Summary
Hier presenteren we een protocol om te zuiveren van exosomes van plasma en serum met verminderde CO zuivering van niet-exosomal bloedeiwitten. Het geoptimaliseerde protocol bevat ultrafiltratie, protease behandeling en grootte uitsluiting chromatografie. Verbeterde zuivering van exosomes voordelen downstream analyses, met inbegrip van nauwkeuriger kwantificering van blaasjes en proteomic karakterisering.
Abstract
Exosomes, een soort nanovesicle verlost van alle celtypes, kunnen worden geïsoleerd van eventuele lichamelijke vloeistof. De inhoud van exosomes, met inbegrip van eiwitten en de RNAs, zijn uniek voor de cellen waaruit ze zijn afgeleid en kunnen worden gebruikt als indicatoren van ziekte. Verschillende gemeenschappelijke verrijking protocollen, waaronder ultracentrifugatie, opbrengst exosomes beladen met oplosbaar eiwit contaminanten. Specifiek, hebben we geconstateerd dat de meest voorkomende eiwitten in het bloed vaak mede met exosomes zuiveren en kunnen verwarren downstream proteomic studies, frustreert de identificatie van lage overvloed biomerker kandidaten. Is irreproducibility van exosome eiwit kwantificering vanwege inconsistent vertegenwoordiging van niet-exosomal eiwitniveaus extra zorgwekkend. Het protocol hier gedetailleerde werd ontwikkeld voor het verwijderen van niet-exosomal-eiwitten die mede samen met exosomes zuiveren, strengheid toe te voegen aan het zuiveringsproces van exosome. Vijf methodes werden vergeleken met behulp van de gepaarde bloed plasma en serum van vijf donoren. Analyse met behulp van nanoparticle volgen analyse en micro-bicinchoninic zuur eiwit kwantitatieve analyse bleek dat een gecombineerde protocol met behulp van ultrafiltratie en grootte uitsluiting chromatografie het blaasje optimale verrijkings- en oplosbaar eiwit verwijdering leverde. Westelijke bevlekken werd gebruikt om te verifiëren dat de verwachte overvloedige bloedeiwitten, met inbegrip van albumine en apolipoproteins, waren uitgeput.
Introduction
Exosomes zijn nanovesicles (variërend in grootte van 30 nm tot 150 nm) uitgebracht door bijna alle cellen in het menselijk lichaam te vergemakkelijken van cel naar cel communicatie verwerkt1,2. Interessant is dat de samenstelling van de exosomes verandert afhankelijk van de cellen van oorsprong, alsmede de gezondheidsstatus van de individuele3,4,5. Bovendien exosomes kunnen worden opgehaald uit verschillende biologische vloeistoffen zoals: speeksel, urine en bloed2. Vanwege deze kenmerken, exosomes worden beschouwd als een goede bron van ziekte biomarkers. Helaas, er is geen standaard methode voor de isolatie van de exosomes. Sommige laboratoria vinden meerstaps centrifugeren, met een laatste snelle stap bij 100.000 x g met behulp van dichtheid verlopen als de gouden standaard methode om exosome te isoleren. Recente studies hebben echter aangetoond dat ultracentrifugatie induceert aggregatie van exosomes met oplosbare eiwitten en andere exosomes, naast het beïnvloeden van de integriteit van de exosome, die beide kunnen nadelig zijn voor stroomafwaarts toepassingen6,7 . Andere gemeenschappelijke methoden voor exosome isolatie omvatten, maar zijn niet beperkt tot: neerslag door commerciële polyethyleenglycol (PEG) gebaseerd reagentia, centrifugaal ultrafiltratie en grootte-uitsluiting chromatography (SEC). De commerciële reagentia met polyethyleenglycol (PEG) polymeren verrijken exosomes door waardoor ze neerslaan en vormen een pellet. Beperkingen met behulp van dit polymeer zijn besmetting met residuele PEG polymeer en een overvloed van oplosbare niet-exosomal eiwitten in het eindproduct. Ultrafiltratie maakt gebruik van centrifugeren om te zuiveren en het concentreren van de blaasjes met een cellulose membraan; exosomes blijven behouden boven het filter, terwijl kleinere onzuiverheden en andere eiwitten de membraan7,8 doorheen. Net als andere methoden heeft centrifugaal ultrafiltratie een beperkte capaciteit voor het zuiveren van exosomes als gevolg van de handhaving van hoge niveaus van niet-exosomal eiwitten, met inbegrip van eiwitcomplexen en aggregaten. Ten slotte gebruikt de SEC zuivering poreuze hars te scheiden van moleculen door grootte. SEC heeft aangetoond veelbelovende resultaten, het overwinnen van de meeste van de problemen die met andere methoden door het vastleggen van de meerderheid van hun gehalte aan verontreinigingen eiwitten en het behoud van de integriteit van de exosomal, aangezien isolatie is gebaseerd op de zwaarte of de lagedruk systemen7, 9. De co Isolatievan groter eiwit, aggregaten en lipoproteïnen10 tijdens SEC heeft echter gevolgen voor de zuiverheid van de voorbereiding van de definitieve exosome. Terwijl sommige methoden zijn getest voor exosome zuivering van cel cultuur supernatant en plasma7, of alleen plasma9,11, is er geen informatie over de prestaties van methoden rechtstreeks vergelijken van bloed plasma en serum van dezelfde persoon.
Hier, richten we ons op de zuivering van bloed exosomes door het vergelijken van een verscheidenheid van werkstromen om te bepalen of blaasje verrijking technieken vertaalbare tussen plasma en serum. Nanoparticle voor het bijhouden van analyse en westelijke vlek werden gebruikt om het kwantificeren van de verschillen in exosome eiwit concentratie en zuiverheid samenstelling in de eindproducten. De laatste methode, beschreven in dit protocol, verhoogt vesikel nummers en vermindert van niet-exosomal eiwitniveaus. Nog belangrijker is, wordt een drastische vermindering van de gemeenschappelijke co neerslagmiddel eiwitten, met inbegrip van albumine en apolipoproteins aangetoond. De hoge overvloed van deze twee eiwitten in het bloed en de frequentie waarop zij mede met exosomes oorzaken inconsistenties tussen de "zuivere" monsters zuiveren, scheeftrekken van de stroomafwaartse analyses. Dit protocol omvat het gebruik van een commercieel beschikbare SEC hars; de hars is samengesteld uit poreuze parels waarin eiwitten kleiner dan 700 kDa de parels kunnen invoeren. Eenmaal binnen, de eiwitten worden behouden door een octylamine ligand. Het eluaat bestaat uit exosomes en moleculen groter dan 700 kDa12. Bovendien ter beperking van de eiwit-aggregaten en apolipoproteins die kraal overlapping onttrekken, nemen we een protease spijsvertering stap in de werkstroom. Op dit moment is er niet één techniek staat het maximaliseren van de opbrengst van de exosome terwijl het verminderen van mede zuiverende niet-exosomal-eiwitten. Deze studie toont aan dat een zuivering protocol dat een protease spijsvertering voorbehandeling met meerdere methoden voor herstel en zuivering combineert kan worden gebruikt om exosome rendement en zuiverheid van het bloed, serum en plasma te verhogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit werk werd vastgesteld niet menselijke onderwerp onderzoek op de initiële beoordeling van Colorado State University's institutionele Review Board (IRB), als alle menselijke specimens werden verkregen als de geïdentificeerde monsters uit de biorepository van de Bioreclamation IVT en waren verzameld onder de IRB goedgekeurde protocollen.
1. bereiding van ruwe monster (Plasma of Serum) door grotere blaasjes pillering en cellulaire puin
Opmerking: Veiligheid van de behandeling: serum, plasma en andere biologische vloeistoffen zijn biohazardous materialen en moeten worden behandeld met speciale zorg, terwijl het dragen van fundamentele persoonlijke beschermende uitrusting, zoals handschoenen en laboratoriumjas. Het is sterk aanbevolen dat biologische monsters worden verwerkt in een bioveiligheid kabinet; Als dat niet beschikbaar is, het gebruik van oogbescherming wordt aanbevolen.
- Een serum of een plasma monster equilibreer door het plaatsen van de buis onder omstandigheden niet schudden in een koelkast 4 ° C's nachts (van beide -20 of opslag-80 ° C).
- Aliquot 250 µL van het monster in de buis van een microcentrifuge met behulp van een precisiepipet 1.000 µL.
- Centrifugeer het monster bij 18.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
- Met behulp van een pipet 200 µL, 200 µL van het supernatans dat gewiste verwijderen en toevoegen aan een nieuwe microcentrifuge buis. Vermijd Ingehuld materiaal tijdens het overzetten van de bovendrijvende substantie. Gooi het Ingehuld materiaal.
- Het kwantificeren van het eiwitgehalte van het monster door bicinchoninic zuur (BCA) assay, met behulp van de fabrikant-protocol. Voor het uitvoeren van de bepaling, Verdun de monster 1:50 in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Test elk monster in tweevoud.
Opmerking: Gebruik 1 x PBS in het gehele protocol, tenzij anders vermeld. 200 µL van geklaarde serum of plasma (na 18.000 x g) levert gemiddeld 15 mg van totale proteïne. Andere types van het monster, met hoger of lager eiwitgehalte, wellicht extra BCA verdunningen. - Aliquot 10 mg van het monster af in een nieuwe microcentrifuge buis. Gebruik de concentratie in stap 1.5 verkregen voor het berekenen van de corresponderende hoeveelheid van het monster. Aliquot het monster met behulp van een precisiepipet 200 µL.
Opmerking: Het is raadzaam om op te slaan van het resterende monster bij-80 ° C. Aliquot het monster in verschillende buisjes met 10 mg per buis om te voorkomen dat meerdere bevriezen-ontdooien cycli in de toekomst gebruiken.
2. de vertering van niet-exosomal bloedeiwitten
Opmerking: De spijsvertering stap is ontworpen voor het verminderen van de niet-exosomal-eiwitten die samen met de exosomes kunnen zuiveren. Als behoud van exosome oppervlakte-eiwitten vereist voor downstream analyses is, moet het worden rekening gehouden met die deze stap het potentieel heeft om het verstoren van deze analyse. De detectie van de exosomal CD63, een oppervlak-blootgesteld tetraspanin eiwit, was niet significant negatief beïnvloed door dit proces.
- Bereid proteïnase K-oplossing bij een concentratie van 500 µg/mL in PBS. Voeg de overeenkomstige hoeveelheid proteïnase K in een conische buis. Voeg vervolgens de buffer en de vortex voor 30 s, 3 x bij kamertemperatuur.
- Voeg 50 µL van proteïnase K-oplossing aan het 10-mg monster aliquoot en meng zachtjes door pipetteren op en neer met behulp van een precisiepipet µL 200.
- Incubeer het monster bij 37 ° C in een waterbad voor 30 min. plaats de buis in een float buis rek en volledige onderdompeling van buis in het waterbad om eventuele lekkage te voorkomen.
- Overbrengen van het monster en zwevende buis rack een bad met water van 60 ° C gedurende 10 minuten, om de inactivering van het proteïnase K.
3. verwijdering van kleine proteïnen en Peptides door Centrifuge ultrafiltratie
- Een apparaat van de ultrafiltratie met 100 kDa molecuulgewicht cut-off (MWCO) filter met PBS vóór gebruik spoelen. Hiervoor 500 µL van PBS toe te voegen aan het filter, met behulp van een precisiepipet 1.000 µL. Draai het apparaat op 3700 x g voor 5 min. Discard eventuele resterende retentate evenals het eluaat.
Opmerking: De capaciteit van het volume van het monster van de ultrafiltratie apparaat moet 0,5 mL - 4 mL om ervoor te zorgen dat het volume van de uiteindelijke gereduceerde monster van 50 µL haalbaar is. - Neem het voorbeeld uit stap 2.4 en verhoog het volume aan 500 µL door PBS toe te voegen. Pipetteer het monster in het vooraf gespoeld ultrafiltratie apparaat.
Opmerking: Gemiddeld is het monstervolume uit stap 2.4 185 µL (120 tot 150 µL van monster en 50 µL van proteïnase K-oplossing). - Plaats het ultrafiltratie apparaat in een vaste hoek benchtop centrifuge bij 3700 x g bij 4 ° C, totdat het monster heeft een volume van 50 µL verminderen.
Let op: Bij het gebruik van ultrafiltratie apparaten met dode stop volume, moet worden gezorgd om te voorkomen dat volledige droogheid van het membraan filter tijdens centrifugeren stappen. - Voeg 500 µL van PBS rechtstreeks in de filter membraan en Pipetteer op en neer 5 keer. Centrifugeer zoals in stap 3.3. Voer deze stap was een totaal 3 keer.
- Overdracht van de laatste 50 µL retentate in een nieuwe microcentrifuge buis.
- Spoel het membraan filter met 200 µL PBS, pipetting op en neer 10 keer, en het wassen aan de buis van stap 3.5 overbrengen.
- Plaats de filterhouder in de omgekeerde positie in een nieuwe buis. Een omgekeerde spin herstel voor 5 min op 2.000 x g resterende monster ophalen uit het membraan uitvoeren. Het zwembad van het monster met het monster uit stap 3.5.
4. zuivering van blaasjes by Size Exclusion Chromatography (SEC)
- Voeg 850 µL van SEC drijfmest, met kralen met een MWCO van 700 kDa, in een lege, afgetopte zwaartekracht stroom kolom met behulp van een precisiepipet 1.000 µL. Plaats de kolommen in een formaat geschikt rek is voorzien van een lekbak.
- Open de onderkant van de kolom en laat de vloeistof afvoer voor 5 min. Zodra uitgedropen, voeg toe 10 mL PBS te wassen de hars. 20 min voor het wassen voor de afvoer van de kolom toestaan.
- Plaats de geconcentreerde, proteïnase K behandeld monster uit stap 3.5 in een conische buis 15 mL, en verhoog het monstervolume tot 5 mL PBS toe te voegen met een serologische pipet. Mengen van de tube zachtjes door rocken voor 1 min en vervolgens langzaam het toepassen van het monster op de kolom die in stap 4.2 met een serologische pipet voorbereid.
Opmerking: Zodra het GLB van de kolom wordt verwijderd, zal het monster stromen door de hars door de zwaartekracht; het 5-mL monster zal volledig doorstromen van de kolom in 10 min. - Het verzamelen van de stroom door middel van een nieuwe conische tube van 15 mL.
- Met behulp van een serologische precisiepipet, toepassing het verzamelde materiaal op het hars opnieuw te verwijderen van alle resterende materiaal onder 700 kDa.
- Het verzamelen van de stroom door middel van een nieuwe conische tube van 15 mL. Wassen van de hars tweemaal de toevoeging van 1 mL PBS. Verzamelen van de stroom door in de buis uit stap 4,5; de totale eindvolume zullen ongeveer 7 mL.
Opmerking: Na stap 4.6, zal het monster worden verdund ongeveer 35 keer van het oorspronkelijke monstervolume; de volgende stappen zal het volume te verlagen en concentreren van het gezuiverde exosome monster.
5. de concentratie van het gezuiverde Exosomes en totale proteïne kwantificering
- Spoel een ultrafiltratie apparaat met een 3 kDa MWCO filter met PBS vóór gebruik, zoals beschreven in stap 3.1.
- In het voorbeeld uit stap 4.6 toevoegen aan de ultrafiltratie apparaat en centrifuge in een swingende-emmer rotor bij 3700 x g bij 4 ° C. Buffer zal het filter passeren en kan worden verwijderd. Geconcentreerd exosomes bewaard boven het filter. Centrifugeer het monster totdat het volume boven het filter (retentate) is teruggebracht tot 200 µL.
- De retentate overbrengen in een nieuwe microcentrifuge buis.
- Spoel het membraan filter met 200 µL PBS door pipetteren over het membraan 10 keer en het wassen te brengen naar de buis vanaf stap 5.3. Dit zal zorgen voor de verzameling van alle resterende exosome monster.
- Brengen monstervolume tot 500 µL door PBS toe te voegen. Meng door langzaam pipetteren op en neer 10 keer.
Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Monsters moeten worden bewaard bij 4 ° C's nachts of bij-20 /-80 ° C voor lange termijn opslag. - Het kwantificeren van het eiwitgehalte van het monster door BCA assay, met behulp van de fabrikant-protocol. Verdun de monster 1:10 en 1:50 in PBS. Elk monster in duplo worden uitgevoerd.
Opmerking: Beginnen met 10 mg van totale proteïne van serum of plasma, is het rendement van de totale proteïne in gezuiverde exosomes uit stap 5.6, gemiddeld 150 µg. extra verdunningen kunnen nodig zijn als de andere monsters dan serum of plasma worden gebruikt; opbrengst kan variëren met monster type.
6. kwantificering en dimensionering van Exosomes door Nanoparticle analyse (NTA) bijhouden
- Meng 5 µg gezuiverde exosomes (zoals gekwantificeerd in 5.6) 1 mL PBS en vortex voor 15 s op laag-medium snelheid.
- Leg het monster in een wegwerp injectiespuit 1 mL. Indien beschikbaar, ingesteld de spuit in een automatische-spuitpomp ingesteld op het injecteren van het monster van de verdunde exosome bij een snelheid van 30 µL/min.
- NTA metingen met behulp van video-opname-instellingen uit te voeren: scherm winst van 3-4 en camera niveau van 12-13.
- Definiëren van het script voor analyse uitvoeren van de drie technische wordt gerepliceerd voor een minimum van 30 s met behulp van een constante stroom voor elke repliceren. Voor de analyse, stelt u de drempel vastleggen op 5.
Opmerking: Details over het gebruik van de automatische spuit, en de instellingen voor video-opname zijn beschikbaar in het referentie-13. Instellingen voor vastleggen en analyse voor NTA moet consequent zijn in verschillende verschillende steekproeven te verzekeren van de vergelijkbaarheid.
7. bepaling van de vermindering van de oplosbaar eiwit
- 1-10 µg gezuiverde exosomes aan SDS monster buffer toevoegen en het uitvoeren van polyacrylamide gelelektroforese (pagina) met behulp van een 4-12% Bis-Tris Gel in 1 x MES SDS uitvoeren buffer gedurende 35 min. op 200 V. Transfer opgelost eiwitten aan een nitrocellulose 0,2 µm membraan door toepassing van een spanning-o f 50 V voor 1-1,5 h. westelijke vlekkenanalyse uitvoeren om te evalueren van de aanwezigheid van albumine, apolipoproteins A en B en de exosome markering CD 63 na standaard methoden.
Opmerking: Volledige protocollen voor de methoden in 7.1 kunnen worden gevonden in verwijzing14; specifiek, SP007: lopen van polyacrylamide gels en SP011: westelijke vlek protocol. - Scheiden van 10 µg gezuiverde exosomes via pagina zoals in stap 7.1 en vlekken van de eiwit-bands coomassie kleurstof, met volgende standaard aanbevelingen, om te visualiseren van eiwitten variatie en vermindering tussen de monsters.
Opmerking: Nadere details betreffende het protocol voor westelijke vlekken specifiek voor CD63 zijn beschreven door Diaz et al. 15
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hieronder gepresenteerde gegevens zijn verkregen met behulp van de gepaarde plasma en serum monsters van vijf gezonde bloeddonoren. Om te bepalen van de gevolgen van elke stap van de verwerking, vijf variaties van het voorgestelde protocol werden uitgevoerd, en exosome terugwinning en niet-exosome eiwit verwijdering werden vergeleken. De methoden trialed inbegrepen: 1) SEC 700 kDa + ultrafiltratie 3 kDa; 2) ultrafiltratie 100 kDa; 3) proteïnase K + ultrafiltratie 100 kDa; 4) SEC 700 kDa + ultrafiltratie 100 kDa en 5) proteïnase K + ultrafiltratie 100 kDa + SEC 700 kDa ultrafiltratie 3 kDa.
Alle methoden waarbij SEC 700 kDa (1, 4 en 5) geproduceerd collectief, een significant hoger aantal blaasjes per microgram eiwit in beide soorten monster, serum en plasma (figuur 1A-B). Methode 5 gegenereerd echter een aanzienlijk groter aantal blaasjes per microgram van plasma in vergelijking met serum (Figuur 1 c). Omgekeerd, de eiwitconcentratie in gezuiverde exosome monsters aanzienlijk lager was tijdens het gebruik van de SEC 700 kDa gebaseerde methoden (1, 4 en 5). One-way ANOVA en Tukey van meerdere vergelijkingen tests is gebleken dat de definitieve eiwitconcentratie na methoden 2 en 3 aanzienlijk hoger is dan de definitieve eiwitconcentratie na de methoden 1, 4 en 5 waren (p < 0,001). De verschillen waren consistent met behulp van plasma of serum, echter met methode 1 de laatste eiwitconcentratie van gezuiverde exosomes was beduidend hoger (t-test, p < 0.05) bij het gebruik van serum (figuur 2A). Om te beoordelen de eiwit verdeling van gezuiverde exosomes door de verschillende vijf methoden, 10 µg monster uit elke methode waren opgelost in een pagina en gekleurd met coomassie kleurstof. De resultaten suggereren dat de meerderheid van het eiwit aanwezig in de "zuivere exosomes" van de methoden 2 en 3 albumine aangegeven door de sterke band ~ 65 kDa (figuur 2B).
De volgende stap was om te bevestigen de toename in zuiverheid van geïsoleerde exosomes gebaseerd op de aanwezigheid van de albumine, de overvloedigste eiwit in het bloed. Het proces van ultrafiltratie toonde een aanzienlijke concentratie van albumine in de exosomal-fractie die gedeeltelijk werd verminderd met vooraf behandeling van het monster met proteïnase K (figuur 3A, rijstroken S en P). De opneming van SEC 700 kDa daarbij daalde de hoeveelheid albumine (figuur 3A, rijstroken P1/S1 en P4/S4) maar de combinatie van SEC 700 kDa proteïnase K en ultrafiltratie bleek de meest efficiënte verwijdering van albumine uit gezuiverde exosomes ( Figuur 3A, lane P5/S5). Recente studies hebben aangetoond dat apolipoproteins tijdens exosome zuivering10,16ook vaak mede geïsoleerd worden. In het bijzonder ApoB, die in lage dichtheid lipoproteïnen aanwezig is, bleek zeer geconcentreerd in gezuiverde exosomes van menselijk bloed10. We geëvalueerd daarom het co isolement van de lipoproteïnen ApoB en ApoA-1. Ultracentrifugatie methoden en de combinatie van ultracentrifugatie en SEC 700 kDa toonde een vergelijkbaar bedrag van ApoB in vergelijking met het bedrag dat is gedetecteerd in serum en plasma door westelijke vlek (figuur 3B, rijstroken P1/S1, P2/S2 en P4/S4; Aanvullende cijfers 1/2). Interessant is dat resulteerde de toevoeging van proteïnase K in de volledige afbraak van ApoB uit de gezuiverde monster (figuur 3B, rijstroken P3/S3 en P5/S5). Ook was ApoA-1, de belangrijkste eiwit component van hoge dichtheid lipoproteïnen in menselijk plasma, verminderd met alle methoden waarbij SEC 700 kDa of proteïnase K (Figuur 3 c). Hoewel, net als de albumine, kon de 100 MWCO ultrafiltratie afkan aanzienlijk verminderen de hoeveelheid CO zuiveren van ApoA-1.
Tot slot, om te bepalen van het effect van proteïnase K op proteïnen blootgesteld aan de externe membraan van exosomes, we geëvalueerd de aanwezigheid van de CD63 tetraspanin, een proteïne waarmerk van exosomes. Een analyse van Western blots bleek dat het eiwit was niet alleen in de methoden met behulp van proteïnase K (figuur 3D, rijstroken P3/S3 en P5/S5) aantoonbaar, maar de bands voor CD63 met behulp van de methode 5 had een meer intense signaal (figuur 3D, rijstroken P5/S5). Deze bevinding suggereert methode 5 levert een hogere concentratie van exosomes of de toename van CD63 antilichamen bindende als gevolg van de daling van de eiwit-aggregaten die is gekoppeld aan het exosome oppervlak.
Figuur 1 : Exosome opbrengst van plasma en serum na vijf verschillende zuivering methoden. (A) concentratie van exosomes verkregen uit plasma (n = 5). (B) concentratie van exosomes verkregen serum (n = 5). ()C) vergelijking tussen het aantal exosomes per microgram van eiwitten uit 5 gekoppelde sets van plasma en serum. Nummers op de x-as vertegenwoordigen elke methode gebruikt, 1 = SEC 700 kDa + ultrafiltratie 3 kDa; 2 = ultrafiltratie 100 kDa; 3 = proteïnase K + ultrafiltratie 100 kDa; 4 = SEC 700 kDa + ultrafiltratie 100 kDa en 5 = proteïnase K + ultrafiltratie 100 kDa + SEC 700 kDa ultrafiltratie 3 kDa. In A en B, de verschillen werden berekend door one-way ANOVA en Tukey's meerdere vergelijkingen proeven. In C, werden de verschillen tussen serum en plasma per methode berekend door t-test. p < 0,05; Foutbalken: 95% betrouwbaarheidsinterval. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Eiwit opbrengst in gezuiverde exosomes van plasma en serum gebruik van vijf verschillende methoden. (A) vergelijking van het rendement van de totale proteïne in het gezuiverde exosomes is afkomstig van plasma en serum (n = 5). (B) representatief beeld van een coomassie kleuring van 10 µg gezuiverde exosomes opgelost door SDS-PAGE; n = 1, gekoppeld plasma en serum. Getallen in de afbeelding geven elke methode 1 = SEC 700 kDa + ultrafiltratie 3 kDa; 2 = ultrafiltratie 100 kDa; 3 = proteïnase K + ultrafiltratie 100 kDa; 4 = SEC 700 kDa + ultrafiltratie 100 kDa en 5 = proteïnase K + ultrafiltratie 100 kDa + SEC 700 kDa ultrafiltratie 3 kDa. In A, werden de verschillen tussen plasma en serum verkregen monsters berekend door t-test. p < 0.05. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Vermindering van de normale verontreinigingen van exosomes geïsoleerd uit menselijk bloed of stabiliteit van de hallmark-proteïne CD63. Westelijke vlek evaluatie van: (A) albumine, 1 µg per rijstrook; (B) apolipoproteïne B, 1 µg per rijstrook; en (C) apolipoproteïne A1, 10 µg per rijstrook; (D) CD63, 1 µg per rijstrook. L = Ladder; S = ruwe serum; P = ruwe plasma. Gezuiverde exosome: zuivering met behulp van 5 verschillende methoden. Getallen in de afbeelding geven elke methode 1 = SEC 700 kDa + ultrafiltratie 3 kDa; 2 = ultrafiltratie 100 kDa; 3 = proteïnase K + ultrafiltratie 100 kDa; 4 = SEC 700 kDa + ultrafiltratie 100 kDa en 5 = proteïnase K + ultrafiltratie 100 kDa + SEC 700 kDa ultrafiltratie 3 kDa. Representatieve resultaten uit de gepaarde serum of plasma van één patiënt; trends werden consistente tussen donor monsters. Eiwit laden gevarieerd door vlek; normalisatie was gebaseerd op BCA bepaling van de concentratie van de totale steekproef. Totaal eiwit belasting per rijstrook is opgegeven voor elke vlek. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende Figuur 1: origineel ongecoupeerde westelijke vlekken uit Figuur 3. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende Figuur 2: dichtheid kwantificering van albumine, ApoB, ApoA-1 en CD63 bands uit Figuur 3; ImageJ software werd gebruikt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een geoptimaliseerde methode om te verhogen, de zuiverheid en het rendement van exosomes uit bloed zal het verhogen van het vermogen om nauwkeurig de mijne van extracellulaire blaasjes als een bron van biomarkers voor verschillende ziekten. De standaardmethoden momenteel gebruikt voor het isoleren van exosomes, in het bijzonder ultracentrifugatie en neerslag methoden, hebben verscheidene nadelen met inbegrip van bundeling van exosome en pillering van oplosbare eiwitten7,17, 18. Als alternatief, het gebruik van de SEC blijkt een aanzienlijke verbetering in exosome isolatie, bescherming van exosomes van aggregatie, en verbetering van de verwijdering van gemeenschappelijke verontreinigingen niet-exosomal eiwitten9,11,18 , 19. apolipoproteins10, grotere blaasjes en eiwit-aggregaten, met inbegrip van albumine, zijn echter vaak mede geïsoleerd met exosomes, als SEC alleen wordt gebruikt. Twee kritische stappen in de gepresenteerde protocol steun bij het overwinnen van de laatste twee genoemde beperkingen. Ten eerste, het centrifugeren van het plasma of serum monster bij 18.000 x g precipitaten allermeest naar de grotere blaasjes aanwezig in het monster. Ten tweede, de voorbehandeling van serum of plasma monsters met proteïnase K, een serine protease met brede specificiteit20, is cruciaal voor het verminderen van de hoeveelheid albumine en de apolipoproteins A-1 en B gekoppeld aan de exosomes tijdens het zuiveringsproces ongehinderd. We het gebruik van het proteïnase K in combinatie met een stap van de ultrafiltratie met een membraan met een MWCO van 100 kDa gedeeltelijk Elueer kleine eiwitten en peptiden, en vervolgens aangepast we het gebruik van een SEC-hars met een MWCO van 700 kDa verder duidelijk kleinere peptiden/proteïnen uit de exosomes. Deze hars, oorspronkelijk geoptimaliseerd voor de isolatie van het virus, vangt de resterende grote eiwitten en/of complexen onder 700 kDa. Het beginsel van de isolatie van deze SEC hars kan een zachte herstel van de exosomes, omdat de stroom van het monster door de hars wordt gedreven door de zwaartekracht. Dit zorgt voor minder aggregatie en de ingehouden integriteit van de exosomes, het overwinnen van twee van de belangrijkste beperkingen van ultracentrifugatie gebaseerde methoden. Tot slot, het werd aangetoond door Baranyai et al. dat de verdunning van het plasma vóór de verwerking van de SEC exosome herstel21 verbetert. In dit protocol, die we hebben opgenomen een verdunning stap vóór SEC te verhogen de contacttijd van het monster met de hars.
Een belangrijke beperking van de gepresenteerde protocol is de potentiële vertering van eiwitten in het membraan van de exosomal door proteïnase K behandeling. Dit kan afbreuk doen aan downstream experimenten als oppervlak-blootgesteld membraaneiwitten vereist voor downstream analyses zijn, met inbegrip van de westelijke vlek, ELISA, of stroom cytometry. Om te testen gedeeltelijk het effect van proteïnase K op verbonden membraaneiwitten, geanalyseerd wij de protease-behandelde monsters op de aanwezigheid van CD63, een tetraspanin eiwit, die normaal aanwezig zijn in exosomes. Deze resultaten toonden aan dat gebruik van proteïnase K met de beschreven voorwaarden van spijsvertering tijd en concentratie niet heeft geleid tot aanzienlijke verslechtering van de CD63. Verdere evaluatie van membraan-geassocieerde proteïne stabiliteit op basis van specifiek onderzoeksinteresses zullen echter vereist.
Kortom, biedt het voorgestelde protocol diverse voordelen ten opzichte van de huidige bestaande methoden. Elke stap in het protocol opgenomen in onafhankelijke studies is gebleken dat zij heilzaam zijn voor de zuiverheid van de exosomes: pillering van grotere blaasjes, serum of plasma verdunning en SEC. Additionally, zoals hierboven vermeld, een proteïnase spijsvertering stap was opgenomen om te verwijderen apolipoproteins en eiwit-aggregaten, evenals een concentratie stapsgewijs aan het einde van het zuiveringsproces dat de voordelen van de stabiliteit van de exosome en de opbrengst. Tot slot, dit protocol kunnen gemakkelijk aangepast aan isoleren exosomes van grotere volume monsters zoals urine of cell supernatant van cultuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door de interne middelen van CSU (aan KMD), ATCC contract #2016-0550-0002 (een toeleveringscontract van NIAID HHSN272201600013C), en de Bill en Melinda Gates Foundation (OPP1039688) (tot KMD/NKG). Wij danken de NSF onderzoekervaring voor studenten (REU) zomerprogramma bij Colorado State University voor aanvullende ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nanosight | Malvern | NS300 | |
| Benchtop microcentrifuge | Thermo | Legend Mico21 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Waterbath | Benchmark | B2000-4 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23227 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23235 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD-Millipore | UFC510096 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD-Millipore | UFC800324 | |
| Capto Core 700 | GE Healthcare | 17548103 | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | BIORAD | 7311550 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | THERMO | NP0323BOX | |
| Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm | BIORAD | 1620112 | |
| Proteinase K, Tritirachium album | EMD-Millipore | 539480 | |
| SimplyBlue SafeStain | THERMO | LC6065 | |
| SIGMAFAST BCIP/NBT | Millipore-SIGMA | B5655 | |
| 4-Chloro-1-naphthol | Millipore-SIGMA | C6788 | |
| Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody | SYSTEM BIOSCIENCES | EXOAB-CD63A-1 | Primary and secondary antibodies |
| ALB Antibody (F-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-271605 | Primary antibody |
| apoB Antibody (C1.4) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-13538 | Primary antibody |
| apoA-I Antibody (B-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-376818 | Primary antibody |
References
- Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., Raposo, G. The biogenesis and functions of exosomes. Traffic. 3 (5), 321-330 (2002).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Schorey, J. S., Harding, C. V. Extracellular vesicles and infectious diseases: new complexity to an old story. J Clin Invest. 126 (4), 1181-1189 (2016).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. Exosome platform for diagnosis and monitoring of traumatic brain injury. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1652), (2014).
- Nilsson, J., et al. Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer. Br J Cancer. 100 (10), 1603-1607 (2009).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 4, 29509 (2015).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
- Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. A., Jones, M., Clayton, A. Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27269 (2015).
- Sódar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Sci Rep. 6, 24316 (2016).
- de Menezes-Neto, A., et al. Size-exclusion chromatography as a stand-alone methodology identifies novel markers in mass spectrometry analyses of plasma-derived vesicles from healthy individuals. J Extracell Vesicles. 4, 27378 (2015).
- Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Scientific Reports. 7 (1), 11561 (2017).
- Nanosight Ltd. NanoSight NTA 2.1 Analytical Software, Operating Manual. , Available from: http://nanobio.physics.ucsb.edu/pdfs/equipment/Nanosight%20NTA2.1%20software%20manual.pdf (2010).
- Dobos, K. Production Manuals & SOPs. , Available from: http://csu-cvmbs.colostate.edu/academics/mip/research/Pages/dobos-lab-production-manuals-sops.aspx (2017).
- Diaz, G., Wolfe, L. M., Kruh-Garcia, N. A., Dobos, K. M. Changes in the Membrane-Associated Proteins of Exosomes Released from Human Macrophages after Mycobacterium tuberculosis Infection. Sci Rep. 6, 37975 (2016).
- Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).
- Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. J Immunol Methods. 411, 55-65 (2014).
- Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Sweeney, P. J., Walker, J. M. Proteinase K (EC 3.4.21.14). Methods Mol Biol. 16, 305-311 (1993).
- Baranyai, T., et al. Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods. PLoS One. 10 (12), e0145686 (2015).
