Summary
Ce protocole illustre une procédure sûre et efficace pour modifier CD133+ des cellules souches hématopoïétiques. Présenté non-virale, magnétique polyplex approche fondée sur le peut fournir une base pour l’optimisation des effets thérapeutiques des cellules souches, aussi bien en ce qui concerne le suivi du produit cellule administré par imagerie par résonance magnétique.
Abstract
Tandis que CD133+ de cellules souches hématopoïétiques (SCs) ont fait leurs preuves à fournir à fort potentiel dans le domaine de la médecine régénérative, leur taux de rétention faible après une injection à l’endommagement des tissus ainsi que les taux de mortalité cellulaire massive observée conduire à très effet thérapeutique limité. Pour surmonter ces limitations, nous avons cherché à établir un protocole de base non viraux d’ingénierie cellulaire appropriée avant leur administration. La modification des CD133 humaine+ exprimant SCs à l’aide de microARN (miR) chargé polyplexes magnétique a été adressée en ce qui concerne l’efficacité d’absorption et de sécurité, mais aussi le potentiel de ciblage des cellules. S’appuyant sur notre protocole, nous pouvons atteindre les vitesses d’absorption miR haute de 80 à 90 %, tandis que le CD133+ propriétés de cellules souches ne sont pas affectées. En outre, ces cellules modifiées offrent l’option de ciblage magnétique. Nous décrivons ici une procédure sûre et très efficace pour la modification des CD133+ SCs. Nous espérons que cette approche visant à fournir une technologie standard pour l’optimisation des effets thérapeutiques des cellules souches ainsi que la surveillance du produit administré cellulaire par l’intermédiaire de l’imagerie par résonance magnétique (IRM).
Introduction
CD133+ SCs représentent une population de cellules souches et progénitrices hétérogène avec promettant potentiel pour la médecine régénérative. Leur différenciation hématopoïétique et endothéliales myogène potentiels1,2,3 permet le CD133+ cellules, par exemple, de contribuer au processus de néovascularisation par différenciation dans nouvellement formant des navires et l’activation de pro-angiogénique signalisation paracrine mécanismes4,5,6,7.
Malgré leur fort potentiel démontré dans plus de 30 essais cliniques approuvés (ClinicalTrails.gov), leur résultat thérapeutique est encore en discussion controversée4. En effet, une application clinique des SCs est entravée par la faible rétention dans l’organe d’intérêt et de la cellule initiale massif mort5,8,9. Supplémentaires d’ingénierie de CD133+ SCs avant transplantation pourrait aider à surmonter ces défis.
Une condition sine qua non pour une thérapie cellulaire efficace serait la réduction de la mort massive de cellules initiales afin d’améliorer la prise de greffe de cellules pertinentes thérapeutique10. Les études en cours ont démontré une perte immense cellule de 90 à 99 % dans fortement perfusés organes comme le cerveau et le coeur pendant les premières heures de 1 – 2, indépendamment du type de cellules transplantées ou application itinéraire11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21. SC étiquetage utilisant des nanoparticules magnétiques (MNPs) permet une stratégie novatrice et non invasif pour cibler les cellules sur le site d’intérêt22,23,24,25,26 et permet simultanément de cellule de surveillance à l’aide de MRI27 et des particules magnétiques d’imagerie (MPI). Le plus efficace in vivo études appliquant cellule aimantée ciblant la rétention de la cellule utilisée après administration locale plutôt que de l’orientation de la cellule après injection intraveineuse23,24,28 . Par conséquent, notre groupe a conçu un système de livraison consistant de nanoparticules d’oxyde de fer superparamagnétique29. Avec cette technique, CD133+ SCs et les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) pourraient être efficacement ciblées, comme l’a montré in vitro tente30,31.
Un autre obstacle pour les thérapies de SC est l’environnement hostile inflammatoire des tissus touchés après la transplantation, qui contribue à la cellule initiale mort32. En plus de plusieurs études de préconditionnement, l’application des thérapeutiques pertinentes miRs était testé33; Il a été démontré avec succès qu’anti-apoptotique miRs inhibent l’apoptose in vitro et d’améliorent la prise de greffe cellulaire in vivo33. Ces petites molécules, composés de 20 à 25 nucléotides, jouent un rôle crucial en tant que modulateurs post-transcriptionnelle des ARN messagers (ARNm) et affectent donc cellules souches sort et le comportement34. En outre, l’introduction exogène de miRs éviter l’intégration stable indésirable dans le génome de hôte34.
Les tentatives actuelles pour la mise en place efficace des acides nucléiques (NAs) dans SCs primaires reposent principalement sur des virus recombinants8,35. Malgré l’efficacité de transfection haute, manipulation virus recombinant présente un obstacle majeur pour un chevet à traduction, par exemple, l’expression des gènes incontrôlable, pathogénicité, immunogénicité et mutagenèse insertionnelle35 ,,36. Par conséquent, les vecteurs non viraux tels que les constructions à base de polymères sont essentiels d’élaborer. Parmi ceux-ci, polyéthylènimine (PEI) représente un véhicule de livraison valide offrant des avantages pour miRs tels que de la condensation de NA à protéger d’une dégradation, assimilation, et intracellulaire par endosomale échapper37,38. En outre, des complexes de miR-PEI a démontré une biocompatibilité élevée dans les essais cliniques39. Par conséquent, notre système de livraison comprend une biotinylé ramifiés 25 kDa PEI lié à une streptavidine MNP-core30,31,40.
Dans ce manuscrit, nous présentons un protocole complet décrivant (i) l’isolement manuelle des CD133+ SC de don de moelle osseuse humaine (BM) avec une caractérisation détaillée du produit SC et (ii) une stratégie de transfection efficace et doux d’une système de livraison magnétiquement non-virales base de polymères pour le génie génétique de CD133+ SCs à l’aide de miRs. CD133+ SCs sont isolées et magnétiquement enrichi de humaine ponction sternale de BM en utilisant une surface axée sur les anticorps magnétique-lancée de cellules (MACS) système de tri. Par la suite, la viabilité des cellules ainsi que la pureté de la cellule est analysée à l’aide de cytométrie en flux. Par la suite, miR/PEI/MNP complexes sont préparés et CD133+ SCs sont transfectées. 18 h après la transfection, l’efficacité de l’absorption et l’impact de la transfection sur SC marqueur expression et cellule de viabilité sont analysés. En outre, l’évaluation de la distribution intracellulaire des composés complexes transfection est effectuée illumination structurée microscopes (SIM) et de quatre couleurs d’étiquetage.
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Protocol
Sternal BM humaine pour l’isolement des cellules proviennent de donateurs informés, qui ont donné leur consentement écrit à utiliser leurs échantillons pour la recherche conformément à la déclaration d’Helsinki. Le Comité d’éthique de l’Université de Rostock a approuvé l’étude présentée (Règl. n° A 23 2010, prolongée en 2015).
1. préparation de la cellule
Remarque : Utilisez Héparine sodique (250 UI/mL BM) pour éviter la coagulation pour l’examen de la BM.
- CD133+ SC isolement
- Préparation de solutions requises
- Préparer en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) / acide tétraacétique (EDTA) stock solution (2 mM) en mélangeant 996 mL de PBS 1 x avec 4 mL d’EDTA (0,5 M). Vigoureusement mélanger la solution et le filtrat à l’aide d’un filtre de 0,45 µm. Conserver à température ambiante (RT).
- Préparer le tampon de MACS en mélangeant 995 mL de PBS/EDTA 2 mM avec 5 g de l’albumine sérique bovine (BSA). Vigoureusement mélanger la solution et le filtrat à l’aide d’un filtre de 0,45 µm. Conserver à 4 ° C.
- Préparer la solution mère de collagénase B (40 mg/mL) en diluant 500 mg de collagénase B (à partir de Clostridium histolyticum) à 12,5 mL de PBS. Mélanger la solution vigoureusement, faire des parties aliquotes de 350 µL et conserver à-20 ° C.
- Préparer la désoxyribonucléase (DNAse) je stock solution (10 mg/mL) en diluant 100 mg de DNase I (à partir de pancréas de boeuf) dans 10 mL de PBS. Mélanger la solution vigoureusement, faire des parties aliquotes de 350 µL et conserver à-20 ° C.
- Digestion enzymatique de BM humaine
- Préchauffer le moyen de lymphocytes humains a RT et décongeler les enzymes (1 partie aliquote de chaque de collagénase B et DNAse / 20 mL BM).
- Recueillir la BM de seringues dans un tube conique de 50 mL et mélanger doucement. Jeter les caillots existants.
NOTE : Transférer 200 µL de BM non dilué dans un tube de 1,5 mL pour cytométrie ultérieures. Conserver à 4 ° C jusqu'à l’utilisation. - Dans un nouveau tube conique de 50 mL, transférer 10 mL BM, ajouter 6 mL de PBS/EDTA (2 mM), 20 mL de milieu de lymphocytes humains, 175 µL de collagénase B (40 mg/mL) et 175 µL de DNAse I (10 mg/mL). Doucement mélanger la solution et laisser incuber 30 min à ta sur un agitateur. Répétez pour l’échantillon restant de la BM.
- Centrifugation en gradient de densité
- Amorcer un tube de centrifugation en gradient de densité 50 mL en appliquant 15 mL de lymphocytes humains, séparant le milieu dans un tube de 50 mL. Centrifuger à 1 000 x g pendant 30 s.
- Soigneusement la couche 35 mL de BM dilué sur le dessus du filtre à densité centrifugation en gradient tube et centrifuger à 445 x g pendant 35 min à température ambiante.
Remarque : Les paramètres de centrifugeuse sont faible accélération (3) et pas de frein (1). - Retirer délicatement le tube de la centrifugeuse sans agitation. Soigneusement jeter environ 20 mL de la solution claire supérieure sans toucher la couche nuageuse directement sur le dessus du filtre.
- Soigneusement, transférer la couche nuageuse (qui est directement sur le dessus du filtre et contient les cellules mononucléées (PTM)) dans un nouveau tube conique de 50 mL et remplir avec PBS/EDTA pour un volume final de 50 mL.
NOTE : Combiner toutes les multinationales dans un échantillon de patients BM dans un nouveau tube. - Compter les multinationales de transférer 10 µL de la suspension cellulaire de 50 mL dans un tube de 1,5 mL. Ajouter 10 µL d’acide acétique 3 % avec le bleu de méthylène. Doucement, mélanger et appliquer 10 µL dans une chambre de comptage. Calculer le nombre de multinationales.
- Centrifuger la suspension RNM à 300 x g pendant 10 min. éliminer le surnageant.
ATTENTION : Lors de la centrifugation, refroidir la centrifugeuse du RT à 4 ° C.
- Sélection magnétique de CD133+ SCs utilisant des humains CD133 anticorps-lié superparamagnetic iron dextran particules
Remarque : Au cours de cette étape, travailler sur la glace. Solutions de magasin jusqu'à l’utilisation à 4 ° C. Stocker des MACS à un aimant permanent, colonnes de séparation et avant la séparation filtre à 4 ° C.- Choisissez la taille de la colonne. Pour < 1.2 x 108 MNCs, colonnes d’utilisation de MS et pour les > 1,2 x 108 MNCs, utiliser des colonnes de LS (voir Table des matières).
- Pour préparer de sélection magnétique pour le nombre total de cellules de 1 x 108 , soigneusement resuspendre multinationales dans 300 µL de tampon de MACS (4 ° C). Ajouter 100 µL de réactif blocage de FcR (4 ° C) et 100 µL CD133 anticorps-lié superparamagnetic iron dextran particules (4 ° C).
- Doucement, mélanger la suspension cellulaire et incuber 30 min à 4 ° C. Secouez légèrement la suspension cellulaire pendant l’incubation (2 à 3 x).
- Ajouter 2 mL de tampon de MACS (4 ° C) 1 x 108 totales Qu'emns. Mélanger doucement la suspension cellulaire et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C.
- Mettre en place le porte-aimant de MACS et fixer l’aimant permanent de MACS. Installer la colonne MACS et appliquer le filtre avant la séparation sur le dessus.
- Equilibrer la première colonne de MACS MS/LS et le filtre avant la séparation avec 0,5 mL (MS) ou 3 mL (LS) de tampon de MACS (4 ° C).
Remarque : Ne laissez jamais les colonnes MACS se dessécher après équilibration. - Jeter le surnageant et Resuspendre le culot obtenu en 500 µL de tampon de MACS (4 ° C) par quantité de 1 x 108 total de cellules. Appliquer la suspension cellulaire dans le filtre avant la séparation.
- Laver le filtre de colonne et de pré-séparation Mac trois fois, avec, pour chaque lavage, 0,5 mL (MS) ou 3 mL (LS) de Mac de secours (4 ° C).
Remarque : Au cours de la troisième étape de lavage, installer une seconde colonne de MACS dans les aimants permanents de MACS et équilibrer la deuxième colonne de MACS MS/LS avec 0,5 mL (MS) ou 3 mL (LS) de tampon de MACS (4 ° C). - Jetez le filtre avant la séparation.
- Éluer la fraction cellulaire directement sur la deuxième colonne de MACS : ajouter 1 mL (MS) ou 5 mL (LS) de tampon de MACS (4 ° C) sur la première colonne de MACS et supprimer la colonne de MACS de l’aimant permanent de MACS. Immédiatement transférer la première colonne de MACS au-dessus de la deuxième colonne de MACS et pousser la suspension cellulaire par le biais de la colonne Mac utilisant le piston fourni.
- Laver la colonne Mac trois fois, en utilisant pour chaque lavage 0,5 mL (MS) ou Mac 3 mL (LS) de secours (4 ° C).
- Éluer la fraction de la cellule de la colonne en ajoutant 1 mL (MS) ou 5 mL (LS) de tampon de MACS (4 ° C) sur la deuxième colonne de MACS et supprimant la colonne Mac depuis le Mac à un aimant permanent. Immédiatement transférer la deuxième colonne de MACS au-dessus d’un tube de 1,5 mL (MS) ou un tube conique de 15 mL (LS) et pousser la suspension cellulaire par le biais de la colonne Mac utilisant le piston fourni.
- Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C. Soigneusement, éliminer le surnageant et Resuspendre le culot obtenu dans 100 µL de tampon de MACS (4 ° C).
- Compter les CD133+ cellules : transfert 6 µL de la suspension de cellules dans un tube de 1,5 mL. Ajouter 6 µL de solution de bleu de trypan (0,4 %). Doucement, mélanger et appliquer 10 µL dans une chambre de comptage. Calculer le nombre de CD133+ cellules.
- Stocker le CD133+ des cellules sur la glace jusqu’au semis.
- Préparation de solutions requises
- Caractérisation des CD133 fraîchement isolées+ SCs
NOTE : Les travaux suivants doivent être effectué dans une pièce à l’abri de la lumière lumineuse (éclairage dim uniquement). Garder les tubes, les tampons et les anticorps sur glace sauf indication contraire.- Préparation des SCs pour cytométrie
- Utilisez les deux échantillons (chaque 10 µL) d’aliquotes de BM et un échantillon de CD133 fraîchement isolées+ SCs (minimum, 1 x 104 cellules) pour analyse. Transférer les cellules dans un tube de 1,5 mL. Ajouter 10 µL de RCF réactif de blocage et remplir avec du tampon de MACS (4 ° C) pour un volume de 33 µL.
- Ajouter les anticorps suivants sur la face interne des tubes (voir tableau 1) : anti-CD34-fluorescéine isothiocyanate (FITC) (clone : AC136), anti-CD133/2-phycoérythrine (PE) (clone : 3 293), isotype IgG de souris 2 b-PE, de contrôle Anti-CD45-allophycocyanin () APC)-H7 (clone : 2D 1) et 7-aminoactinomycine (AAD). Après que tous les anticorps ont été ajoutés, secouer du côté de l’anticorps du tube. Doucement, mélanger la solution (volume final 50 µL) et incuber pendant 10 min à 4 ° C.
- Ajouter 1 mL de tampon de lyse 1 x globule rouge (RBC), mélanger la suspension doucement et incuber sur glace 10 min. Centrifuger la suspension à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C.
- Jeter le surnageant et Resuspendre le culot obtenu dans 100 µL de PBS (4 ° C). Conserver sur la glace jusqu'à l’analyse en cytométrie en flux.
- Analyse d’écoulement par cytométrie en flux de CD133+ SCs
- D’examiner la viabilité cellulaire et la pureté des CD133+ SC, utiliser un adapté International société de Hematotherapy et le greffon Engineering (ISHAGE) écoulement cytometry gating stratégie41 (voir le déscriptif représentatif dans la Figure 1). Utilisez la commande suivante :
Étape 1 : sélection de la population de cellules (Figure 1 a)
Étape 2 : sélection du CD45+ cellules (Figure 1 b)
Étape 3 : sélection du CD45 viable+ cellules (Figure 1)
Étape 4 : sélection de CD45 viable+/CD34+ cellules (Figure 1)
Étape 5 : sélection de CD45 viable+/CD34+/CD133+ cellules (Figure 1E)
Exécutez le cytomètre en flux (voir Table des matières) selon les instructions du fabricant. - Calculer la viabilité cellulaire et la pureté à l’aide des équations suivantes :
- D’examiner la viabilité cellulaire et la pureté des CD133+ SC, utiliser un adapté International société de Hematotherapy et le greffon Engineering (ISHAGE) écoulement cytometry gating stratégie41 (voir le déscriptif représentatif dans la Figure 1). Utilisez la commande suivante :
- Préparation des SCs pour cytométrie
Équation 1
Équation 2
-
La culture de CD133 fraîchement isolées de cellules+ SCs
- Aliquote 100 x cytokine humaine recombinante supplément dans 100 µL d’extraits et conserver à-20 ° C. Dégel un aliquote de 100 x avant la préparation moyenne.
- Préparer le CD133+ SC milieu de culture, les cellules hématopoïétiques sans sérum expansion additionné avec supplément de cytokine humaine recombinante (final 1 x) et 1 % la pénicilline/streptomycine.
- Graines de 5 x 104 fraîchement isolées CD133+ SCs pour la transfection dans une plaque 24 puits avec 500 µL de milieu de culture. Incuber les cellules à 37 ° C, 5 % de CO2 et 20 % O2.
NOTE : Semences 5 x 104 fraîchement isolées CD133+ SCs comme un contrôle pour analyse en cytométrie en flux.
2. préparation des Complexes de Transfection
NOTE : Au cours de cette étape, gardez la ribonucléase d’espace de travail entier (RNAse)-libérer à l’aide de la solution de décontamination de RNAse et utilisons uniquement des matières consommables RNAse-libre.
-
Préparation de miR
NOTE : Les travaux suivants doivent être effectué dans une pièce à l’abri de la lumière lumineuse (éclairage dim uniquement).
Remarque : pour le miR-spécimen : utilisation Cyanine 3 colorant étiquetés miR précurseur et miR précurseur sans étiquette.- Pour préparer la solution mère de miR (50 µM), diluer la quantité désirée de miR dans le volume approprié d’eau exempte de nucléase (par exemple, diluée 5 nmol de miR dans 100 µL d’eau). Mélanger la solution, aliquote le stock de miR (5 µL) doucement et stocker au-dessous de-20 ° C.
-
Préparation de l’Î.-P.-É.
- Préparer le PEI suite de protocoles standard et remarque la PEI concentration stock31,,42 .
-
Préparation du MNP
- Préparer les MNPs suite de protocoles standard et notez la MNP concentration stock31,42.
-
Préparation de miR/PEI complexes
- Préparer une solution de glucose 5 % en diluant D-(+)-glucose dans de l’eau exempte de nucléase. Doucement mélanger la solution, aliquote du stock (1,5 mL) et conserver à 4 ° C.
NOTE : Les travaux suivants doivent être effectué dans une pièce à l’abri de la lumière lumineuse (éclairage dim uniquement). - Utilisez 20 miR pmol / puits d’une plaque 24 puits30. Diluer à miR dans la solution de glucose 5 % pour une concentration finale de 0,25 pmol miR/µL.
- Calculer le montant de PEI requis basé sur le montant de miR (20 pmol, étape 2.3.1) et l’azote optimal (de l’Î.-P.-É.) en phosphate (de miR) ratio (N/P) basée sur la concentration de stock de PEI (étape 2.2.1 ; ici, un ratio de 7,5 a été utilisé)30. Diluer le PEI dans une quantité égale de solution de glucose 5 %, selon l’équation :
qui se réarrange en
Équation 3
où le volume de PEI est en µL et [PEI] est en mM et N/P (optimisé pour ce protocole) est de 0,75. 0,12 est un facteur de conversion spécifique à la station miR. - Ajouter le PEI préalablement dilué dans le miR préalablement dilué et vortexer pendant 30 s.
- Incuber le miR/PEI complexe pendant 30 min à température ambiante.
- Préparer une solution de glucose 5 % en diluant D-(+)-glucose dans de l’eau exempte de nucléase. Doucement mélanger la solution, aliquote du stock (1,5 mL) et conserver à 4 ° C.
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Préparation des complexes miR/PEI/MNP
NOTE : Les travaux suivants doivent être effectué dans une pièce à l’abri de la lumière lumineuse (éclairage dim uniquement).- Tout en incubant les complexes de miR/PEI, préparer les MNPs par sonification les MNPs pendant 20 min à 35 kHz dans le bain d’eau sonicating à RT pour s’assurer que les particules sont en suspension et ne pas agréger.
- Calculer le nombre de députés nationaux requis (fer de 3 µg/mL) basé sur la solution stock de MNP (point 2.3.1).
- Ajouter les MNPs aux ultrasons dans les complexes de miR/PEI et le vortex pour 30 s. Incuber les complexes de miR/PEI/MNP pendant 30 min à température ambiante.
-
Préparation des complexes de transfection pour les quatre couleurs de marquage à l’aide de la carte SIM
Remarque : Utilisez miR précurseur sans étiquette.- Étiqueter le miR avec l’aide de colorant Cyanine 5 un étiquetage de miR colorant Cyanine 5 kit (voir Table des matières) suivant les instructions du fabricant. Mesurer la concentration finale de miR à l’aide du spectrophotomètre cotée (voir Table des matières) en accord avec le pré-réglage fourni par le fabricant (acides nucléiques, RNA-40). Aliquoter que le miR (5 µL) et les conserver à-80 ° C abri de la lumière.
- Étiqueter le PEI avec un colorant de fluorescence vert vif à l’aide un étiquetage approprié protéine nécessaire (voir Table des matières) suivant les instructions du fabricant. Définir la concentration finale de PEI utilisant l’analyse de la ninhydrine (étape 2.2.1). Aliquote du PEI (dans le volume calculé sur la base de l’équation 3) et conserver à 4 ° C, abri de la lumière.
- Étiqueter les MNPs avec colorants rhodamine, conjugué à la biotine en utilisant un ratio de 1 : 1 000 w/w, teindre à MNP. Mélanger les colorants rhodamine et MNPs en même temps que la préparation de la formation du complexe miR/PEI et incuber la solution pendant 30 min à l’obscurité. Utilisation marquée directement MNPs.
Équation 33. la transfection de CD133+ SCs
NOTE : Au cours de cette étape, gardez la ribonucléase d’espace de travail entier (RNAse)-libérer à l’aide de la solution de décontamination de RNAse et utilisons uniquement des matières consommables RNAse-libre
NOTE : Les travaux suivants doivent être effectué dans une pièce à l’abri de la lumière lumineuse (éclairage dim uniquement).
- Le complexe de miRNA/PEI/MNP préparé, ajouter quelques gouttes directement dans le puits correspondant contenant le CD133 fraîchement isolées+ SCs dans le milieu de culture.
- Mélanger doucement en balançant la plaque avant et en arrière. Incuber les cellules pendant 18 h à 37 ° C, 5 % de CO2 et 20 % O2.
4. analyse de la Transfection de miR
-
Examen de l’efficacité de l’absorption de miR et la cytotoxicité des complexes de transfection
Remarque : pour le miR-spécimen : utiliser le colorant Cyanine 3 étiqueté miR précurseur pour l’évaluation de l’absorption et la non transfectées CD133+ SCs pour les portes de contrôle de cytométrie en flux.
NOTE : Les travaux suivants doivent être effectué dans une pièce à l’abri de la lumière lumineuse (éclairage dim uniquement).
Remarque : Conservez les tubes, les tampons et anticorps sur la glace, sauf indication contraire.- Préparer la solution mère de paraformaldéhyde (PFA, 4 %) par dilution 4 g PFA dans 100 mL de PBS et chauffer la solution à 80 ° C. Vigoureusement, mélanger la solution et ajuster le pH de 7,3. Aliquote de la PFA (1,5 mL) en stock et conserver à-20 ° C.
- 18 h après la transfection, recueillir chaque puits dans un séparé 1,5 mL tube. Laver chaque bien une fois avec 500 µL de PBS et transférer cette suspension cellulaire dans le même tube.
- Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot obtenu dans 100 µL de tampon de MACS de 4 ° C.
- Ajouter 0,5 µL d’un colorant réactif amine pour distinguer les cellules vivantes et mortes, délicatement mélanger la suspension et incuber pendant 10 min à 4 ° C. Ajouter 1 mL de PBS (4 ° C) et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C.
- Jeter le surnageant, resuspendre le culot obtenu dans 100 µL de PBS, ajouter 33 µL PFA (4 %) et conserver sur la glace ou à 4 ° C jusqu'à l’analyse en cytométrie en flux.
- Organiser la stratégie de blocage selon la représentation représentative dans la Figure 2. Exécuter les exemples sur le cytomètre en flux (voir Table des matières) selon les instructions du fabricant.
-
Caractérisation de la CD133 transfectées miR+ SCs
Remarque : Utiliser miR précurseur non étiquetés comme non transfectées CD133+ SCs pour portes de contrôle de cytométrie en flux.- Recueillent chacun bien dans un tube séparé de 1,5 mL et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C.
- Utilisez la stratégie de blocage comme indiqué au point 1.2.
-
Examen de la distribution intracellulaire des complexes de transfection par SIM
- Préparer les complexes et transfecter les cellules tel que décrit dans les sections 2 et 3 de l’article.
- 18 h après la transfection, recueillir chaque puits dans un séparé 1,5 mL tube. Laver chaque bien une fois avec 500 µL de PBS et transférer le lavage dans tube respectifs du puits. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C.
- Jeter le surnageant et Resuspendre le culot obtenu dans 1 mL de sérum bovin fœtal (SVF) de 2 % dans du PBS, délicatement mélanger la suspension et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C.
- Jeter le surnageant et Resuspendre le culot obtenu dans 100 µL de PBS Ajouter 33 µL PFA (4 %) pendant 20 min.
- Transférer la suspension cellulaire dans une nouvelle plaque de 24-culture contenant des lamelles de verre stériles et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C.
- Jeter le surnageant et ajouter 500 µL de PBS. Agiter la plaque doucement et jeter les PBS.
- Placer les lamelles disposée sur les lames microscopiques à l’aide de milieu de montage aqueux pour préserver la fluorescence et séchez-les à ta pendant au moins 1 h.
- Acquisition d’images à l’aide d’un objectif 100 X à immersion d’huile. Paramètres de la carte SIM : 405, 488, 561 et lignes de laser 633 nm pour l’excitation et z-piles avec une profondeur de 16 bits à 3 angles, 3 phases, avec une moyenne de 4, grilles par faisceau laser : 23 µm – 405, 34 µm – 488, 42 µm – 561, 51 µm – 633.
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Representative Results
Le protocole présenté décrit un isolement manuel et magnétique enrichissement humain CD133 dérivé de BM+ SCs avec une cellule indépendante virus ultérieures ingénierie de stratégie, comme une technologie non invasive pour la manipulation de cellules in vitro et en vivo outil de surveillance.
Cette technologie triple isolation permet une séparation des multinationales de la BM sternal prédigéré par centrifugation en gradient de densité. Par la suite, un CD133+ fraction cellulaire peut être enrichie par magnétisme en utilisant la technologie d’isolation approprié. Cela permet un enrichissement des CD133+ SCs avec une viabilité et une pureté supérieure à 80 %, ce qui peut être déterminé par cytométrie en flux (Figure 1). Ci-après, seuls les produits de SC qui répondent aux exigences ont été utilisés pour d’autres expériences.
La méthode de transfection décrite ici permet une introduction très efficace de miR dans ces fraîchement isolées CD133 humaine+ SCs avec une absorption d’environ 80 % des viable de cellules (Figure 2)30. En outre, il n’y a aucune cytotoxicité significative évidente 18 h après que transfection comparée aux cellules (Figure 2)30. En outre, une livraison suffisante et la répartition habituelle des composés complexes transfection (miR, PEI et MNPs) peuvent être observées dans le cytoplasme des cellules à l’aide de la carte SIM (Figure 3).
Figure 1 : Représentant Boolean gating stratégie pour CD133+ SC caractérisation. (A.-e.) Représentation d’une stratégie de sélection des 5 étapes pour une évaluation rigoureuse de la viabilité cellulaire et la pureté d’isolé CD133+ SC ainsi que du contrôle d’isotype CD133 (F) à l’aide de l’échantillon de BM sans traitement approprié. (A) à l’exclusion des débris de la population de cellules intactes dans une parcelle de point de diffusion vers l’avant/latérale (FSC/SSC), suivie par la sélection successive de CD45 (B)+ cell population, CD45 viable (C)+ (D), la population de cellules viable CD45 positive double+/CD34+ population cellulaire et (E) viable triple CD45 positive+/CD34+/CD133+ population de cellules. Orange : CD45+/CD34+/CD133+ a mis en évidence à chaque étape de la sélection des cellules. Légende : APC-Cy7 : anti-CD45, FITC : anti-CD34, FSC : Forward Scatter Channel, PE : anti-CD133, SSC : Side Scatter canal, 7-AAD : 7-aminoactinomycine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : représentant gating stratégie pour l’évaluation de l’efficacité d’absorption de miR et la cytotoxicité de la transfection complexe. Stratégies de blocage de (A, B) transfectées CD133+ SCs ainsi que (C, D) non transfectées CD133+ SCs pour les analyses de (A, C) Cyanine3 colorant étiqueté précurseur-miRNA absorption () efficacité rouge : Cy3 viable+ cellules) et (B, D) les effets cytotoxiques de la procédure de transfection marquée par un colorant réactif amine de distinguer entre des cellules vivantes et mortes (bleu : les cellules mortes). Légende : SSC : canal latéral Scatter cellules seulement : non transfectées CD133+ SCs, miRNA/PEI/MNP : CD133+ SCs transfectées avec Cy3 marqué miR s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : visualisation intracellulaire de la transfection complexe. CD133+ SCs ont été transfectées avec trois couleurs marqué miR/PEI/MNP complexes (miR : 20 pmol, PEI : rapport N/P 7.5, MNP : 3 µg/mL). Visualisation représentative a été réalisée 18 h après la transfection illumination structurée par microscopie. Le miR a été marqué par Cyanine5 agent (rouge), PEI avec un colorant de fluorescence vert lumineux (vert), MNPs avec des colorants rhodamine conjugué à la biotine (jaune), et le noyau a été Eosine au DAPI (bleu). Echelle = 5 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| échantillon | Réactif de blocage FCR [µL] | Tampon de MACS [µL] | anticorps [µL] | total [µL] | ||||||
| nombre | spécimen | cellules [µL] | Isotype CD133-PE | CD133-PE | CD34-FITC | CD45-APC-Cy7 | AJOUTER | |||
| 1 | BM | 10 | 10 | 12,5 | 5 | - | 5 | 2.5 | 5 | 50 |
| 2 | BM | 10 | 10 | 12,5 | - | 5 | 5 | 2.5 | 5 | 50 |
| 3 | CD133+ | (1 x 104) | 10 | 12,5 | - | 5 | 5 | 2.5 | 5 | 50 |
Tableau 1 : présentation de pipetage pour la caractérisation des CD133 + SCs.
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Discussion
Ces dernières années, CD133+ SCs sont apparus comme une population de cellules prometteuses pour thérapies à base de SC, comme en témoignent plusieurs phases I, II et III des essais cliniques43,44,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54. ici, nous présentons un protocole détaillé pour la normalisés caractérisation de cytométrie de flux purification et flux manuelle de ces cellules de BM sternal humaine. La procédure décrite isolement basé sur le Mac représente une stratégie douce, rapide et efficace d’obtenir une fraction SC hématopoïétique très pure et viable. La bonne compatibilité combinée à la dégradation rapide des co injecté MACS microbilles utilisée pour le tri des cellules a été démontrée précédemment par notre groupe55,56.
Cette procédure d’isolement a été développée à l’aide de BM sternal humaine comme une matière d’origine, et par conséquent, le protocole permet actuellement purification de SCs hématopoïétiques, conçu pour être utilisé dans la recherche non cliniques. Si CD133+ SCs sont isolés des autres tissus (p. ex., BM, obtenu à partir de la crête iliaque) plusieurs étapes du protocole comme la centrifugation de la digestion et la densité des tissus enzymatique peuvent exiger l’adaptation. Pour application clinique cellule, notre groupe créé encore un procédé de fabrication sur place de GMP conforme en utilisant le57a besoin d’un système automatique pour satisfaire des exigences supplémentaires au nom de clinique.
Le génie de SCs avant leur application est une stratégie novatrice pour surmonter certains obstacles dans la thérapie de SC, y compris la rétention faible cellulaire et apoptose massive. Le protocole actuel comprend des instructions pour la production d’un système de transfection virale libres multifonctionnel basé sur PEI ramifié lié à MNPs et sa mise en place efficace dans la CD133+ SCs30. Application de ce système permet la modification génétique cellulaire, cellule magnétique contrôlé orientation et suivi de cellules non invasif par IRM ou MPI30,31,40,42,58 , 59 , 60.
Ce qui est important, les conditions de transfection décrit ont été optimisées pour la modification génétique transitoire de CD133+ SCs dérivé de BM30. Dans des travaux antérieurs, ce système de transfection a été appliqué avec succès pour la livraison d’ADN plasmidique et miR aux autres cellules types31,40,60. Ces expériences ont montré que l’efficacité de transfection ainsi que cytotoxicité cellulaire dépendant du type. Par conséquent, la composition optimale des NAs, PEI et MNPs doivent être définis pour chaque type de cellule.
En raison de sa grande efficacité, PEI est l’un des polymères plus couramment utilisés pour cellule de génétique non viraux61d’ingénierie. Toutefois, l’application clinique61,62 de PEI est très limité jusqu'à présent en raison de sa toxicité générale61,63. Fait intéressant, notre groupe a récemment démontré que MNPs réduisent la toxicité de la PEI lorsque inclus dans la transfection système31,60. Dans le même temps, la possible toxicité des nanoparticules d’oxyde de fer basé causées par la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) est dose-dépendante et plusieurs types de nanoparticules superparamagnétiques sont approuvés pour MRI64,65 . Cependant, il faut à la toxicité du système in vitro et in vivo.
Dans l’ensemble, le protocole est assez complex, contenant de nombreuses étapes essentielles qui doivent être abordées avec beaucoup d’attention. À cet effet, nous avons mis en évidence ces points dans la section protocole avec des notes. En particulier, nous tenons à souligner l’importance d’un environnement totalement exempt de RNAse et d’éviter toute exposition à la lumière lorsque vous manipulez les colorants fluorescents appliquées.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le ministère fédéral de l’éducation et recherche Allemagne (FKZ 0312138A et FKZ 316159), l’État Mecklembourg-Poméranie occidentale avec les fonds structurels européens (FSE/IVWM-B34-0030/10 et du FSE/IVBM-B35-0010/12) et le DFG (DA1296/2-1), le Fondation de cardiologie allemand (F/01/12), le BMBF (VIP + 00240) et la Fondation humide. En outre, F.H. et h sont pris en charge par le FORUN programme de Rostock University Medical Centre (889001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies | 7060 | 3% |
| anti-CD133/2-PE (clone: 293C3) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-853 | |
| anti-CD34-FITC (clone: AC136) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-081-001 | |
| anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1) | BD Biosciences | 560178 | |
| rhodamine dye; Atto 565 dye conjugated to biotin | ATTO-TEC GmbH | AD 565-71 | |
| BD FACS LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva Software 6.1.2 | BD Biosciences | ||
| BSA | Sigma-Aldrich GmbH | A7906 | |
| CD133 antibody-linked superparamagnetic iron dextran particles; CD133 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-049 | |
| collagenase B | Roche Diagnostics GmbH | 11088831001 | |
| counting chamber | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | ||
| Cyanine 3 dye labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 | Ambion | AM17120 | |
| Cyanine 5 dye miR labelling kit; Cy5 dye Label IT miRNA Labeling Kit | Mirus Bio | MIR 9650 | |
| DNAse I | Roche Diagnostics GmbH | 10104159001 | (100 U/mL) |
| ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope | Carl Zeiss Jena GmbH | ||
| FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-059-901 | |
| bright green protein labeling kit; Oregon Green 488 Protein Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | O10241 | |
| aqueous mounting medium; Fluoroshield | Sigma-Aldrich GmbH | F6182 | |
| density gradient centrifugation tube; Leukosep Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 89048-932 | |
| MACS magnet holder; MACS MultiStand | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-303 | |
| MACS pre-separation filter | Miltenyi Biotec GmbH | 130-041-407 | 30 µm |
| MACS separation column (MS / LS) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-201 / 130-042-401 | |
| MACS permanent magnet; MACS Separator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-302 | |
| Millex-HV PVDF Filter | Merck | SLHV013SL | 0.45 μm |
| mouse IgG 2b-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-215 | |
| amine reactive dye; Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| human lymphocyte separating medium; Pancoll | Pan Biotech GmbH | P04-60500 | density: 1.077 g/mL |
| PBS | Pan Biotech GmbH | P04-53500 | without Ca and Mg |
| PEI | Sigma-Aldrich GmbH | 408727 | branched; 25 kDa |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/mL, 100 μg/mL |
| PFA | Merck Schuchardt OHG | 1040051000 | |
| unlabelled precursor miR; Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 | Ambion | AM17110 | |
| RBC lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| RNAse decontamination solution; RNaseZap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| human lymphocyte medium; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Pan Biotech GmbH | P04-16500 | |
| recombinant human cytokine supplement; StemSpan CC100 | Stemcell Technologies | 2690 | |
| serum-free haematopoietic cell expansion medium; StemSpan H3000 | Stemcell Technologies | 9800 | |
| Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles | Promega Corporation | Z5481 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich GmbH | T8154 | 0.4 % |
| UltraPure EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | 0.5 M; pH 8.0 |
| ZEN2011 software | Carl Zeiss Jena GmbH | ||
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Sonorex RK 100 SH sonicating water bath | Bandelin electronic | Ultrasonic nominal output: 80 W; Ultrasonic frequency: 35 kHz |
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