Este protocolo descreve um método de preparação estomáticas enriquecidas guarda células que é útil para estudos biológicos fisiológicos e outros.
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Artigo de método
Fita de estomas-casca: Um método melhorado para preparação de amostras de células de guarda
Neste artigo
Resumo
Resumo
O estudo das células guarda é essencial para o conhecimento das contribuições específicas deste tipo de célula para a função global de plantas. No entanto, muitas vezes é difícil isolar e, portanto, estudá-los muitas vezes fornece um desafio.
Este estudo estabelece um método de enriquecimento de célula estomática de guarda. O protocolo utiliza fita adesiva para isolar as células guarda e extrair as proteínas das células. Esse método melhora a integridade e o rendimento da célula guarda durante o isolamento e fornece uma amostra confiável para o estudo dos processos de sinalização celular e como eles se correlacionam com fenótipos movimento estomático. Neste método, as folhas da planta foram particionadas entre duas partes da fita e pedaços descascadas para remover o lado abaxial. Este protocolo foi aplicado ao tecido de folha de Arabidopsis para isolar as células guarda. As células foram tratadas com diacetato de fluoresceína (FDA) para determinar a viabilidade e com ácido abscísico (ABA) para avaliar o movimento de estômatos em resposta a ABA. Em conclusão, este protocolo prova útil para preparar células de guarda estomáticas enriquecidas e isolar proteínas. A qualidade das células e proteínas obtidas aqui enable fisiológico e outros estudos biológicos.
Introdução
Estomas desempenham um papel importante na fisiologia geral e adequação das plantas. Estas estruturas específicas de pequena planta são formadas por duas células epidérmicas especializadas conhecidas como células de guarda e são encontradas mais abundantemente na superfície abaxial das folhas. Estomas são necessárias para a troca de gases entre a planta e a atmosfera, bem como o controle da perda de água através da transpiração. Guarda as células regulam a abertura de estômatos, através da integração de diferente externa (por exemplo, luz, umidade, contato do patógeno, os níveis de dióxido de carbono) e interna (ex., hormônios endógenos) estímulos
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Protocolo
1. cultivo de plantas
- Germinar as sementes na mistura de potting. Cultivar plantas em uma câmara de crescimento com uma intensidade luminosa de 140 µmol fótons m− 2 s − 1 e um fotoperíodo de luz h 8 a 22 ° C e 16 h escuro a 18 ° C durante 2 semanas.
- Transplante de mudas de tamanhos similares individualmente em 4" potenciômetros de diâmetro contendo o solo e crescer para um adicional 3 semanas nas mesmas condições descritas no passo 1.1.
Nota: Regar plantas com água da torneira duas vezes por semana para manter o solo úmido.
2. preparação dos estomas enriquecidas
- Retire as folhas d....
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Resultados
Uma imagem representativa de Arabidopsis guarda células antes e após a digestão do mesofilo e as células epidérmicas é mostrado na Figura 1. Viabilidade celular de guarda antes e após a remoção do mesofilo e as células epidérmicas pode ser observada usando o FDA para medir a atividade enzimática e a integridade da membrana celular (figura 1B e 1D). A Figura 2 ilustra o movimento esto.......
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Discussão
Guarda as células são um sistema de modelo para estudar os mecanismos de transdução de sinal nas plantas e é importante garantir que a preparação de amostras utilizadas no estudo é o mais adequado para responder às perguntas biológicas. Apesar do crescente interesse em células de guarda dentro da comunidade de pesquisa de planta, não existe nenhum método universal sobre como preparar estomáticas células guarda que permita o movimento estomático e fisiologia bem como as alterações moleculares para ser estudado em um siste.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos a Daniel Chen na Digital vídeo produção equipe de Buchholz High School para assistência na edição do vídeo. Esta pesquisa sobre estomáticas células de guarda, proteómica e metabolómica no laboratório de Chen foi apoiada por concessões nos National Science Foundation (0818051, 1158000 e 1412547). Wenwen Kong é suportado pelo Conselho da bolsa de China. Dr. Qiuying Pang é suportado pela China Scholarship Council e Fundação Nacional de ciências naturais da China (31570396).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Bisturi Cirúrgico de Aço Inoxidável | Feather | ||
| Fita Adesiva (3M) | ULINE | S-9781 | |
| Placa de Petri | Sigma-Aldrich | BR455701 | |
| Celulase (Onozuka R-10) | Yakult Indústria Farmacêutica Co., Ltd. | 21560003-3 | |
| Macerozyme R-10 | Yakult Indústria Farmacêutica Co., Ltd. | 21560003-4 | |
| DM6000B Microscópio | da Leica Microsystems | ||
| Thermo Fisher Scientific | |||
| Tubos de centrífuga PPCO de alta velocidade Oak Ridge | Thermo Fisher Scientific | 3119-0030 | |
| Kit de quantificação de proteína EZQ | Thermo Fisher Scientific | R33200 | |
| Diacetato de fluoresceína (FDA) | Thermo Fisher Scientific | F1303 | |
| Ácido abscísico | Sigma-Aldrich | A4906 | |
| Metro Mix 500 | BWI Companies | TX-500 | |
| Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Bio-Safe Comassie (G-250) | Bio-Rad | 161-0786 | |
| Tubo de Microcentrífuga (2mL) | USA Scientific, Inc. | 1620-2700 | |
| ImageJ software | do Instituto Nacional de Saúde | ||
| Sigma-Aldrich | F4017-1EA | ||
| 12% Mini-PROTEAN TGX Gel Pré-moldado | Bio-Rad | 456-1043 | |
| Lâminas de microscópio | Fisherbrand | 12-550-A3 |
Referências
- Acharya, B., Assmann, S. Hormone interactions in stomatal function. Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).
- Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. Guard cell signal transduction. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).
- Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M.
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Reimpressões e permissões
