هذا البروتوكول وصف أسلوب إعداد خلايا الحرس ستوماتال المخصب مفيد للدراسات البيولوجية الفسيولوجية وغيرها.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الشريط الثغور-التقشير: طريقة محسنة لإعداد نموذج خلية الحرس
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
دراسة خلايا الحرس ضروري لمعرفة المساهمات المحددة لهذا النوع من الخلية للدالة الشاملة للنباتات. ومع ذلك، غالباً ما يصعب عزل وهكذا دراستها غالباً ما يوفر تحديا.
تحدد هذه الدراسة أسلوب إثراء stomatal حارس خلية. ويستخدم البروتوكول اﻻسكتلندي لعزل خلايا الحرس واستخراج البروتينات من الخلايا. هذا الأسلوب يحسن السلامة والعائد لحراسة الخلية أثناء العزل وتوفر نموذج موثوق بها لدراسة عمليات إرسال الإشارات في الخلية، وكيفية الربط بين حركة ستوماتال تعمل. في هذا الأسلوب، أوراق النبات تم تقسيمه بين جزأين من الشريط ومقشرة بعيداً لإزالة الجانب أباكسيال. تم تطبيق هذا البروتوكول على أنسجة أوراق نبات لعزل خلايا الحرس. الخلايا تعامل مع فلوريسسين اسيتات (FDA) لتحديد جدوى وحمض التسقيط (ABA) لتقييم حركة الثغور في الاستجابة لرابطة المحامين الأمريكية. وفي الختام، يثبت هذا البروتوكول مفيدة لإعداد خلايا الحرس ستوماتال المخصب وعزل البروتينات. الحصول على نوعية الخلايا والبروتينات هنا تمكين الفسيولوجية والدراسات البيولوجية الأخرى.
المقدمة
الثغور دوراً هاما في علم وظائف الأعضاء واللياقة البدنية للنباتات عموما. هذه الهياكل محطة صغيرة محددة يتم تشكيلها من قبل اثنين من خلايا البشرة المتخصصة المعروفة باسم خلايا الحرس وتم العثور على الأكثر وفرة على سطح الأوراق أباكسيال. الثغور ضرورية لتبادل الغازات بين النبات والغلاف الجوي، فضلا عن السيطرة على فقدان الماء عن طريق النتح. تنظيم خلايا الحرس الفتحة الثغور من خلال التكامل الخارجي مختلفة (مثلاً، والضوء، والرطوبة، والممرض الاتصال، مستويات ثاني أكسيد الكربون) والداخلية (على سبيل المثال.، الهرمونات الذاتية) المحفزات1،2. في السنوات العشرين الماضية، أصبح هذا النوع خلية نظام نموذجي لدراسة الخلي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-زراعة النباتات
- تنبت البذور في بوتينغ الخليط. تنمو النباتات في حجرة نمو مع شدة ضوء 140 µmol الفوتونات م2 ق 1 وكبيرة ح 8 الضوء على 22 درجة مئوية و 16 ح الظلام عند 18 درجة مئوية لمدة أسبوعين.
- زرع شتلات أحجام مماثلة على حدة في القطر الأواني 4 "التي تحتوي على التربة وتنمو لمدة 3 أسابيع في نفس الظروف إضافية الموضحة في الخطوة 1، 1.
ملاحظة: المياه والنباتات بماء الصنبور مرتين في أسبوع للحفاظ على رطوبة التربة.
2-إعداد الثغور مخصب
- إزالة أوراق النباتات التمويل ألف- 5-الأسبوع القديمة الفردية مع مشرط.
- إرفاق كل ورقة إلى قطعتين من الشريط سكوتش واضحة، مع التمسك بالجانب (السفل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
صورة تمثيلية لنبات الحرس الخلايا قبل وبعد الهضم mesophyll وخلايا البشرة ويرد في الشكل 1. ويمكن ملاحظة صلاحية خلية الحرس قبل وبعد إزالة mesophyll وخلايا البشرة باستخدام إدارة الأغذية والعقاقير لقياس النشاط الأنزيمي وسلامة غشاء الخلية (الشكل 1 باء و دال 1). ويبين الشكل 2 حركة ستوماتال من نبات استجابة للعلاج أبا. الفتحة ستوماتال يقلل أكثر من 50 في المائة بعد 30 دقيقة علاج مع رابطة المحا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
خلايا الحرس نظام نموذجي لدراسة آليات توصيل الإشارات في النباتات ومن المهم التأكد من أن إعداد العينات المستخدمة في هذه الدراسة هو الأكثر ملاءمة للإجابة على الأسئلة البيولوجية. وعلى الرغم من الاهتمام المتزايد بخلايا الحرس داخل مجتمع البحوث النباتية، هناك لا يوجد طريقة عالمية على كيفية إعداد الخلايا الحرس ستوماتال التي سوف تسمح لكل من حركة ستوماتال وعلم وظائف الأعضاء فضلا عن التغيرات الجزيئية دراستها في أحد النظام. التحدي لعزل لهم يمكن أن يعزى في جزء كبير منه لصغر حجمها، ووفرة منخفضة وبنية فريدة من نوعها، التي يمكن أن تجعل .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وأعلن لا تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
ونحن نشكر دانيال تشن من "الرقمية الفيديو إنتاج فريق من بوشهولز المدرسة الثانوية" للمساعدة في تحرير الفيديو. دعمت هذه البحوث stomatal الحرس الخلايا والبروتينات وجميع في مختبر تشن من المنح المقدمة من "لنا المؤسسة الوطنية للعلوم" (0818051 و 1158000 و 1412547). ويدعم "مجلس المنح الدراسية الصيني" كونغ فنون. الدكتور قيوينج بانغ معتمد من قبل مجلس المنح الدراسية الصيني ومؤسسة العلوم الطبيعية الصينية الوطنية (31570396).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
الفولاذ
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| المقاوم للصدأ مشرط جراحي | ريشة | NC9999403 | |
| شريط سكوتش (3M) | ULINE | S-9781 | |
| طبق بتري | سيجما ألدريتش | BR455701 | |
| السليولاز (Onozuka R-10) | Yakult صناعة الأدوية المحدودة | 21560003-3 | |
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co.، Ltd. | 21560003-4 | |
| DM6000B المجهر | كوكتيلات لايكا مايكروسيستمز | ||
| البروتياز والفوسفاتيز مثبطات | ثيرمو فيشر العلمية | PI78443 | |
| أوك ريدج أنابيب الطرد المركزي عالية السرعة PPCO | الحرارية فيشر العلمية | 3119-0030 | |
| EZQ مجموعة كمية البروتين | Thermo Fisher Scientific | R33200 | |
| Fluorescein Diacetate (FDA) Thermo | Fisher Scientific | F1303 | |
| حمض الأبسيسيك | Sigma-Aldrich | A4906 | |
| Metro Mix 500 | BWI الشركات | TX-500 | |
| Laemmli عينة عازلة | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Bio-Safe Comassie (G-250) | Bio-Rad | 161-0786 | |
| أنبوب الطرد المركزي الدقيق (2 مل) الولايات | المتحدة الأمريكية العلمية ، Inc. | 1620-2700 | |
| برنامج ImageJ | المعهد الوطني للملاقط الصحية | ||
| Sigma-Aldrich | F4017-1EA | ||
| 12٪ Mini-PROTEAN TGX جل مسبقة الصب | Bio-Rad | 456-1043 | |
| شرائح مجهر | Fisherbrand | 12-550-A3 |
المراجع
- Acharya, B., Assmann, S. Hormone interactions in stomatal function. Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).
- Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. Guard cell signal transduction. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).
- Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
