Summary
Rekombinante Retroviren Integrase und DNA-Oligomere imitiert virale DNA enden können einen enzymatisch aktiven Komplex bekannt als ein Intasome bilden. Intasomes können für biochemische, strukturellen und kinetischen Studien verwendet werden. Dieses Protokoll beschreibt, wie zu montieren und zu reinigen Prototyp schaumig Virus Intasomes.
Abstract
A Definition von Funktion und notwendiger Schritt des Lebenszyklus Retrovirus ist die Integration des viralen Genoms in das Wirtsgenom. Alle Retroviren kodiert eine Integrase (IN)-Enzym, das katalysiert die kovalente Verbindung von viralen Host DNA, bekannt als Strang übertragen. Integration kann modelliert in Vitro mit rekombinante Retroviren und DNA-Oligomere imitiert die Enden des Virusgenoms. Um genauer rekapitulieren die Integration-Reaktion, die auftritt, in Vivo, Integration sind komplexe von rekombinanten IN und synthetischen Oligomere durch Dialyse in einem reduzierten Salzgehalt Puffer montiert. Die Integration komplexer, genannt eine Intasome kann durch Größe Ausgrenzung Chromatographie gereinigt werden. Bei Prototyp schaumig Virus (PFV) der Intasome ist ein Tetramer von innen und zwei DNA-Oligomere und ist leicht von Monomeren IN und kostenlose Oligomer DNA getrennt. Die Effizienz der Integration des PFV Intasomes kann unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen für die Dynamik besser zu verstehen und Mechanik der retroviralen Integration untersucht.
Introduction
Integration des viralen Genoms in das Wirtsgenom ist ein obligatorischer Schritt im Lebenszyklus von allen Retroviren1. Das virale Enzym Integrase (IN) katalysiert die kovalente Verbindung der beiden Enden der viralen DNA-Genom an den Host DNA. Während einer zellulären Infektion gehört eine Vorintegration Komplex, die die Integration vermittelt. Rekombinante IN komplexiert mit doppelten gestrandeten DNA-Oligomere imitiert die virale DNA-enden können auch die Integration in ein Ziel DNA in Vitro2durchführen. Eine gemeinsame Integration Assay in Vitro nutzt ein supercoiled Plasmid als Ziel DNA. Integration der beiden virale DNA-Oligomere (vDNA) auf dem Plasmid führt zu einem linearen Produkt und ist abgestimmte Integration (Abbildung 2A) bezeichnet. Die Integration Tests in Vitro können auch Produkte mit nur ein vDNA kovalent an das Ziel-Plasmid, was zu einem entspannten Kreis trat führen. Dieser halb-Website Integration Produkt scheint ein Artefakt der Assay in Vitro.
IN rekombinanten und vDNA Integration in Vitroverrichten, aber sie sind nicht ideal Reagenzien für das Studium der Dynamik oder die Struktur der komplexe Integration, wenn Monomere IN relevanten Visualisierung verdecken würde. Gereinigte Integration komplexe oder "Intasomes" sind für dynamische Einzelmolekül-Analyse oder strukturelle Studien erforderlich. PFV IN und vDNAs können durch Dialyse aus einem relativ hohen Salzkonzentration Puffer zu einem niedrigeren Salzkonzentration3,4montiert werden. Während der Dialyse, einen Niederschlag Formen. Dieser Niederschlag aus Dialyse entfernt und die Salzkonzentration steigt. Die höheren Salzkonzentration solubilisiert überstürzten enthaltenden PFV-Intasomes. Die Intasomes werden dann durch Größe Ausgrenzung Chromatography (SEC) gereinigt. Rekombinante Prototyp schaumig Virus (PFV) IN nachweislich als ein Monomer in Lösung in Konzentrationen bis zu 225 µM5existieren. SEC Fraktionierung trennt effektiv PFV Intasomes (225.5 kDa), die ein Tetramer des PFV IN und zwei vDNAs umfasst, von Monomeren PFV IN (44,4 kDa) und freie vDNA (24,0 kDa). Der PFV Intasomes können eingefroren werden und Integration Aktivität für mindestens sechs Monate Lagerung bei-80 ° c aufbewahren.
Rekombinante PFV Intasomes kann auch geändert werden, um IN Aminosäure Substitutionen oder abschneiden Mutationen oder vDNAs beschriftet mit Fluorophore oder Biotin4,6erweitert. Die gereinigten PFV Intasomes durchführen ohne weiteres Integration in ein Ziel supercoiled Plasmid DNA in Vitro. Bulk-biochemische Integration-Assays mit Intasomes können die Auswirkungen der IN Mutationen im Hemmer oder sonstigen chemischen Zusätzen testen. Biotinylierte Intasomes kann verwendet werden, Affinität mit Nukleinsäuren oder Proteine zu untersuchen. PFV Intasomes funktionieren bei Umgebungstemperatur zulassend Einzelmolekül-Mikroskopie-Analyse von magnetischen Pinzette Messung die Zeit zwischen den Beitritt der beiden vDNA enden oder Totalreflexion Fluoreszenz, die Intasome Suche auf Ziel zu visualisieren DNA-6. Darüber hinaus wurden PFV Intasomes die erste strukturell sein deutlich beeinflussen das Feld von Retroviren Integration3gekennzeichnet.
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Protocol
(1) Glühen des vDNA
- Mähdrescher 1 X 10-Puffer (10 X 10 Lager: 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 M NaCl 10 mM EDTA), 10 µM Oligo-1 (5' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3', 100 µM-Lager) und 10 µM Oligo-2 (5' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA 3', 100 µM-Lager) in einem Endvolumen von 1,5 mL . Aliquoten 25 µL in sechzig 0,2 mL Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Röhren.
Hinweis: Abhängig von der Anwendung können Oligomere mit Fluorophore oder Tags am 5'-Ende von Oligo 2 oder als eine interne amino-T im Boden 13 vom 5'-Ende von Oligo 1 geändert werden. Modifizierte Oligomere sollte durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) vor Glühen gereinigt werden. Wir haben festgestellt, dass 5'-Ende Cy3 oder Cy5 Fluorophor Kennzeichnung von Oligo-2 Intasome-Montage-Effizienz 10-fache reduziert. Interne Fluorophor Kennzeichnung verringert nicht die Versammlung Effizienz. - Tempern mit einem Thermocycler mit folgenden Zeiten und Temperaturen: 1 Zyklus auf 94,0 ˚C 3 min 99 Zyklen bei (94,0 ˚C 1 min, 93,6 ˚C 1 min) beide Temperaturen um 0,8 ° c pro Zyklus verringert (der letzte Zyklus ist 14,8 ˚C 1 min, 14,4 ° c 1 min) , und bei 4,0 ° c lagern.
- Kombinieren Sie die Glühen Reaktionen alle 60 Röhren. Laden Sie 500 µL, zwei 0,5 mL 3 kDa Molekulargewicht cutoff (MWCO) ultracentrifugal Filter Konzentrationseinheiten. Die geglühten vDNA durch Zentrifugieren in einem Microcentrifuge 14.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur (RT) zu konzentrieren.
Hinweis: Das Retentat Laufwerk sollte ~ 50 µL in jeder Konzentration Einheit. - Die Durchströmung zu verwerfen. Jede Filteranlage 250 µL der verbleibenden geglühten vDNA hinzufügen. Wiederholen Sie den Spin und verwerfen Sie die Durchströmung zu. Tausch in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) durch waschen dreimal mit 450 µL TE-Puffer.
- Invertieren der Filtereinheit und Spin bei 1.000 x g für 2 min bei RT Die endgültige Retentat Lautstärke für jede Filteranlage sollte ~ 50 µL kombinieren Sie die Retentates und Übertragung auf ein 1,5 mL Schraubverschluss Rohr.
- Messen Sie die Absorption 260 nm Ultraviolett (UV) von der vDNA. Verwenden Sie diesen Wert, um die Endkonzentration der molaren DNA zu berechnen. Die vom Aussterben bedroht Leistungszahl (ε260) dieses vDNA ist 622.803 cm-1 M-1 und seine Molekulargewicht 23.972 Da. Store bei-20 ° c.
2. Intasome Montage
- Führen Sie nach Möglichkeit die Intasome-Assembly in einem kleinen Raum mit einem Variablen Thermostat. Stellen Sie den Thermostat auf ca. 18-22 ° c.
Hinweis: Nach unserer Erfahrung ist Intasome Versammlung bei 4 ° c ineffizient. - Bereiten Sie 1 L des Dialyse-Puffer (20 mM Bis-Tris Propan, pH 7,5, 200 mM NaCl, 2 mM Dithiothreitol (DTT), 25 µM ZnCl2) in einem 2 L Becherglas mit Stir Bar auf einem Teller rühren. Equilibrate des Puffers in der 18-22 ° c Raum für mindestens 6 h.
- Um die Intasomes zu montieren, verbinden Sie Propan 50 mM Bis-Tris, pH 7.5, 500 mM NaCl und 120 µM PFV IN 50 µM vDNA in einem Gesamtvolumen von 150 µL.
Hinweis: Der PFV IN sollte frei von kontaminierenden Nuklease Aktivität7,8. Wenn die Konzentration des PFV IN zu verdünnen, 120 µM IN 150 µL Volumen unterzubringen, ist dann es möglich ist, das Endvolumen zu 200 µL zu erhöhen. Die entscheidenden Faktoren für diesen Schritt sind weiterhin das molare Verhältnis von IN zu vDNA (2.4:1) und ausreichend komplex, während der Chromatographie zu visualisieren. - Reinigen Sie ein ~ 10 cm langes Stück 10 mm 6-8 kDa MWCO Dialyse Schläuche und Clips mit doppelt destilliertem Wasser (DdH2O) oder die höchste Reinheit Wasser zur Verfügung. Stecken Sie ein Ende des Schlauches.
Hinweis: Dialyse Schläuche sollten mit Sorgfalt, um zu verhindern, dass etwaige Kontaminationen aus dem Labor-Raum behandelt werden. - 15 mL Dialyse Schläuche spülen Puffer (50 mM Bis-Tris Propan, pH 7.5, 500 mM NaCl) zu machen. Spülen Sie die Innenseite des Schlauches Dialyse dreimal mit 1-2 mL spülen Puffer. Entfernen Sie so viel des Puffers spülen wie möglich mit einer Pipette und dünnen Gel laden Tipp.
- Verwenden Sie ggf. eine saubere Rasierklinge oder einem Skalpell schneiden die Dialyse Schläuche, so dass ein dünne Gel-laden-Tipp am Ende des Schlauches erreichen kann.
- Übertragen Sie die Intasome-Assembly von Schritt 2.3 auf der Dialyse-Schlauch mit einer Pipette und einem dünnen Gel laden Tipp. Befestigen Sie das offene Ende der Dialyse Schläuche, Minimierung der Menge von Luft in den Schlauch eingeführt. Legen Sie die Schläuche in der Dialyse-Puffer.
- Dialyse über Nacht (16-20 h) unter schonenden rühren, damit das Rohr dreht sich aber nicht in einen Strudel. Sicherstellen Sie, dass die Dialyse-Schlauch unter Wasser und mobile. Beobachten Sie nach etwa einer Stunde einen sichtbaren Niederschlag in den Schlauch.
Hinweis: Mit Cy3 oder Cy5 Eindringmittel vDNA bezeichnet, ist der Niederschlag deutlicher. Dies gilt auch für Ende beschriftet und intern beschrifteten fluoreszierende vDNA.
3. Intasome Solubilization
- Bereiten Sie zwei breite Bohrung Pipettenspitzen durch Entfernen von 2-4 mm vom Ende von 200 µL Tipp mit einer neuen Rasierklinge oder Skalpell Klinge auf eine saubere Oberfläche.
Hinweis: Die Tipps werden in Schritt 3.3 und 3.5 verwendet werden. - Entfernen Sie die Dialyse-Schläuche aus der Dialyse-Puffer. Vermeidung einer Verdünnung der Probe mit Dialyse-Puffer Intasome, die am Ende des Schlauches in der Nähe des Clips bleiben können, mithilfe einer Mikropipette mit einem kleinen Pipettenspitze um jede überschüssige Dialyse-Puffer zu entfernen. Entfernen Sie den Clip von einem Ende der Dialyse Schläuche.
- Verwendung eine große Bohrung Pipettenspitze Schritt 3.1, die Probe einschließlich des Niederschlags in der Dialyse-Schlauch, ein 1,5-mL-Tube auf Eis zu übertragen. Beachten Sie das Gesamtvolumen des zurückgewonnenen Materials; Das Gesamtvolumen beträgt in der Regel ca. 140 µL.
- Die Probe mit Niederschlag ist bei 200 mM NaCl; erhöhen Sie das Salz, eine Endkonzentration von 320 mM NaCl, indem das entsprechende Volumen der NaCl-Stammlösung der 5 M. Zum Beispiel für eine Probe von 150 µL hinzufügen 3,9 µL 5 M NaCl und 1,1 µL DdH2O für ein Endvolumen von 155 µL. Transfer Eiseimer mit Probe in einen Kühlraum von 4 ° c.
- Verwendung eine große Bohrung Pipettenspitze Schritt 3.1 Aufschwemmen und solubilisieren die Ausfällung von pipettieren. Wiederholen Sie alle 20 min für mindestens 1 Stunde beobachten, die meisten des Niederschlags in Lösung gehen sollte.
Hinweis: Um den Niederschlag Aufschwemmen Pipettieren kann beendet werden, wenn es ersichtlich ist, dass der Niederschlag zwischen Zeitpunkten nicht mehr spürbar reduziert wird. Wenn vDNA nicht beschriftet ist oder intern bezeichnet, ist der Niederschlag um ~ 90 % bezogen auf die Sichtprüfung reduziert. Bei Cy5 Ende beschriftet vDNA wird der Niederschlag nur ~ 20 % reduziert; die meisten des Niederschlags mit Fluorophor Ende beschriftet vDNA werden nicht anderweitig. Die Menge des Niederschlags, die effektiv solubilisiert ist ist variabel und sollte empirisch ermittelt werden.
4. Intasome-Reinigung
- Bereiten Sie 250 mL Größe Ausgrenzung Chromatography (SEC) Puffer (20 mM Bis-Tris Propan, pH 7.5, 320 mM NaCl, 10 % Glycerin) ausgeführt. Sterilfilter des Puffers mit einem 0,2 µm Filtern Einheit und bei 4 ° c lagern.
Hinweis: Alle Reinigungsschritte sind in einem 4 ° c kalten Raum durchgeführt. - Equilibrate eine vernetzte Agarose SEC-Spalte (Durchmesser = 10 mm; Länge = 300 mm; Volumen Bett = 24 mL; probieren Volumen = 25-500 µL; Maximaldruck = 1,5 MPa; Ausgrenzung Limit = 4 x 107 Da; trennt Molekulargewichte zwischen 5 bis 5.000 kDa, sehen die Tabelle von Mat Erials) mit SEC laufenden Puffer mit einer Durchflussrate von 0,4 mL/min.
Hinweis: Diese Reinigung kann auf unterschiedlicher Größe Ausgrenzung Spalten angepasst werden, wenn sie effektiv 300 kDa trennen 44 kDa, z. B. Superose 12 10/300 GL oder Superose 6 erhöhen können. Superose 12 10/300 GL hat niedrigeren Auflösung, was zu mehr Überschneidungen der Gipfel. Im Gegensatz dazu Superose 6 erhöhen verfügt über höhere Auflösung und besseren Trennung. - Zentrifuge Intasome Probe in ein Microfuge bei 14.000 x g für 10 min bei 4 ° c, alle übrigen Niederschlag pellet. Entfernen Sie vorsichtig den überstand. Laden des Überstands zu einem 200 µL Injektionsschleife (Schläuche, die ~ 200 μL enthalten kann). Die Probe auf der SEC-Spalte anwenden.
Hinweis: Kleinere Ladevolumen ermöglichen höhere Auflösung von SEC - Eluieren mit 25 mL SEC laufen zu puffern und sammeln 95 Bruchteile von 270 µL. beachten Sie, dass die SEC-Chromatogramm drei A280/a260 -Gipfel (Abbildung 1 zeigt).
Hinweis: Die erste sollte ein Aggregat (~9.0 - 11,5 mL Elution), gefolgt von der PFV Tetramer Intasome Peak (~12.0 - 14,75 mL Elution) und PFV IN Monomer mit kostenlosen vDNA Peak (~15.0 - 18,0 mL) sein.
5. Integration Strang Transfer Assay, Bruchteil Auswahl und Lagerung
- Kombinieren Sie 2 µL der Höhepunkt jedes Intasome und 50 ng 3 kb supercoiled Plasmid DNA (Lager Konzentration ist 50 ng/µL) in Reaktion-Puffer (10 mM Bis-Tris Propan, pH 7.5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 µM ZnCl2, 10 mM DTT) in eine endgültige Reaktionsvolumen von 15 µL. Bei 37 ° c für 5 min inkubieren.
- Gehören Sie eine Negativkontrolle mit keine zusätzlichen PFV Intasome. Stoppen Sie die Reaktion mit 0,75 µL Proteinase K (20 mg/mL Stammlösung) und 0,75 µL SDS (10 % Stammlösung). Inkubieren Sie bei 55 ° c für 1 h Store Proben Bedarf bei-20 ° c für spätere Analysen.
Hinweis: Dieser Test ist eine qualitative Bewertung der Integration Aktivität. Die Intasome molare Konzentration der einzelnen Fraktionen ist nicht vor dieser Assay ermittelt. Brüche in der Integration Strang Transfer Test enthalten können gespeichert werden auf dem Eis (einschließlich Lagerung über Nacht) bis zur Integration Tätigkeit bestätigt und ausgewählte Brüche sind regelmÄÑig. Hier verwenden wir pMP2, eine pUC19 Derivative9. Wir haben auch erfolgreich die 5,4 kb-Plasmid PcDNA 3.1 verwendet. Alle Plasmid, das gelöst werden kann entspannt Kreis, linear, und supercoiled Formen als Ziel für die Integration verwendet werden. - Bereiten Sie ein 120 mL 1 % Gewicht pro Volumen (w/V) Agarose-Gel auf 1 X TAE-Puffer (40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA) mit 0,1 μg/mL Interkalation Bromid (EtBr, 10 mg/mL Stammlösung)10. Schmelzen Sie die Agarose-Lösung zu und gießen Sie sie in ein 15 x 10 cm Gel Casting Tablett. Legen Sie einen 15-Brunnen-Kamm mit 5 mm breit, 0,75 mm dick Brunnen.
Hinweis: Schmalere Brunnen liefern besseren Band-Auflösung im Vergleich zu 1,5 mm Dicke Brunnen. - Lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur zu festigen. Tauchen Sie das Gel in 1 X TAE mit 0,1 μg/mL EtBr.
- Jede Integration Reaktion 3 µL 50 % Glycerin aus Schritt 5.2 hinzufügen. Laden Sie das gesamte Reaktionsvolumen auf das Gel. 1 µL 10 kb DNA Größe Marker (150 ng/µL Lager Konzentration) auf Bahnen auf beiden Seiten der Proben zu laden; Das heißt, sollte der DNA Größe Marker die Probe Gassen flankieren.
- Laden Sie in eine äußere Fahrspur 6 µL Orange G Farbstoff (0,25 % Orange G, 30 % Glycerin). Führen Sie das Gel bei konstanter Spannung, 10 V/cm (100 V) bei Raumtemperatur 1 Stunde oder bis Orange G Farbstoff vorne das Ende des Gels erreicht.
- Sofort Bild das Agarosegel mit einem fluoreszierenden Scanner EtBr (532 nm Anregung, 610 nm Emission Filter) überschreitet. Wenn Fluorophore beschriftet vDNAs verwendet wurden, auch mit entsprechenden Fluorophor Einstellungen Bild.
Hinweis: zum Beispiel mit der Bezeichnung Cy5 erkennen DNA, Bild mit 633 nm Anregung und 670 nm Emission Filter. Abgestimmte Integrationsprodukte (CI, lineare DNA) laufen maßhaltig bei ~ 3 kb, nicht umgesetztes supercoiled Plasmid (SC) läuft schneller (~ 2 kb) und halb-Website Integrationsprodukte (HSI, entspannten Kreis DNA) läuft langsamer (~3.5 kb). Nicht umgesetztes vDNA führen maßhaltig bei ~ 40 bp. - Die Bänder in jeder Bahn mit imaging Software7zu quantifizieren. Der Anteil der DNA in jeder Spur, die CI, HSI oder SC ist zu berechnen; vDNA ist in dieser Berechnung nicht enthalten.
Hinweis: Integration Effizienz oder der Bruch des SC zu einem linearen Produkt umgewandelt wurde dividiert das Pixel-Volumen von abgestimmten Integrationsprodukte (CI) durch das gesamte Pixel Volumen von drei Bands (HSI + CI + SC). Wenn Intasomes Fluorophore beschriftet sind, können die HSI und CI-Produkte auch durch Fluoreszenz quantitated. - Wählen Sie Brüche, die die meisten abgestimmte Integration-Aktivität haben.
Hinweis: Nach unserer Erfahrung fällt der Spitzenaktivität abgestimmte Integration mit dem Protein-Gipfel als tetrameres PFV Intasomes identifiziert. Messen Sie die A280 jedes dieser Fraktionen und berechnen Sie die endgültigen Intasome Konzentration. Die ε-280 für ein Tetramer von Wildtyp PFV IN mit zwei vDNAs hier beschriebenen ist 908.339 cm-1M-1 und das Molekulargewicht ist 225.5 kDa. Die Konzentrationen sollten das gleiche Muster als die SEC Chromatogramm Peak und im Strang Transfer Test folgen. - Jede Fraktion in 5 µL-Aliquots verteilen und snap Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Lagern Sie Aliquote bei-80 ° c. Brüche, ausgewählt für die Lagerung sind in der Regel zwischen 200 und 600 nM.
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Representative Results
PFV Intasomes werden von rekombinanten IN und vDNA montiert. Nach der Montage sind Intasomes durch SEC (Abbildung 1) gereinigt. Integration-Aktivität der einzelnen Fraktionen ist mit einem supercoiled DNA Ziel- und Agarose Gelelektrophorese (Abbildung 2) untersucht. Dieses Gel wird mit einem fluoreszierenden Scanner eingestellt, erkennt EtBr (und Fluorophor, wenn Fluorophore beschriftet vDNA verwendet wird) abgebildet. Bildanalyse-Software verwenden, können Band Pixel Bände verwendet werden, um die Integration Effizienz (Abbildung 3) zu berechnen. Brüche mit dem höchsten Wirkungsgrad der Integration sind Snap für spätere Verwendung eingefroren. Gefrorene Fraktionen behalten Integration Aktivität (Abbildung 4), so dass für die langfristige Lagerung von montierten Intasomes. Alle Label-Molekül und seine Position innerhalb des vDNA beeinträchtigen Intasome Montage Effizienz (Abbildung 5).
Abbildung 1: Größe Ausgrenzung Chromatogramm. Eine PFV Intasome Versammlung wurde mit einer Agarose SEC Spalte getrennt. Diese Spalte ermöglicht die Trennung des Aggregats (1), PFV Intasome bestehend aus einem Tetramer von PFV IN und zwei vDNA (2), und Monomeren PFV IN und vDNA (3). In diesem Beispiel enthalten vDNA mit einem internen Cy5 Fluorophor-Label von 650 nm Anregung erkannt. Die y-Achse steht für optische Dichte (OD) in Milli-Absorptionseinheiten (mAU). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Integration Assay SEC Brüche. (A) schematische Darstellung der Integration Strangreaktion Transfer. Links, Karikatur von einer PFV Intasome einschließlich ein Tetramer von IN (blaue Kreise) und zwei vDNA (dicke schwarze Linien) und ein Ziel-Plasmid (dünne schwarze Linien). Die Supercoils (SC) des Plasmids Ziel werden nicht gezeichnet. Zentrum, Cartoon ein Hälfte-Website Integration (HSI)-Produkt bei einem vDNA kovalent an das Ziel-Plasmid beigetreten. Die Verbindungstechnik Reaktion führt einen Nick und entspannt die Supercoils. Recht, Karikatur eines abgestimmten Integration (CI) Produktes, wo zwei vDNAs zum Ziel DNA verbunden wurden. Diese Integration Produkt ergibt eine lineare DNA mit vDNAs an den Enden. (B) Supercoiled Plasmid-DNA wurde jede SEC-Fraktion #49-55 hinzugefügt. Nach Inkubation die Integration Reaktionen waren Deproteinated und durch 1 % Agarose-Gelelektrophorese mit EtBr getrennt. Negativkontrolle wurde Plasmid-DNA mit kein Protein (T). DNA-Markern Größe werden in kb angezeigt. Supercoiled Plasmid (SC), konzertierte Integrationsprodukte (CI), Hälfte-Website Integrationsprodukte (HSI) und vDNA werden angezeigt. (C) die Agarose-Gel wurde auf das Vorhandensein von Cy5 gescannt. Nur die vDNA, CI und HSI Produkte sind sichtbar. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Quantifizierung der Integration Test. Das Agarosegel aus Abbildung 2 wurde gescannt und auf das Vorhandensein von EtBr (A) und (B) Cy5 quantifiziert. (A) für die Berechnung von EtBr, HSI, CI und SC Band Pixel Bände stammen mit Gel-Analyse-Software. Integration-Effizienz war das Pixel-Volumen von abgestimmten Integrationsprodukte (CI) durch das gesamte Pixel Volumen aller drei Bands (HSI + CI + SC) dividiert. Zum Beispiel die Pixelwerte in der EtBr Kanal für die Bänder der Bruchteil #49 sind: 110565.2 SC, 25152.56 CI und 6313.04 HSI. Der gesamte DNA Pixelwert für Bruchteil #49 ist die Summe dieser Werte, 142030.8. Die Integration-Effizienz ist das CI Pixel Volumen des 25152.56 geteilt durch die DNA-Gesamtwert entspricht 0,18 142030.8. (B) Cy5 CI Band Pixel Bände sind als willkürliche Einheiten grafisch dargestellt. Brüche mit Integration Spitzenaktivität sind individuell regelmÄÑig und eingefroren. In diesem Beispiel wurden Brüche #50-53 ausgewählt. Aliquote sind Snap mit flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 ° c für eine spätere Verwendung gespeichert.
Abbildung 4: Wirkung des Einfrierens auf Intasome. Die Hälfte der Bruchteil einer SEC war Flash-gefroren mit flüssigem Stickstoff, bei-80 ° c für 1 h gelagert und dann langsam auf Eis aufgetaut. Die andere Hälfte der SEC-Fraktion wurde auf Eis in einem kalten Raum gehalten, während die erste Hälfte eingefroren und wieder aufgetaut war. Intasomes für Aktivität ohne (-) getestet wurden und mit (+) Einfrieren/Auftauen. Integration-Effizienz gemessen wurde, wie oben beschrieben. (A) EtBr gefärbten Agarosegel Integration Reaktionsprodukte. Supercoiled Plasmid (SC), konzertierte Integrationsprodukte (CI), Hälfte-Website Integrationsprodukte (HSI) und nicht umgesetztes vDNA werden angezeigt. DNA-Markern Größe werden in kb angezeigt. (B) Quantifizierung der Integration Effizienz aus dem EtBr-Bild. Berechnungen sind in Abbildung 3 Legende beschrieben. Es gibt keinen Verlust der Integration Aktivität nach Einfrieren und Auftauen. Die durchschnittliche Integration Effizienz ist für 5 unabhängige Experimente mit 2 Intasome Vorbereitungen gezeigt. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. Gepaarter t-Test Analyse ergab eine zweiseitige P = 0,011, was darauf hindeutet, dass der Frost/Tau-Wechseln leicht Integration Aktivität verbessert haben kann. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Label-Molekül und Position Auswirkungen Intasome Versammlung. PFV Intasome Baugruppen enthalten vDNAs, die unbeschriftete (rot), Ende mit der Bezeichnung Oligo 2 mit Cy5 (blau), intern mit der Bezeichnung auf Oligo 1 mit Cy5 (schwarz), oder am Ende mit Biotin (Orange) auf Oligo 2 beschriftet waren. Alle Baugruppen wurden mit einer Agarose SEC Spalte getrennt. Die y-Achse bezeichnet OD in mAU. Chromatogramme sind repräsentativ für mindestens 2 unabhängige Baugruppen der einzelnen Intasome. Ende Kennzeichnung verringert den Ertrag des PFV Intasomes mit Cy5 10-fach und Biotin 1,8-fachen. Ende Cy5 und Biotin Baugruppen haben deutlich mehr Niederschlag bleiben nach dem hohen Salz Resolubilization (Schritt 3.5), scheinbaren Verlust von Material auf der Spalte "Größe Ausgrenzung". Interne Kennzeichnung des vDNA mit Cy5 Fluorophor führt zu eine gleiche Ausbeute von Intasomes als unbeschriftete vDNA. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Retroviren INs bilden einen Komplex mit viralen genomischen DNA führen Integration und weiter den viralen Lebenszyklus Multimeric. Die Anzahl der im Monomeren pro Intasome möglicherweise Tetramers, Octamers oder eventuell höhere Ordnung Multimere11,12,13,14. PFV Intasomes sind, dass ein Tetramer des rekombinanten mit doppelsträngigen DNA-Oligomere, die viralen genomischen DNA zu imitieren endet3. Diese Intasomes wurden in Struktur- und dynamische Studien3,5,13,14verwendet.
Die Montage des PFV Intasomes erfolgt während der Dialyse von einem relativ hohen Salzkonzentration Puffer zu einem geringeren Salzgehalt. Dies führt zur Bildung von einen Niederschlag umfasst die PFV Intasomes. Die Intasomes sind durch die Erhöhung der Salzkonzentration solubilisiert. PFV IN nachweislich Monomere in Konzentrationen bis zu 225 µM5sein. Die komplexe sind dann von Monomeren IN isoliert und frei vDNA SEC Wir haben die Reinigung des PFV Intasomes Glycerin in der SEC-Puffer-6enthalten geändert. Die Zugabe von Glycerin ermöglicht die PFV Intasomes für zukünftige Verwendung ohne Verlust der Aktivität (Abbildung 4) eingefroren werden.
Es gibt mehrere wichtige Funktionen dieses Protokolls. Obwohl Proteinreinigung oft bei niedrigen Temperaturen durchgeführt wird, haben wir empirisch festgestellt, dass PFV Intasome Montage ineffizient bei 4 ° c ist. Stattdessen sollte die Montage Dialyse im Bereich von 18-22 ° c auftreten. Es ist auch wichtig, rekombinante PFV IN verwenden, das frei von kontaminierenden Bakterien Nuklease7,8. Zu guter Letzt ist das Verhältnis der IN zu vDNA ein Schlüsselfaktor der Versammlung. Wenn die Proteinkonzentration ab hier niedriger als empfohlene ist, muss die vDNA-Konzentration proportional verringert werden. Es ist, zwar möglich, PFV Intasomes bei niedrigeren Konzentrationen zu montieren müssen die komplexe auf hohem genügend Konzentration für die Erkennung während SEC Trennung sein.
Diese Methode kann für PFV Intasomes mit unbeschrifteten oder beschriftete vDNA verwendet werden. Wir haben festgestellt, dass die vDNA effizient mit einer Fluorophor oder Biotin6bezeichnet werden kann. Andere kleine Molekül-Etiketten können auch möglich sein. Im Falle Cy5 Fluorophor finden wir deshalb mit der Bezeichnung vDNA reduziert die Ausbeute an montierten Intasomes mit der Spitzenkonzentration 10-fache reduziert. Cy5 mit der Bezeichnung vDNA hat intern jedoch eine entsprechende Rendite auf unbeschriftete vDNA. Diese Montage-Methode kann auch mit Punktmutationen oder abschneiden Mutationen des PFV IN4verwendet werden. Da PFV IN gehemmt wird von klinisch relevanten IN Strang Transfer-Inhibitor (INSTI) Medikamente gegen HIV-1 IN, es ist möglich, diese PFV Intasomes zu verwenden, um den Mechanismus der INSTIs3zu studieren. Darüber hinaus treten einige INSTI resistenten Mutationen von HIV-1 IN bei erhaltenen Rückstände in PFV, Studien von Resistenzen mit veränderter PFV Intasomes ermöglicht.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von NIH AI099854 und AI126742 auf Schlüssel unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA Oligomers | IDT | N/A | Custom DNA Oligos |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | Sigma-Aldrich | Z677094-24EA | 3 kDa MWCO |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G37-20 | |
| Gel-loading tips, 1 - 200 μL | Corning | CLS4853-400EA | |
| Razor blade; Single-edged; 100/Pk.; Pack of 100 | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 568-0020 | |
| Dialysis tubing clips | Spectrum Labs | 132734 | |
| 6-8 kDa 10 mm Dialysis Tubing | Spectrum Medical | 132645 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517201 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Hyladder 10kb, 500 lanes | Denville Scientific | CB4225-4 |
References
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