Method Article

בידוד של ראשי תאים Decidual האנושי בקרום עוברי של המונח Placentae

DOI:

10.3791/57443

⸱

April 30th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, University of Toronto, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health System, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מדגים שיטת הבידוד של תאים אנושיים decidual הראשית שנאסף בקרום עוברי של המונח placentae אשר יכול לשמש למגוון רחב של יישומים (קרי immunocytochemistry, cytometry זרימה, וכו ') מכוון ללמוד את התפקיד של אוכלוסיות תאים שונים בסיבוכים בהריון.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רותמי, המכונה גם רירית הרחם בהריון, היא רקמה הרבייה חשובה ביותר. תאים decidual, המורכב בעיקר תאי סטרומה decidualized של תאים חיסוניים, אחראים הפרשת גורמים הורמונליים דלקתית אשר הם קריטיים עבור הבלסטוציסט מוצלחת השרשה, פיתוח היפרדות לשחק תפקיד חניכה של העבודה לטווח, לידה מוקדמת. רבים הריון לסיבוכים לפליטת של איזון עדין של אוכלוסיות תאים שונים הכוללת רותמי. שינויים ביחס של סוגי תאים decidual מסוים עשוי לשבש תהליכים חיוניים אלה ולהגביר את הסיכון לפתח סיבוכים חמורים של ההריון, כגון כשל השרשה של העובר, פיגור גדילה תוך רחמי, רעלת, צירי. פרוטוקול שמפורטות כאן מדגים את העלות ואת הזמן שיטה יעילה עבור בידודו של התאים decidual העיקרי של האדם שנאסף בקרום עוברי של המונח placentae. על ידי שילוב עיכול אנזימטי ובהפסקות מכני עדין של הרקמה decidual, הושג תשואה גבוהה של תאים decidual עם כמעט ללא זיהום chorion. חשוב, מאופיינים מבודד תאים decidual (תאי סטרומה (55-60%), לויקוציטים (35%), אפיתל (% 1) או trophoblast (0.01%) תאים) ומתוחזק הכדאיות גבוהים (80%) אשר אושר ע י ססגוניות assay cytometry זרימה הדמיה. פרוטוקול זה ספציפית parietalis רותמי, ניתן להתאים בשליש הראשון והשני placentae. מבודדת בעבר, תאים decidual יכול לשמש עבור מספר רב של יישומים ניסיוני במטרה להבין את התפקיד של אוכלוסיות תת תא decidual שונים של סיבוכים בהריון.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רירית הרחם, אחד הפעילים ביותר למבוגרים נקבה ברקמות, עובר שיפוץ דרמטי בכל מחזור הוסת בתגובה לגירוי על ידי השחלה הורמונים, אסטרוגן (E2) ופרוגסטרון (P4). רותמי, המכונה גם רירית הרחם בהריון, היא רקמה הרבייה חשובה ביותר שנוצר עד לסוף השלב postovulatory כתוצאה מונחה P4 בידול בעקבות השלב proliferative E2-הדומיננטי. תאים decidual אחראים הפרשת ההורמונים גורמים הבלסטוציסט מוצלחת השרשה ועל פיתוח של הממשק עם רחם-היפרדות לשמירה על סובלנות אימהי להשתלת העובר.

Decidualization נדרש השרשת ובניה עוקבות של העורקים ספירלה decidual. תאי סטרומה רירית הרחם עוברים decidualization, תחת השליטה של P4, מחנה, במהלך שלב luteal מאוחר של המחזור החודשי1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Placentae נאספים מהסמסטר בריא, לא בנשים העבודה שעברו קיסרי אלקטיבי. איסוף, עיבוד, חד פעמית של דגימות האדם לדבוק הקווים המנחים של הלוח הר סיני החולים אתיקה. בכתב מתקבל של כל מטופל. מחקר זה אושרה על ידי מועצת המנהלים של אתיקה מחקר בבית החולים הר סיני.

1. תכשירים

הערה: כל השלבים להתבצע תחת ברדס fume, כל ציוד כירורגי חייב להיות מעוקר דרך החיטוי לפני השמה בשכונה fume. כל חומר אחר (בקבוקים, צינורות 50 מ ל, וכו ') חייב להיות מעוקר עם 70% אתנול פתרון. תמיד ללבוש ציוד מגן אישי בכל עת בעת עבודה עם פסולת ותברואה (חלוק, כפפות, שיער ארוך אסוף, וכו ').

  1. פתרון עיכול אנזימטי (הפתרון הסופי: 200....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לאמת את היעילות ואת הכדאיות של תאים מבודדים, אופיינו על ידי שתי שיטות: flow cytometry, immunocytochemistry (ICC). אוכלוסיות תאים 4 ממוקדים; decidualized תאי סטרומה אותרו על ידי הנוגדן אנטי-vimentin, פן-ליקוציט סמן CD45 שימש כדי לזהות תאים חיסוניים decidual, cytokeratin שימש כדי לזהות תאים אפיתל אנדותל, בסופו של דבר, cytokeratin 7 שימש כדי לזהות כל trophoblast פוטנציאליים (chorion או היפרדות) זיהום.

על אפיון באמצעות מיכשור הד.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר כאן מדגים את העלות ואת הזמן שיטה יעילה עבור בידוד תאים decidual הראשית שנאסף בקרום עוברי של המונח האנושיות placentae כי הוא מאוד נגיש וברור. ההצלחה של פרוטוקול זה תלויה בשני גורמים קריטיים, (1) יעילות של גירוד decidual מהשכבה chorion בקרום עוברי וטיפול (2) שבה התאים decidual מטופלות לאורך כל הפרוטוקול. זה חשוב כי זיהום רקמות chorion נשלטת על-ידי הבטחת כי לא נכלל בטעות במהלך גירוד decidual, על-ידי זיהוי והסרה של כל זיהום במהלך השלבים כביסה (ההבדל מורפולוגיה רותמי, chorion מאפשר הסרה קלה של chorion אשר שיי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצה להודות התורמים, את BioBank RCWIH, ואת ביה ח הר סיני/UHN המחלקה למיילדות גינקולוגיה עבור דגימות האנושי השתמשו במחקר זה. ברצוננו להודות לחברים של המעבדה בורית, במיוחד ד ר קרוליין דאנק עזרה עם פיתוח השיטה. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן ברוכים הבאים בורוז (גרנט #1013759).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
האנק' תמיסת מלח מאוזנת עם סידן ומגנזיוםמוכן במתקן (LTRI)
Hank' s תמיסת מלח מאוזנת ללא סידן ומגנזיוםמוכן במתקן (LTRI)
רפידות חיתוליםSigma-AldrichD9542
מספריים כירורגיות גדולותAL Medical2018-12-20.
מלקחיים כירורגיים גדוליםFine ScienceTools 11000-18
מגרד תאים חד פעמי מפלסטיק (25 ס"מ)Sarstedt83.183
250 מ"מ (גודל 60 רשת) מסננת מתכתSigma-AldrichS1020-5EA
אזמל חד פעמי עם ידית פלסטיק (#21)Fisher Scientific08-927-5D
צלחת פטרי סטרילית מפלסטיק (קוטר 10 ס"מ)Sarstedt82.1473.001
מיכל דגימה סטרילי (כוס שתן, 4.5 אונקיות)VWR25384-146
מסנן ניילון (70 מ"מ)VWR/Corning21008-952
מאגר ליזה אריתרוציטיםQiagen79217
טריפאן כחול, תמיסה 0.4%Lonza17-942E
ParafilmFisher Scientific13-374-10
המוציטומטרReichert1490
מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) 1640 אמצעי תרבותInvitrogen11835-055
סרום בקר עובריWisent080-150
נורמוצין (50 מ"ג/מ"ל)Invivogenant-nr-1
יחידת סינון עליונה מפלסטיק (ממברנה 0.22 מ"מ, 500 מ"ל)MilliporeSCGPT05RE
קולגנאז 2, אבקה ליופיליתSigma-AldrichC6885
מעכב טריפסין פולי סויה, אבקהSigma-AldrichT9003-250mg
אבקת DNaseבקר Roche10104159001
(אבקת BSA)Fisher ScientificBP1600-100
מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב - Leica DMI 6000BLeica
ציטומטר זרימת הדמיה - Image Stream MK2Amnis
תוכנת IDEAMillipore Sigma
APC מצומד נוגדן וימנטיןR& D SystemsIC2105A
נוגדן CD45 מצומד APC H7641399
נוגדן ציטוקרטין מצומד FITCMACs Miltenyi Biotec130-080-101
PerCP -מצומד ציטוקרטין 7 נוגדןNovusNBP2-47941PCP
eFluor450 צבע כדאיות לתיקוןתרמו פישר סיינטיפיק65-0863-14
נוגדן ראשוני וימנטיןסנטה קרוזsc-7558
CD45 נוגדן ראשוניDakoM0701
נוגדן ראשוני ציטוקרטיןDakoM0821
ציטוקרטין 7 נוגדן ראשוניDakoM7018
עכבר IgGסנטה קרוזsc-2025
עז IgGסנטה קרוזsc-2028
נוגדן משני Alexa Fluor 546InvitrogenA10036
Alexa Fluor 594 נוגדן משניFisher ScientificA-11058
DAPISigma-AldrichD9542
אלבומין סרום BD

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brosens, N., Hayashi, N., White, J. O. Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells. Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).
  2. Bell, S. C., D'Arcangues, C., Frase, I. S., Newton, J. R., Odlind, V. Decidual....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Decidual Cell IsolationPrimary Human Decidual CellsFetal Membrane TissueEnzymatic Digestion ProtocolFlow Cytometry AnalysisCell Viability AssayStromal Cell CharacterizationImmunological Cell MarkersConfocal Microscopy ValidationCentrifugation Washing Steps

Related Articles