このプロトコルは、アプリケーション (すなわち免疫細胞化学、フローサイトメトリー、等) の様々 な使用することができます長期胎盤の胎児膜から収集した主のひと脱落膜細胞の分離方法を示しますを目指して妊娠合併症の異なる細胞集団の役割を研究。
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この記事について
サマリー
要約
脱落膜、妊娠子宮内膜として知られている、非常に重要な生殖組織であります。脱落膜細胞は、主に decidualized の間質細胞と免疫細胞の構成は成功した胚盤胞移植、胎盤発育に欠かせないし、の役割を果たすホルモンや炎症性因子の分泌を担当されて、用語と早産で労働の開始。脱落膜を構成する異なる細胞集団の微妙なバランスの摂動から多くの妊娠合併症が生じる。脱落膜細胞の特定の種類の割合に変化がこれらの重要なプロセスを中断、妊娠、妊娠中毒症、子宮内胎児発育制限胚着床障害などの重篤な合併症の発症リスクを高めると早産。ここで説明されているプロトコルは、コストと時間的胎盤の胎児膜から収集した主のひと脱落膜細胞の隔離のための効果的な方法を示しています。酵素消化と脱落膜組織の穏やかな機械的破壊を組み合わせて、絨毛膜の汚染の事実上なしで脱落膜細胞の高収率が得られました。重要なは、孤立した脱落膜細胞が特徴付けられた (間質細胞 (55-60%)、白血球 (35%)、上皮 (1%) または (0.01%) 栄養膜細胞) マルチカラー イメージング流れ cytometry の試金によって確認された高い生存率 (80%) を維持。このプロトコルは脱落膜の parietalis に固有、最初と 2 番目の妊娠の胎盤に適応することができます。一度分離、脱落膜細胞は多数の妊娠合併症で別の脱落膜細胞集団の役割を理解することを目指して実験的アプリケーションを使用できます。
概要
子宮内膜、最も活発な大人女性組織の 1 つは、劇的改造卵巣ホルモン、エストロゲン (E2) とプロゲステロン (P4) によって刺激への応答の各月経周期を経る。脱落膜、妊娠子宮内膜として知られているは、E2 支配的な増殖期に続く P4 駆動型分化の結果として postovulatory のフェーズの終了によって形成される非常に重要な生殖組織です。脱落膜細胞が分泌ホルモンの要因成功した胚盤胞の着床、胎児移植する母体を維持するため子宮胎盤インタ フェースの開発を担当。
エストロージェンは、注入と脱落膜らせん動脈のそれに続く改造に必要です。子宮内膜間質細胞は、月経周期1の後半の黄体期における P4 とキャンプの制御の下でエストロージェンを受けます。このプロセスは、血管と血管リモデリングと規制を人身売買白血球におけるその役割を示唆している間質全体に広がる周り開始です。この携帯の変換は、円形の形態、核サイズの増加と粗面小胞体とゴルジ装置2の拡大が特徴です。Decidualized 間質細胞は胚盤胞移植を支援パラクライン因子を作り出すことができる、多数のホルモン (プロラクチンすなわち)、血管新生因子、インスリン成長因子結合蛋白質 1 の分泌によって特徴づけられる(IGFBP 1), プロスタグランジン (PG) E (細胞内 cAMP の刺激)、サイトカイン、細胞外マトリッ....
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プロトコル
胎盤は、選択科目の帝王を受ける労働女性ではなく、健康的な用語から収集されます。収集、処理、およびひと試料の使い捨ては、マウント シナイ病院倫理委員会のガイドラインに従います。各患者からの書面による同意を得た本研究は、マウント シナイ病院研究倫理委員会で承認されています。
1. 準備
注: すべての手順は、ヒューム フードの下で行われなければならないし、すべての手術用機器は発煙のフードで配置する前にオートクレーブで滅菌する必要があります。(ボトル、50 mL の管、等) 他のすべての材料は、70% エタノールで消毒する必要があります。常に摩耗保護具は、バイオハザード廃棄物 (白衣、手袋、長い髪を後ろで結ぶ、等) を使用する場合すべての回します。
-
酵素消化ソリューション (最終的な解決: 200 mL)
- HBSS の 180 mL のピペット/- 500 mL ビーカーに滅菌攪拌磁石を追加し、室温で感動のプレートを配置。
- 重量を量り、ゆっくりと順番に次の HBSS/ソリューションに追加: FBS、20 mL、400 mg コラゲナーゼ 2 ([final] = 2 mg/mL)、20 mg 大豆豆トリプシンインヒビター ([final] = 0.1 mg/mL)、30 mg DNase 1 (....
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結果
効率性と隔離されたセルの実行可能性を検証するため、彼らは 2 つの方法により特徴づけられた: 流れの cytometry と免疫細胞化学 (ICC)。4 細胞集団を対象としました。decidualized 間質細胞は抗ビメンチン抗体によって検出された汎白血球マーカー CD45 は脱落膜免疫細胞を識別するために使用された、サイトケラチンは、上皮・内皮細胞の検出に使用された、サイトケラチン 7 が検出に使用した最後に、潜在的な胎盤絨毛細胞 (絨毛膜や胎盤) 汚染。
マルチカラー イメージング フローサイトメトリーによるキャラクタリゼーションのため新鮮単離脱落膜細胞は細胞の生存率を決定する修正可能な染料で染色された.セルされたグリセリンと固定、続いてターゲット ビメンチン APC、CD45 APC H7、サイトケラチン FITC、サイトケラチン 7 PerCP マウスの蛍光色素標識されたモノクローナル抗体で染色します。抗体情報は、材料のテーブ.......
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ディスカッション
ここで説明されているプロトコルは、非常に身近で簡単な一次脱落膜細胞を分離するための効果的な方法で採集された全体ひと満期胎盤の胎児膜時間とコストを示しています。このプロトコルの成功は 2 つの重要な要因、(1) (2) プロトコルを通して脱落膜細胞の処理とケアと胎児膜の絨毛膜層から脱落膜を削りの効率に依存しています。絨毛膜組織汚染がどれもが誤って含まれて脱落膜をこする時に、特定し、洗浄のステップ (脱落膜と絨毛膜の形態の違いの間にあらゆる汚染を削除によって制御されていることが重要です。絨毛, 脱落膜と誤って収集が簡単に除去できます)。脱落膜細胞が壊れやすいため高速かつ頻繁にピペッティング減らされた実行可能性可能性があります。私達は、その後、低速、ピペット エジェクタ速度を設定しておくし、細胞を混合するときに使用する最低限のピペッティングを提案します。
このプロトコルが絨毛の汚染を防止する方法の 1 つはもっぱら (脱落膜 parietalis から成る) 胎盤の胎児膜の脱落膜を収集することにより取って生検によって行われ、脱落膜マイネルトのコレクションを除く胎盤の母体側。したがって、私.......
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開示事項
著者がある何も開示するには
謝辞
著者は、この研究で使用される人間の標本のドナー、RCWIH バイオバンク マウント シナイ病院/UHN 産科婦人科を感謝したいです。灰汁ラボ、特に博士キャロラインのダンク シュート法開発と彼女の助けのためのメンバーに感謝したいと思います。この作品はバロウズようこそ基金 (グラント #1013759) によってサポートされます。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ハンクカルシウムとマグネシウムを含むバランスの取れた塩溶液 | 施設で調製(LTRI) | ||
| Hank'カルシウムとマグネシウムを含まないバランスの取れた塩溶液 | 施設で調製 (LTRI) | ||
| おむつパッド | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 大型手術用ハサミ | AL Medical | 2018-12-20. | |
| 大型外科用鉗子 | ファインサイエンスツール | 11000-18 | |
| プラスチック製使い捨てセルスクレーパー (25cm) | Sarstedt | 83.183 | |
| 250 mm (サイズ 60 メッシュ) 金属ふるい | Sigma-Aldrich | S1020-5EA | |
| プラスチックハンドル付き使い捨てメス (#21) | フィッシャーサイエンティフィック | 08-927-5D | |
| 滅菌プラスチックシャーレ (直径 10 cm) | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| 滅菌検体容器(尿カップ、4.5オンス) | VWR | 25384-146 | |
| ナイロンフィルター(70 mm) | VWR / Corning | 21008-952 | |
| 血球溶解緩衝液 | Qiagen | 79217 | |
| パンブルー、0.4%溶液 | ロンザ | 17-942E | |
| パラフィルム | フィッシャーサイエンティフィック | 13-374-10 | |
| 血球計算盤 | Reichert | 1490 | |
| ロズウェルパーク記念研究所 (RPMI) 1640 培地 | Invitrogen | 11835-055 | |
| ウシ胎児血清 | Wisent | 080-150 | |
| ノルモシン (50mg/mL) | Invivogen | ant-nr-1 | |
| プラスチックトップろ過ユニット (0.22 mm メンブレン、500 mL) | ミリSCGPT05REポア | ||
| コラゲナーゼ2、凍結乾燥粉末 | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| 大豆トリプシン阻害剤、粉末 | Sigma-Aldrich | T9003-250mg | |
| DNase 粉末 | ロシュ | 10104159001 | |
| ウシ血清アルブミン (BSA粉末) | フィッシャーサイエンティフィック | BP1600-100 | |
| スピニングディスク共焦点顕微鏡 - ライカ DMI 6000B | ライカ | ||
| イメージングフローサイトメーター - Image Stream MK2 | Amnis | ||
| IDEAソフトウェア | Millipore Sigma | ||
| APC標識ビメンチン抗体 | R&D Systems | IC2105A | |
| APC H7-conjugated CD45 antibody | BD | 641399 | |
| FITC-conjugated Cytokeratin antibody | MACs Miltenyi Biotec | 130-080-101 | |
| PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody | Novus | NBP2-47941PCP | |
| eFluor450 Fixable Viability dye | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 65-0863-14 | |
| ビメンチン一次抗体 | Santa Cruz | sc-7558 | |
| CD45一次抗体 | Dako | M0701 | |
| サイトケラチン一次抗体 | Dako | M0821 | |
| サイトケラチン7一次抗体 | Dako | M7018 | |
| マウスIgG | Santa Cruz | sc-2025 | |
| ヤギIgG | Santa Cruz | sc-2028 | |
| Alexa Fluor 546二次抗体 | Invitrogen | A10036 | |
| Alexa Fluor 594二次抗体 | Fisher Scientific | A-11058 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
参考文献
- Brosens, N., Hayashi, N., White, J. O. Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells. Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).
- Bell, S. C., D'Arcangues, C., Frase, I. S., Newton, J. R., Odlind, V. Decidual....
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