacZ T7 LacZ RNAi F GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGATGAAAGCTGGCTACAGGA
LacZ T7 LacZ RNAi R GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCAGGCTTCTGCTTCAAT
AK dsAK-F TAATACGACTCACTATAGGGAGTGGCATTCTTGTATGGCGTA
AK dsAK-R TAATACGACTCACTATAGGGAGGCCTGCAAGAATCTGTCTCC
AK dsAK 50-F TAATACGACTCACTATAGGGAGTGGCATTCTTGTATGGCGTA
AK dsAK 50-R TAATACGACTCACTATAGGGAGTGAAGCCCTTGTGGTAGTC
AK dsAK 30-F TAATACGACTCACTATAGGGAGACCCGGACTCTGGAGTAGG
AK dsAK 30-R TAATACGACTCACTATAGGGAGGCCTGCAAGAATCTGTCTCC
GFP dsGFP-F TAATACGACTCACTATAGGGAGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTT
GFP dsGFP-R TAATACGACTCACTATAGGGAGGTAATGGTTGTCTGGTAAAAGGA
qPCR
VG RT Vitellog P2 F TTGATAGTTGTTTGGATTTTGAAGGT
VG RT Vitellog P2 R TCTTACTTGATCAGCGCTCAGAA
JHAMT BMSB JH RT P1 F AGGAAAACCCAAAATGGCAAT
JHAMT BMSB JH RT P1 R ATGTATTCTTCTTTTGGATCTTTTCTTGAG
18S BMSB 18S F3 ATGCCCCCGCCTGTCCTTATT
18S BMSB 18S R3 TGAAAGCAGCCTGAATAGTGG
GFP GFP-F GGTAAAAGGACAGGGCCATC
GFP GFP-R TCAAGGAGGACGGAAACATC
AK AK quant-F CGGACTTGAGGGAGAACTGA
AK AK quant-R GTGGTAGATACCGCGACCAG
a-Tub a-Tub-F GCGTCTCTTCGGTTTGACGG
a-Tub a-Tub-R CACTTCACCATCTGGTTGGC

Tabel 1. Oligonucleotide sequenties voor RNAi. De genen en oligonucleotides voor het genereren van PCR fragmenten dsRNA en qPCR inleidingen gebruikt voor het analyseren van de niveaus van het afschrift vermeld zijn.

Aanvullende Video 1: Agars en gels als sorbents voor levering en aanhoudende dsRNA. Synthetische of natuurlijke agars en gels met dsRNA-oplossing die kan worden gebruikt als aas of diëten voor verschillende geleedpotigen gehydrateerd. Klik hier om deze video te downloaden

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

RNAi heeft bewezen te zijn een belangrijk instrument voor het verkennen van biologische genfunctie en regelgeving, met een groot potentieel om te worden gebruikt voor beheer van insectenplagen19,68,69,70, 71. het ontwerp en de selectie van een geschikte gene(s) voor silencing in een bepaald insect soorten en de methode van levering van de bijbehorende dsRNA(s) aan het insect zijn beide van groot belang. De optimale methode voor het leveren van dsRNA in een insect moet empirisch, samen met de selectie van de relatieve dosis voor levering, bepaald als bepaalde methoden voordelen en andere beperkingen bieden kunnen. Voor de ontwikkeling van een moleculaire biopesticide die uiteindelijk mogelijk geschikt voor milieu release, is een haalbaar, efficiënte en voordelige leveringsmethode vereist. Bijvoorbeeld blijkt topisch toegepast dsRNA effectief voor dsRNA levering voor insectenbestrijding voor citrus en wijnstokken42,44. Innovatieve strategieën zoals gebruik van lokaas, sacharose solutions, gist of bacteriële dsRNA productie voor directe inslikken, actuele toepassing van dsRNA op planten, of de productie van specifieke dsRNAs door gemodificeerde transgene planten, hebben de ontwikkeling van geavanceerde effectieve RNAi gebaseerde controles19,72.

Een goed voorbeeld is hier gedemonstreerd met het gebruik van groene bonen leveren dsRNA (Figuur 1 en Figuur 2) ontworpen om specifiek effect en verminderen van een insect pest van mondiaal belang. De nieuw ontwikkelde groente gemedieerde dsRNA levering protocol met behulp van segmenten van de groene bonen ondergedompeld en verzadigd met dsRNA hanteert voor het effectief doelgenen specifieke voor larvale ontwikkeling in BMSB. Groene bonen zijn een van de vele groenten die zijn verslonden door BMSB en dus deze werden gebruikt als een medium om te leveren dsRNA. Andere dragers van dsRNA levering waren getest (gegevens niet worden weergegeven), maar waren niet succesvol in het leveren van voeding tot de BMSB eventueel als gevolg van verschillen in vasculaire textuur. Dus, we gewend segmenten van groene bonen leveren in vitro gesynthetiseerd dsRNA aan de nimfen van de BMSB. De nucleïnezuren geleverd door middel van een plant of het plantaardige gemedieerde techniek mogelijk potentieel voor het opwekken van RNAi in het insect van keuze zoals opgemerkt hier met uitputting van JHAMT en Vg genen in BMSB (Figuur 2)62.

Dit plantaardige gemedieerde dsRNA-levering-protocol met succes is gebruikt voor het opwekken van RNAi niet alleen in BMSB, maar ook in HB met behulp van boerenkool (Figuur 3), al levering strategieën en methoden moeten worden geoptimaliseerd voor elk gen en insect. Vandaar, is het aanbevolen dat verschillende methoden worden getest voor levering ook te richten op meerdere genen van belang individueel of door stapelen ten minste twee dsRNAs met het oog op een beter fenotypische doordringendheid. Verschillende methoden werden samengevat voor dsRNA levering aan insecten en insect cellen, met inbegrip van voeding13,22, inweken73,,74, microinjection75en andere technieken76 gebruikt voor dsRNA opname voor het opwekken van systemische RNAi. Nieuwere methoden voor mondelinge levering van dsRNA ertoe RNAi bij andere insecten door inname op behandelde niet-transgene planten ook zijn onderzocht (Figuur 4 Figuur 5en Figuur 6). Citrusbomen hebben aangetoond dat absorberen van dsRNAs ofwel door wortels, het gevolg van de kraan (trunk injecties) of naalden sprays42,44. Eerder, citrusbomen en volwassen wijnstokken zijn behandeld met insectenwerende specifieke dsRNA overeenkomt met het AK-gen in zowel de ACS-landen en de GWSS. Deze behandelde planten veroorzaakten een toename in mortaliteit voor zowel de ACS-landen en de GWSS voor tot verschillende lengtes van tijd41,45. Deze resultaten tonen samen aan dat dsRNA expressie van specifieke genen in de bestudeerde insecten kan belemmeren.

Uitdagingen die van invloed zijn op succesvol monddood maken van de genexpressie omvatten unieke soorten dsRNA nucleasen (dsRNases) uitgedrukt voornamelijk in het weefsel van de darm van insecten en speeksel afscheidingen of de pH van de darm, die wellicht verantwoordelijk voor afbraak van dsRNA47 7877, ,. Echter om te overwinnen dergelijke afbraak, systemische RNAi kan worden geïnduceerd efficiënt bij insecten door gebruik te maken van de hogere concentraties van dsRNA en/of met behulp van PEG in het dieet voor mondelinge levering van gen-specifieke dsRNA te overwinnen dergelijke afbraak62, 79. levering en opname van dsRNA kunnen ook worden gestabiliseerd met de hulp van vervoerder moleculen, zoals nanodeeltjes80 zoals Chitosan48, liposomen zoals Lipofectamine 2000 en Metafectene76, polyethyleenglycol79, klei nanosheets81, en koolstof quantum dot50. Onderzoek wordt gewerkt aan het verbeteren van de effectieve levering van dsRNA met agar en gel stukjes toegediend met de specifieke dsRNA gen (gegevens niet weergegeven, Zie aanvullende Video 4). Deze techniek kan worden gebruikt voor levering van een effectieve dosis van dsRNA aan mieren die de dsRNA hars of agar naar het nest als voedsel toegediend mogen meenemen.

Naast stabiliteit van dsRNA is op lange termijn persistentie van dsRNA in plantaardige weefsels van belang, vooral voor landbouwgewassen. dsRNA gedistribueerd via vascular weefsels van planten, vruchten of groenten kan zich ophopen in de xyleem en floëem met verminderde enzymactiviteit voorafgaand aan wordt ingenomen door insecten ertoe het RNAi-mechanisme. Het kan nodig zijn voor bepaalde applicaties hebben dsRNA aanhouden voor een korte periode, zoals voor 6 dagen in groene bonen of langer, 36 h in de bodem62,82 zodat de accumulatie van nucleic zuren in het milieu onwaarschijnlijk wordt. Echter, Neena et al. aangetoond dat nanosheets grote dsRNAs kunnen tegen voortijdige degradatie als beschermen zou evenals bemiddelen hun aanhoudende vrijlating op blad oppervlakken gedurende een periode van ten minste 30 dagen81.

Over het geheel genomen kunnen de dsRNA levering strategieën hier besproken worden gebruikt om het insect specifieke genen voor gewasbescherming zwijgen. Levering van dsRNA te planten door middel van irrigatiewater, wortel kletsnat of trunk injectie zou een effectieve strategie voor ongediertebestrijding insecten, zoals wortel feeders, waarvoor geen enkele efficiënte controle methode die momenteel beschikbaar is zijn. Levering van dsRNA met behulp van een vervoerder of stabiliseren medium zoals klei of agar kan direct worden toegevoegd aan de bodem voor opname door planten. Een van de belangrijkste oorzaken voor de langzame vooruitgang bij de ontwikkeling van RNAi gemedieerde moleculaire biopesticides is het gebrek aan efficiënte mondelinge levering technieken om efficiënte RNAi en stabiliteit onder milieuomstandigheden83. De mondelinge levering methoden hier geschetste kunnen in de toekomst worden gebruikt voor het leveren van nucleïnezuur gemedieerde gene silencing behandelingen te planten sap voederen, alsmede het kauwen van insecten voor insecten schade in de wereldwijde voedselproductie beperken en de ontwikkeling van duurzame ecologische pest beheer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs erkennen dankbaar Donald Weber en Megan Herlihy (USDA, ARS Beltsville, MD) voor het verstrekken van BMSB en HB voor experimenten en onderhouden van de kolonies; en Maria T. Gonzalez, Salvador P. Lopez (USDA, ARS, Fort Pierce, FL) en Jackie L. Metz (Universiteit van Florida, Fort Pierce, FL) voor onderhoud van de kolonie, bereiding van de monsters en analyses.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BMSB (H. halys) insects  USDA
ACP (D. citri) insects  USDA
organic green beans N/A
Citrus plants USDA
sodium hypochlorite solution J.T. Baker
green food coloring  McCormick & Co., Inc
Thermo Forma chambers  Thermo Fisher Scientific
Magenta vessel (Culture) Sigma
Primers  IDT DNA
SensiMix SYBR Bioline
qPCR ABI 7500 Applied Biosystems 
Spray bottle N/A
Parafilm American Can Company
TaKaRa Ex Taq Clontech
QIAquick Qiagen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoebeke, E. R., Carter, M. E. Halyomorpha halys (Stǻl)(Heteroptera: Pentatomidae): a polyphagous plant pest from Asia newly detected in North America. , (2003).
  2. Leskey, T. C., Hamilton, G. C., et al. Pest Status of the Brown Marmorated Stink Bug, Halyomorpha Halys in the USA. Outlooks on Pest Management. 23 (5), 218-226 (2012).
  3. Peiffer, M., Felton, G. W. Insights into the Saliva of the Brown Marmorated Stink Bug Halyomorpha halys (Hemiptera: Pentatomidae). PloS one. 9 (2), e88483 (2014).
  4. Anderson, B. E., Miller, J. J., Adams, D. R. Irritant contact dermatitis to the brown marmorated stink bug, Halyomorpha halys. Dermatitis : contact, atopic, occupational, drug. 23 (4), 170-172 (2012).
  5. Mertz, T. L., Jacobs, S. B., Craig, T. J., Ishmael, F. T. The brown marmorated stinkbug as a new aeroallergen. The Journal of allergy and clinical immunology. 130 (4), 999-1001 (2012).
  6. McClean, A. P. D., Schwarz, R. E. Greening or blotchy-mottle disease of citrus. Phytophylactica. 2 (3), 177-194 (2012).
  7. Bové, J. M. Huanglongbing: a destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
  8. Kuhar, T., Morrison, R., Leskey, T., Aigner, J. Integrated pest management for brown marmorated stink bug in vegetables. , (2016).
  9. Tiwari, S., Mann, R. S., Rogers, M. E., Stelinski, L. L. Insecticide resistance in field populations of Asian citrus psyllid in Florida. Pest management science. 67 (10), 1258-1268 (2011).
  10. Baum, J. A., Bogaert, T., et al. Control of coleopteran insect pests through RNA interference. Nature Biotechnology. 25 (11), 1322-1326 (2007).
  11. Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418 (6894), 244-251 (2002).
  12. Mello, C. C., Conte, D. Revealing the world of RNA interference. Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).
  13. Macrae, I. J., Zhou, K., et al. Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer. Science(New York, N.Y.). 311 (5758), 195-198 (2006).
  14. Bernstein, E., Caudy, A. A., Hammond, S. M., Hannon, G. J. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature. 409 (6818), 363-366 (2001).
  15. Ketting, R. F., Fischer, S. E., Bernstein, E., Sijen, T., Hannon, G. J., Plasterk, R. H. Dicer functions in RNA interference and in synthesis of small RNA involved in developmental timing in C. elegans. Genes & development. 15 (20), 2654-2659 (2001).
  16. Agrawal, N., Dasaradhi, P. V. N., Mohmmed, A., Malhotra, P., Bhatnagar, R. K., Mukherjee, S. K. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 67 (4), 657-685 (2003).
  17. Martinez, J., Patkaniowska, A., Urlaub, H., Lührmann, R., Tuschl, T. Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi. Cell. 110 (5), 563-574 (2002).
  18. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  19. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395 (6705), 854 (1998).
  20. Clemens, J. C., Worby, C. A., et al. Use of double-stranded RNA interference in Drosophila cell lines to dissect signal transduction pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6499-6503 (2000).
  21. Saleh, M. C., van Rij, R. P., et al. The endocytic pathway mediates cell entry of dsRNA to induce RNAi silencing. Nature cell biology. 8 (8), 793-802 (2006).
  22. Amdam, G. V., Simões, Z. L. P., Guidugli, K. R., Norberg, K., Omholt, S. W. Disruption of vitellogenin gene function in adult honeybees by intra-abdominal injection of double-stranded RNA. BMC biotechnology. 3, 1 (2003).
  23. Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides. Insect biochemistry and molecular biology. 39 (11), 824-832 (2009).
  24. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. Journal of Insect Physiology. 56 (3), 227-235 (2010).
  25. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  26. Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).
  27. Gatehouse, H. S., Gatehouse, L. N., Malone, L. A. Amylase activity in honey bee hypopharyngeal glands reduced by RNA interference. Journal of Apicultural. , (2004).
  28. Jaubert-Possamai, S., Le Trionnaire, G., Bonhomme, J., Christophides, G. K., Rispe, C., Tagu, D. Gene knockdown by RNAi in the pea aphid Acyrthosiphon pisum. BMC biotechnology. 7, 63 (2007).
  29. Martín, D., Maestro, O., Cruz, J., Mané-Padrós, D., Bellés, X. RNAi studies reveal a conserved role for RXR in molting in the cockroach Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 52 (4), 410-416 (2006).
  30. Bansal, R., Mittapelly, P., Chen, Y., Mamidala, P., Zhao, C., Michel, A. Quantitative RT-PCR Gene Evaluation and RNA Interference in the Brown Marmorated Stink Bug. PloS one. 11 (5), e0152730 (2016).
  31. Terenius, O., Papanicolaou, A., et al. RNA interference in Lepidoptera: an overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. Journal of Insect Physiology. 57 (2), 231-245 (2011).
  32. Sparks, M. E., Shelby, K. S., Kuhar, D., Gundersen-Rindal, D. E. Transcriptome of the Invasive Brown Marmorated Stink Bug, Halyomorpha halys (Stål) (Heteroptera: Pentatomidae). PloS one. 9 (11), e111646 (2014).
  33. Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science (New York, N.Y.). 282 (5388), 430-431 (1998).
  34. Baum, J. A., Roberts, J. K. Chapter Five - Progress Towards RNAi-Mediated Insect Pest Management. Insect Midgut and Insecticidal Proteins. 47, 249-295 (2014).
  35. Walshe, D. P., Lehane, S. M., Lehane, M. J., Haines, L. R. Prolonged gene knockdown in the tsetse fly Glossina by feeding double stranded RNA. Insect Molecular Biology. 18 (1), 11-19 (2009).
  36. Turner, C. T., Davy, M. W., MacDiarmid, R. M., Plummer, K. M., Birch, N. P., Newcomb, R. D. RNA interference in the light brown apple moth, Epiphyas postvittana (Walker) induced by double-stranded RNA feeding. Insect Molecular Biology. 15 (3), 383-391 (2006).
  37. Bautista, M. A. M., Miyata, T., Miura, K., Tanaka, T. RNA interference-mediated knockdown of a cytochrome P450, CYP6BG1, from the diamondback moth, Plutella xylostella, reduces larval resistance to permethrin. Insect biochemistry and molecular biology. 39 (1), 38-46 (2009).
  38. Maori, E., Paldi, N., et al. IAPV, a bee-affecting virus associated with Colony Collapse Disorder can be silenced by dsRNA ingestion. Insect Molecular Biology. 18 (1), 55-60 (2009).
  39. Hunter, W., Ellis, J., Hayes, J., Westervelt, D., Glick, E. Large-scale field application of RNAi technology reducing Israeli acute paralysis virus disease in honey bees (Apis mellifera, Hymenoptera: Apidae). PLoS Pathogens. 6 (12), e1001160 (2010).
  40. Christiaens, O., Smagghe, G. The challenge of RNAi-mediated control of hemipterans. Current Opinion in Insect Science. 6, 15-21 (2014).
  41. Hunter, W. B., Hail, D., Tipping, C., Paldi, N. RNA interference to reduce sharpshooters, the glassy-winged sharpshooter, and the Asian citrus psyllid. Symposium. , 24-27 (2010).
  42. Hunter, W. B., Glick, E., Paldi, N., Bextine, B. R. Advances in RNA interference: dsRNA treatment in trees and grapevines for insect pest suppression. Southwestern Entomologist. , (2012).
  43. Hail, D. A., Dowd, S., Hunter, W. H., Bextine, B. R. Investigating the transcriptome of the potato psyllid (Bactericera cockerelli): toward an RNAi based management strategy. Proceed. 10th Annual Zebra Chip Reporting Session, San Antonio TX, , 183-186 (2010).
  44. de Andrade, E. C., Hunter, W. B. RNA Interference-Natural Gene-Based Technology for Highly Specific Pest Control (HiSPeC). RNA INTERFERENCE. , (2016).
  45. Taning, C. N. T., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. Asian Citrus Psyllid RNAi Pathway - RNAi evidence. Scientific reports. 6, 38082 (2016).
  46. Andrade, E. C., Hunter, W. B. RNAi feeding bioassay: development of a non-transgenic approach to control Asian citrus psyllid and other hemipterans. Entomologia Experimentalis et Applicata. 162 (3), 389-396 (2017).
  47. Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. RNAi Efficiency, Systemic Properties, and Novel Delivery Methods for Pest Insect Control: What We Know So Far. Frontiers in physiology. 7, 553 (2016).
  48. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect Molecular Biology. 19 (5), 683-693 (2010).
  49. Li-Byarlay, H., Li, Y., et al. RNA interference knockdown of DNA methyl-transferase 3 affects gene alternative splicing in the honey bee. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12750-12755 (2013).
  50. Das, S., Debnath, N., Cui, Y., Unrine, J., Palli, S. R. Chitosan, Carbon Quantum Dot, and Silica Nanoparticle Mediated dsRNA Delivery for Gene Silencing in Aedes aegypti: A Comparative Analysis. ACS applied materials & interfaces. 7 (35), 19530-19535 (2015).
  51. Nimesh, S. Recent patents in siRNA delivery employing nanoparticles as delivery vectors. Recent patents on DNA & gene sequences. 6 (2), 91-97 (2012).
  52. Draz, M. S., Fang, B. A., et al. Nanoparticle-mediated systemic delivery of siRNA for treatment of cancers and viral infections. Theranostics. 4 (9), 872-892 (2014).
  53. Swevers, L., Raikhel, A. S., Sappington, T. W. Vitellogenesis and post-vitellogenic maturation of the insect ovarian follicle. Comprehensive. , (2005).
  54. Tufail, M., Takeda, M. Molecular characteristics of insect vitellogenins. Journal of Insect Physiology. 54 (12), 1447-1458 (2008).
  55. Hagedorn, H. H., Kunkel, J. G. Vitellogenin and vitellin in insects. Annual review of entomology. , (1979).
  56. Brandt, B. W., Zwaan, B. J., Beekman, M. Shuttling between species for pathways of lifespan regulation: a central role for the vitellogenin gene family? Bioessays. , (2005).
  57. Murphy, C. T., McCarroll, S. A., et al. Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans. Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).
  58. Shinoda, T., Itoyama, K. Juvenile hormone acid methyltransferase: a key regulatory enzyme for insect metamorphosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 11986-11991 (2003).
  59. Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual review of entomology. 55, 111-128 (2010).
  60. Nouzova, M., Edwards, M. J., Mayoral, J. G., Noriega, F. G. A coordinated expression of biosynthetic enzymes controls the flux of juvenile hormone precursors in the corpora allata of mosquitoes. Insect biochemistry and molecular biology. 41 (9), 660-669 (2011).
  61. Huang, J., Marchal, E., Hult, E. F., Tobe, S. S. Characterization of the juvenile hormone pathway in the viviparous cockroach, Diploptera punctata. PloS one. 10 (2), e0117291 (2015).
  62. Ghosh, S. K. B., Hunter, W. B., Park, A. L., Gundersen-Rindal, D. E. Double strand RNA delivery system for plant-sap-feeding insects. PloS one. 12 (2), e0171861 (2017).
  63. Khrimian, A., Zhang, A., et al. Discovery of the aggregation pheromone of the brown marmorated stink bug (Halyomorpha halys) through the creation of stereoisomeric libraries of 1-bisabolen-3-ols. Journal of natural products. 77 (7), 1708-1717 (2014).
  64. Hall, D. G., Richardson, M. L., El-Desouky, A., Halbert, S. E. Asian citrus psyllid, Diaphorina citri, vector of citrus huanglongbing disease. Entomologia Experimentalis et Applicata. 146 (2), 207-223 (2012).
  65. Murphy, K. A., Tabuloc, C. A., Cervantes, K. R., Chiu, J. C. Ingestion of genetically modified yeast symbiont reduces fitness of an insect pest via RNA interference. Scientific reports. 6, 22587 (2016).
  66. San Miguel,, K,, Scott, J. G. The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide. Pest management science. 72 (4), 801-809 (2016).
  67. Li, H., Guan, R., Guo, H., Miao, X. New insights into an RNAi approach for plant defence against piercing-sucking and stem-borer insect pests. Plant, cell & environment. 38 (11), 2277-2285 (2015).
  68. Hull, D., Timmons, L. Methods for delivery of double-stranded RNA into Caenorhabditis elegans. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 265, 23-58 (2004).
  69. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  70. Burand, J. P., Hunter, W. B. RNAi: future in insect management. Journal of Invertebrate Pathology. 112 Suppl, S68-S74 (2013).
  71. Rodrigues, T. B., Figueira, A. Management of Insect Pest by RNAi-A New Tool for Crop Protection. , (2016).
  72. Baumann, A. M. T., Bakkers, M. J. G., et al. 9-O-Acetylation of sialic acids is catalysed by CASD1 via a covalent acetyl-enzyme intermediate. Nature communications. 6, 7673 (2015).
  73. Araujo, R. N., Santos, A., Pinto, F. S., Gontijo, N. F., Lehane, M. J., Pereira, M. H. RNA interference of the salivary gland nitrophorin 2 in the triatomine bug Rhodnius prolixus (Hemiptera: Reduviidae) by dsRNA ingestion or injection. Insect biochemistry and molecular biology. 36 (9), 683-693 (2006).
  74. Wuriyanghan, H., Rosa, C., Falk, B. W. Oral Delivery of Double-Stranded RNAs and siRNAs Induces RNAi Effects in the Potato/Tomato Psyllid, Bactericerca cockerelli. PloS one. 6 (11), e27736 (2011).
  75. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods (San Diego, Calif). 30 (4), 313-321 (2003).
  76. Yu, N., Christiaens, O., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions). Insect Science. , (2012).
  77. Allen, M. L., Walker, W. B. Saliva of Lygus lineolaris digests double stranded ribonucleic acids. Journal of Insect Physiology. 58 (3), 391-396 (2012).
  78. Wynant, N., Santos, D., Verdonck, R., Spit, J., Van Wielendaele, P., Vanden Broeck, J. Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria. Insect biochemistry and molecular biology. 46, 1-8 (2014).
  79. Ghosh, S. K. B., Gundersen-Rindal, D. E. Double strand RNA-mediated RNA interference through feeding in larval gypsy moth, Lymantria dispar (Lepidoptera: Erebidae). European Journal of Entomology. 114, 170-178 (2017).
  80. Baigude, H., Rana, T. M. Delivery of therapeutic RNAi by nanovehicles. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 10 (15), 2449-2454 (2009).
  81. Mitter, N., Worrall, E. A., et al. Clay nanosheets for topical delivery of RNAi for sustained protection against plant viruses. Nature plants. 3, 16207 (2017).
  82. Dubelman, S., Fischer, J., et al. Environmental fate of double-stranded RNA in agricultural soils. PloS one. 9 (3), e93155 (2014).
  83. Kola, V. S. R., Renuka, P., Madhav, M. S., Mangrauthia, S. K. Key enzymes and proteins of crop insects as candidate for RNAi based gene silencing. Frontiers in physiology. 6, 119 (2015).

Tags

Milieuwetenschappen kwestie 135 levering bruin marmorated hilare Aziatische citrus psyllid RNA-interferentie inslikken Hemiptera
Double-stranded RNA orale afleveringsmethoden voor het opwekken van RNA-interferentie in het floëem en Hemipteran insecten Plant-sap-voeding
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ghosh, S. K. B., Hunter, W. B.,… More

Ghosh, S. K. B., Hunter, W. B., Park, A. L., Gundersen-Rindal, D. E. Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects. J. Vis. Exp. (135), e57390, doi:10.3791/57390 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter