Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Protokoll för mikroRNA överföring till benmärgen-härrör hematopoetiska stamceller att aktivera Cell teknik kombinerat med magnetiska inriktning

Published: June 18, 2018 doi: 10.3791/57474
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1, 1,2, 1,2
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty, Rostock University
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll illustrerar ett säkert och effektivt förfarande för att ändra CD133+ hematopoetiska stamceller. Den presenterade icke-virala, magnetiska polyplex synsätt kan utgöra grund för optimering av terapeutiska stamceller effekter samt för övervakning av administrerade cell produkten via magnetisk resonanstomografi.

Abstract

Medan CD133+ hematopoetiska stamceller (SCs) har visat sig ge hög potential inom regenerativ medicin, deras låga retentionsfrekvenserna efter injektion i skadade vävnader samt de observerade massiva cell dödstalen leda till mycket begränsade terapeutiska effekter. För att övervinna dessa begränsningar, försökte vi upprätta en icke-virala baserat protokoll för lämplig cell engineering före deras administration. Modifiering av mänskliga CD133+ uttrycker SCs använder mikroRNA (miR) laddade magnetiska polyplexes togs upp avseende upptag effektivitet och säkerhet samt inriktning potentialen i cellerna. Förlitar sig på våra protokoll, kan vi uppnå hög miR upptag priser på 80 – 90% medan CD133+ stamceller egenskaper påverkas. Dessutom erbjuder dessa modifierade celler alternativet av magnetiska inriktning. Vi beskriver här en säker och mycket effektiv förfarandet för ändring av CD133+ SCs. Vi förväntar oss detta tillvägagångssätt ger en standardteknik för optimering av terapeutiska stamceller effekter och för övervakning av administrerade cell produkten via magnetisk resonanstomografi (MRT).

Introduction

CD133+ SCs utgör en heterogen stammen och progenitor cell befolkning med lovande potential för regenerativ medicin. Deras hematopoetiska, endotel och myogenic differentiering potentiella1,2,3 gör CD133+ celler, t.ex., att bidra till kärlnybildning processer genom differentiering till nyligen bildar fartyg och aktivering av proangiogena signalering av parakrin mekanismer4,5,6,7.

Trots deras hög potential som visats i mer än 30 godkända kliniska studier (ClinicalTrails.gov), pågår deras terapeutiska resultat fortfarande kontroversiell diskussion4. Faktiskt hämmas en klinisk tillämpning av SCs av låg retention i organ av intresse och massiva första cell death5,8,9. Ytterligare konstruktion av CD133+ SCs tidigare transplantation kunde hjälpa övervinna dessa utmaningar.

En förutsättning för en effektiv cellterapi skulle vara en minskning av den massiva första celldöd att förbättra engraftment av terapeutiska relevanta celler10. Aktuella studier har visat en enorm cellförlust 90 – 99% i högt perfunderade organ som hjärnan och hjärtat under de första 1 – 2 h, oberoende av vilken transplanterade celler eller programmet route11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21. SC märkning använder magnetiska nanopartiklar (MNPs) möjliggör en innovativ icke-invasiv strategi till målcellerna till platsen av intresse22,23,24,25,26 och samtidigt tillåter cell övervakning med hjälp av MRI27 och magnetiska partikel imaging (MPI). Den mest effektiva i vivo studier tillämpa magnetiserade cell inriktning använda cellen retention efter lokal administrering stället cellen vägledning efter intravenös injektion23,24,28 . Därför utformat vår grupp ett system bestående av superparamagnetiska järnoxid nanopartiklar29. Med denna teknik, CD133+ SCs och mänskliga navel ven endotelceller (HUVECs) kunde effektivt riktas, vilket framgår av in vitro- försök30,31.

Ett annat hinder för SC terapier är den ogästvänliga inflammatoriska miljön i den drabbade vävnaden efter transplantation, vilket bidrar till den första cell död32. Förutom flera förkonditioneringen studier var tillämpningen av terapeutiskt relevant miRs testade33; Det har varit framgångsrikt visat att anti-apoptotiska miRs hämmar apoptos i vitro och förbättra cell engraftment i vivo33. Dessa små molekyler, som består av 20 – 25 nukleotider, spela en avgörande roll som postttransskriptionell modulatorer av messenger RNA (mRNA), och därmed påverka stamceller öde och beteende34. Dessutom exogena införandet av miRs undvika oönskad stabil integrering i den mottagande genom34.

Nuvarande försök för effektiv införandet av nukleinsyror (NAs) i primära SCs är mestadels baserade på rekombinanta virus8,35. Trots den höga transfection effektiviteten presenterar rekombinanta virus manipulation ett stort hinder för en bänk-till-sängbord översättning, t.ex., okontrollerbara genuttryck, patogenicitet, immunogenicitet och insertionsmutationer35 ,36. Icke-virala leverans system såsom polymerbaserade konstruktioner är därför viktiga att utveckla. Bland dem, polyethylenimine (PEI) representerar en giltig leveransfordon som erbjuder fördelar för miRs såsom NA kondens att skydda från nedbrytning, cellernas upptag, och intracellulära utsläpp via endosomal fly37,38. Dessutom visat miR-PEI komplex en hög biokompatibilitet i kliniska prövningar39. Vårt leveranssystem består därför av en biotinylerade Grenade 25 kDa PEI bunden till en streptividin-belagda MNP-core30,31,40.

I detta manuskript, presenterar vi ett omfattande protokoll som beskriver de manuella isoleringen av CD133+ SC från human benmärg (BM) donation med en detaljerad karakterisering av SC produkten och (ii) en effektiv och skonsam transfection strategi för en magnetiskt icke-virala polymerbaserade leveranssystem för genteknik av CD133+ SCs använder miRs. CD133+ SCs har isolerats och magnetiskt berikad från mänskliga sternala BM enkelarmade använder en surface antikroppsbaserade magnetiska-aktiverad cell sortering (Mac) system. Efteråt, cellviabiliteten samt cell renhet analyseras med flödescytometri. Därefter miR/PEI/MNP komplex är beredda och CD133+ SCs är transfekterade. 18 h efter transfection, upptag effektivitet och inverkan av transfection på SC markör uttryck och cell lönsamhet analyseras. Vidare utförs utvärdering av intracellulära fördelningen av de transfection komplexa föreningarna med fyrfärg märkning och strukturerade belysningen mikroskopi (SIM).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Sternala mänskliga BM för cell isolering erhölls från informerat donatorer, som gav sitt skriftliga samtycke till att använda sina prover för forskning enligt Helsingforsdeklarationen. Den etiska kommittén av det Universitetar av Rostock har godkänt presenterade studien (reg. nr A 2010 23, långvarig under 2015).

1. cell förberedelse

Obs: Använda heparin natrium (250 IU/mL BM) för att förhindra koagulering för BM undersökning.

  1. CD133+ SC isolering
    1. Beredning av krävs lösningar
      1. Förbereda fosfatbuffrad saltlösning (PBS) / etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) stamlösning (2 mM) genom att blanda 996 mL 1 x PBS med 4 mL av EDTA (0,5 M). Kraftfullt blanda lösningen och filtratet med 0.45 µm filter. Förvara i rumstemperatur (RT).
      2. Förbereda MACS bufferten genom att blanda 995 mL 2 mM PBS/EDTA med 5 g av bovint serumalbumin (BSA). Kraftfullt blanda lösningen och filtratet med 0.45 µm filter. Förvaras vid 4 ° C.
      3. Förbereda kollagenas B stamlösning (40 mg/mL) genom att späda ut 500 mg kollagenas B (från Clostridium histolyticum) i 12,5 mL PBS. Kraftfullt blanda lösningen, gör alikvoter av 350 µL och förvaras vid-20 ° C.
      4. Förbereda deoxyribonuclease (DNAse) jag stamlösning (10 mg/mL) genom att späda ut 100 mg DNAS jag (från nötkreatur bukspottkörteln) i 10 mL PBS. Kraftfullt blanda lösningen, gör alikvoter av 350 µL och förvaras vid-20 ° C.
    2. Enzymatisk nedbrytning av mänskliga BM
      1. Pre varm mänskligt lymfocyter medellång till RT och Tina enzymer (1 alikvot varje kollagenas B och DNAS per 20 mL BM).
      2. Samla in BM från sprutor i en 50 mL konisk tub och blanda försiktigt. Kassera alla existerande blodproppar.
        Obs: Över 200 µL av outspädd BM i ett 1,5 mL rör för efterföljande flöde flödescytometrisk analys. Förvaras vid 4 ° C fram till användning.
      3. Överför 10 mL BM till en ny 50 mL koniska tub, tillsätt 6 mL PBS/EDTA (2 mM), 20 mL av mänskligt lymfocyter medium, 175 µL av kollagenas B (40 mg/mL) och 175 µL av DNAS jag (10 mg/mL). Blanda lösningen försiktigt och inkubera i 30 min på RT på en shaker. Upprepa för återstående BM provet.
    3. Densitet gradient centrifugering
      1. Prime en 50 mL tub täthet lutning centrifugering genom att tillämpa 15 mL av mänskligt lymfocyter separera medium i en 50 mL tub. Centrifugera vid 1 000 x g under 30 s.
      2. Försiktigt skikta 35 mL utspädd BM på toppen av densitet gradient centrifugering tube filter och centrifugera vid 445 x g under 35 minuter på RT.
        Obs: Centrifugera inställningar är låg acceleration (3) och ingen broms (1).
      3. Ta försiktigt bort röret från centrifugen utan att skaka. Noggrant kasta ~ 20 mL från den övre klara lösningen utan att vidröra det molniga lagret direkt ovanpå filtret.
      4. Noggrant överför grumlig lagret (som är direkt ovanpå filtret och innehåller mononukleära celler (multinationella)) in i en ny 50 mL koniska rör och fylla med PBS/EDTA till en slutlig volym 50 ml.
        Obs: Kombinera alla multinationella företag från en BM patientprov i en ny tub.
      5. Räkna de multinationella företag genom att överföra 10 µL av 50 mL cellsuspension i ett 1,5 mL rör. Tillsätt 10 µL 3% ättiksyra med metylenblått. Blanda försiktigt och tillsätt 10 µL in en räknande kammaren. Beräkna antalet multinationella företag.
      6. Centrifugera MNC suspensionen vid 300 x g i 10 min. avlägsna supernatanten.
        Obs: Under centrifugeringen, svalna centrifugen från RT till 4 ° C.
    4. Magnetiska urval av CD133+ SCs använder mänskliga CD133 antikropp-länkade superparamagnetiska järn dextran partiklar
      Obs: Under detta steg, arbeta på is. Butikslösningar fram till användning vid 4 ° C. Lagra MACS permanentmagnet, Separationskolonner och före separation filter vid 4 ° C.
      1. Välj den kolumnstorleken. För < 1,2 x 108 multinationella, Använd MS kolumner, och för > 1,2 x 108 multinationella företag, använda LS kolumner (se Tabell för material).
      2. För att förbereda för magnetiska 1 x 108 totala cell nummer, noggrant Återsuspendera multinationella företag i 300 µL MACS buffert (4 ° C). Tillsätt 100 µL FcR blockerande reagens (4 ° C) och 100 µL CD133 antikropp-länkade superparamagnetiska järn dextran partiklar (4 ° C).
      3. Blanda cellsuspensionen försiktigt och inkubera i 30 minuter vid 4 ° C. Skaka försiktigt cellsuspensionen under inkuberingen (2 – 3 x).
      4. Tillsätt 2 mL av MACS buffert (4 ° C) per 1 x 108 totalt multinationella. Blanda försiktigt cellsuspension och centrifugera vid 300 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
      5. Ställ in den MACS magnet hållaren och bifoga den MACS permanentmagnet. Installera Mac-kolumnen och använda filtret före separation på toppen.
      6. Temperera den första Mac-MS/LS kolumn och före separation filter med 0,5 mL (MS) eller 3 mL (LS) Mac-buffert (4 ° C).
        Obs: Låt aldrig kolumnerna MACAR att torka ut efter Jämviktstiden.
      7. Avlägsna supernatanten och återsuspendera erhållna pelleten i 500 µL av MACS buffert (4 ° C) per 1 x 108 summacell belopp. Applicera cellsuspensionen i filtret före separationen.
      8. Tvätta MACS kolumn och före separation filtret tre gånger med, för varje tvätt, 0,5 mL (MS) eller 3 mL (LS) Mac buffert (4 ° C).
        Obs: Under tredje tvätt-steg, installera en andra Mac-datorer-kolumn i den MACS permanentmagnet och temperera den andra Mac-datorer MS/LS kolumnen med 0,5 mL (MS) eller 3 mL (LS) Mac-buffert (4 ° C).
      9. Kassera filtret före separationen.
      10. Eluera cell fraktionen direkt på den andra Mac-kolumnen: Lägg till 1 mL (MS) eller 5 mL (LS) Mac-buffert (4 ° C) på den första Mac-kolumnen och ta bort kolumnen Mac från Mac-datorer permanent magneten. Omedelbart överföra den första Mac-kolumnen ovan den andra Mac-kolumnen och tryck cellsuspensionen genom kolumnen Mac använda medföljande kolven.
      11. Tvätta i Mac-kolumnen tre gånger, med för varje tvätt 0,5 mL (MS) eller 3 mL (LS) Mac buffert (4 ° C).
      12. Eluera de cell-fraktionen från kolumnen genom att lägga till 1 mL (MS) eller 5 mL (LS) Mac-buffert (4 ° C) på den andra Mac-kolumnen och ta bort kolumnen Mac från Mac-datorer permanent magneten. Omedelbart överföra den andra Mac-kolumnen ovan ett 1,5 mL rör (MS) eller 15 mL koniska tube (LS) och skjut cellsuspensionen genom kolumnen Mac använda medföljande kolven.
      13. Centrifugera vid 300 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Noggrant avlägsna supernatanten och återsuspendera erhållna pelleten i 100 µL av MACS buffert (4 ° C).
      14. Räkna CD133+ celler: överföring 6 µL cellsuspension i ett 1,5 mL rör. Tillsätt 6 µL trypan blå lösning (0,4%). Blanda försiktigt och tillsätt 10 µL in en räknande kammaren. Beräkna antalet CD133+ celler.
      15. Lagra CD133+ celler på is fram till sådd.
  2. Karakterisering av nymalen isolerade CD133+ SCs
    Obs: Följande arbeten ska utföras i ett rum som skyddat från starkt ljus (dim belysning endast). Hålla rören, buffertar och antikroppar på is om inte annat anges.
    1. Beredning av SCs för flöde flödescytometrisk analys
      1. Använd två prover (varje 10 µL) BM alikvoter och ett urval av nybakade isolerade CD133+ SCs (minimum, 1 x 104 celler) för analys. Överföra cellerna i ett 1,5 mL rör. Tillsätt 10 µL av FcR blockerar reagens och fylla upp med MACS buffert (4 ° C) till en volym av 33 µL.
      2. Lägg till följande antikroppar på insidan av respektive sond (se tabell 1): anti-CD34-fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC) (klon: AC136), anti-CD133/2-fykoerytrin (PE) (klon: 293C (3), isotyp styra mus IgG 2b-PE, anti-CD45-allophycocyanin () APC)-H7 (klon: 2D 1), och 7-aminoactinomycin (AAD). Efter alla antikroppar har lagts, skaka ner antikroppar sidan av röret. Blanda lösningen (slutlig volym 50 µL) försiktigt och inkubera i 10 minuter vid 4 ° C.
      3. Tillsätt 1 mL 1 x röda blodkroppar (RBC) lyseringsbuffert försiktigt blanda fjädringen och inkubera på is 10 min. Centrifugera suspensionen vid 300 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
      4. Avlägsna supernatanten och återsuspendera erhållna pelleten i 100 µL PBS (4 ° C). Förvaras på is tills flödet flödescytometrisk analys.
    2. Flow flödescytometrisk analys av CD133+ SCs
      1. Att undersöka cellernas viabilitet och renhet CD133+ SC, använda en anpassad International Society av Hematotherapy och Graft Engineering (ISHAGE) flöde flödescytometri Usenets strategi41 (se representativa skildringen i figur 1). Använd följande ordning:
        Steg 1: val av cell befolkningen (figur 1A)
        Steg 2: urval av CD45+ celler (figur 1B)
        Steg 3: urval av livskraftiga CD45+ celler (figur 1 c)
        Steg 4: urval av livskraftiga CD45+/CD34+ celler (figur 1 d)
        Steg 5: urval av livskraftiga CD45+/CD34+/CD133+ celler (figur 1E)
        Kör flödescytometer (se Tabell för material) enligt tillverkarens anvisningar.
      2. Beräkna cellernas viabilitet och renhet med hjälp av följande ekvationer:

Equation 1   Ekvation 1

Equation 2   Ekvation 2

  1. Cellodling av nymalen isolerade CD133+ SCs
    1. Alikvotens 100 x rekombinant humant cytokin komplettera i 100 µL portioner och förvaras vid-20 ° C. Tina en 100 x alikvot innan medium.
    2. Förbereda CD133+ SC odlingsmedium, serumfritt hematopoetiska celler expansion medium kompletteras med rekombinant humant cytokin tillägg (final 1 x) och 1% penicillin/streptomycin.
    3. Utsäde 5 x 104 isolerade nymalen CD133+ SCs för transfection i en 24-well platta med 500 µL odlingsmedium. Inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2 och 20% O2.
      Obs: Utsäde 5 x 104 färska isolerade CD133+ SCs som en kontroll för flow flödescytometrisk analys.

2. upprättande av Transfection komplex

Obs: Detta steg, hålla det hela arbetet utrymme ribonunkleas (RNAse)-gratis med RNAse sanering lösning och använda endast RNAse-fri förbrukningsmaterial.

  1. Beredning av miR
    Obs: Följande arbeten ska utföras i ett rum som skyddat från starkt ljus (dim belysning endast).
    Obs: för miR-preparatet: Använd cyanin 3 dye märkt föregångare miR och omärkt föregångare miR.
    1. För att förbereda miR stamlösning (50 µM), späd den önskade mängden miR i lämplig volym av nuclease-fritt vatten (t.ex., späd 5 nmol Mir i 100 µL vatten). Försiktigt blanda lösningen, alikvotens miR beståndet (5 µL) och förvaras vid högst-20 ° C.
  2. Beredning av PEI
    1. Förbereda den PEI följande standardprotokoll och not PEI lager koncentration31,42 .
  3. Beredning av MNP
    1. Förbereda de MNPs efter standardprotokoll och notera de MNP lagerföra koncentration31,42.
  4. Beredning av miR/PEI komplex
    1. Förbereda 5% glukoslösning genom att späda ut D-(+)-glukos i nuclease-gratis vatten. Försiktigt blanda lösningen, alikvotens beståndet (1,5 mL), och lagras vid 4 ° C.
      Obs: Följande arbeten ska utföras i ett rum som skyddat från starkt ljus (dim belysning endast).
    2. Använd 20 pmol miR per väl av en 24-väl tallrik30. Späd miR i 5% glukoslösning till en slutlig koncentration på 0,25 pmol miR/µL.
    3. Beräkna mängden PEI krävs baserat på miR belopp (20 pmol, steg 2.3.1) och optimal kväve (av PEI) till fosfat (av miR) (N/P) baserat baserat på PEI lager koncentrationen (steg 2.2.1; här, en kvot på 7,5 användes)30. Späd PEI i en lika stor mängd 5% glukoslösning baserad på ekvationen:
      Equation 3
      som ordnar till
      Equation 4    Ekvation 3
      där PEI volym µL och [PEI] är i mM, och N/P (optimerad för detta protokoll) är 0,75. 0,12 är en konverteringsfaktor som är specifika för miR.
    4. Lägg till den pre utspädda PEI i förväg utspädda miR och virvel för 30 s.
    5. Inkubera i miR/PEI komplex för 30 min vid RT.
  5. Beredning av miR/PEI/MNP komplexen
    Obs: Följande arbeten ska utföras i ett rum som skyddat från starkt ljus (dim belysning endast).
    1. Samtidigt ruvning miR/PEI komplexen, förbereda MNPs av sonicating MNPs i 20 min vid 35 kHz i sonicating vattenbadet på RT att säkerställa partiklar i suspension och inte aggregering.
    2. Beräkna antalet nödvändiga MNPs (järn 3 µg/mL) baserat på MNP stamlösning (steg 2.3.1).
    3. Lägg till de sonicated MNPs in i miR/PEI komplex och vortex för 30 s. Inkubera miR/PEI/MNP komplexen i 30 min på RT.
  6. Förberedelse av de transfection komplex för fyrfärg märkning med SIM-
    Obs: Använda omärkta föregångare miR.
    1. Etikett miR med cyanin 5 dye använder en cyanin 5 dye miR märkning kit (se Tabell för material) efter tillverkarens anvisningar. Mätning av slutliga miR koncentrationen med den börsnoterade spektrofotometern (se Tabell för material) i enlighet med den förinställning som tillhandahålls av tillverkaren (nukleinsyra, RNA-40). Delprov i miR (5 µL) och store vid-80 ° C skyddas från ljus.
    2. Märka PEI med ett ljust grön fluorescens dye använder en lämplig protein märkning kit (se Tabell för material) efter tillverkarens anvisningar. Definiera slutliga PEI koncentration med Ninhydrin analys (steg 2.2.1). Alikvot PEI (i volym beräknas utifrån ekvation 3) och förvaras vid 4 ° C skyddas från ljus.
    3. Etikett i MNPs med rodamin färgämne konjugerat till biotin med ett förhållande på 1:1,000 w/w, färga till MNP. Blanda rodamin färgämne och MNPs parallellt med utarbetandet av miR/PEI komplexa bildandet och inkubera lösningen för 30 min i mörker. Direkt använda märkt MNPs.

3. transfection av CD133+ SCs

Obs: Detta steg, hålla det hela arbetet utrymme ribonunkleas (RNAse)-gratis med RNAse sanering lösning och använda endast RNAse-fri förbrukningsmaterial
Obs: Följande arbeten ska utföras i ett rum som skyddat från starkt ljus (dim belysning endast).

  1. Lägg till beredda miRNA/PEI/MNP komplexet droppvis direkt i lämpliga brunnen som innehåller den fräscha isolerade CD133+ SCs i odlingsmedium.
  2. Blanda försiktigt genom att gunga plattan fram och tillbaka. Inkubera cellerna under 18 timmar vid 37 ° C, 5% CO2 och 20% O2.

4. analys av miR Transfection

  1. Undersökning av miR upptag effektivitet och cytotoxiciteten hos transfection komplex
    Obs: för miR-preparatet: Använd cyanin 3 färg märkt föregångare miR för upptag utvärdering och icke-transfekterade CD133+ SCs för flöde flödescytometri kontroll grindarna.
    Obs: Följande arbeten ska utföras i ett rum som skyddat från starkt ljus (dim belysning endast).
    Obs: Hålla rören, buffertar och antikroppar på is om inte annat anges.
    1. Förbereda PARAFORMALDEHYD stamlösning (PFA, 4%) genom att späda ut 4 g PFA i 100 mL PBS och värme lösningen på 80 ° C. Kraftfullt blanda lösningen och justera pH-värdet till 7,3. Delmängd av PFA lagerför (1,5 mL) och förvaras vid-20 ° C.
    2. 18 h efter transfection, samla varje brunn i en separat 1,5 mL tub. Tvätta vart väl en gång med 500 µL av PBS och överföra denna cellsuspension till en och samma tub.
    3. Centrifugera vid 300 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och återsuspendera erhållna pelleten i 100 µL av 4 ° C MACS buffert.
    4. Tillsätt 0,5 µL av en amine reaktiva färgämne att skilja mellan levande och döda celler, försiktigt blanda fjädringen och inkubera i 10 minuter vid 4 ° C. Tillsätt 1 mL PBS (4 ° C) och centrifugera vid 300 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
    5. Tag bort supernatanten, Återsuspendera erhållna pelleten i 100 µL PBS, tillsätt 33 µL PFA (4%) och lagra på is eller vid 4 ° C tills flödet flödescytometrisk analys.
    6. Ordna den portande strategin enligt representativa skildringen i figur 2. Kör exemplen på en flödescytometer (se Tabell för material) enligt tillverkarens anvisningar.
  2. Karakterisering av den miR-transfekterade CD133+ SCs
    Obs: Används omärkt föregångare miR samt icke-transfekterade CD133+ SCs flöde flödescytometri kontroll Gates.
    1. Samla varje väl i ett separat 1,5 mL rör och centrifugera vid 300 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
    2. Använd den portande strategin som beskrivs i steg 1.2.
  3. Undersökning av intracellulär distribution av transfection komplex av SIM
    1. Förbereda komplexen och transfect celler som beskrivs i avsnitt 2 och avsnitt 3.
    2. 18 h efter transfection, samla varje brunn i en separat 1,5 mL tub. Tvätta vart väl en gång med 500 µL av PBS och överför tvätten till brunnens respektive tube. Centrifugera vid 300 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
    3. Avlägsna supernatanten och återsuspendera erhållna pelleten i 1 mL 2% fetalt bovint serum (FBS) i PBS, försiktigt blanda fjädringen och centrifugera 300 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
    4. Avlägsna supernatanten och återsuspendera erhållna pelleten i 100 µL av PBS tillsätt 33 µL PFA (4%) i 20 min.
    5. Över cellen till en ny 24-kultur-platta som innehåller steril glas coverslips och centrifugera vid 300 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
    6. Avlägsna supernatanten och tillsätt 500 µL av PBS. Försiktigt skaka plattan och kassera PBS.
    7. Placera den beredda coverslips på de mikroskopiska diabilder med aqueous monteringsmedium att bevara fluorescens och torka dem på RT för minst 1 h.
    8. Skaffa bilder med hjälp av en 100 X oljeimmersionsobjektivet. SIM-inställningar: 405, 488, 561 och 633 nm laserlinjerna för magnetisering och z-stackar med ett 16-bitars djup på 3 vinklar, 3 faser, med i genomsnitt 4, nät per laserlinjen: 23 µm – 405, 34 µm – 488, 42 µm – 561, 51 µm – 633.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Presenterade protokollet beskriver en manuell isolering och magnetisk anrikning av mänskliga BM-derived CD133+ SCs med en efterföljande virus oberoende cell teknik strategi, som en icke-invasiv teknik för in vitro- cell manipulation och i vivo övervakningsverktyg.

Denna tre-stegs isolering teknik tillåter en separation av multinationella företag från den pre sammandrag sternala BM genom täthet lutning centrifugering. Efteråt, en CD133+ cell bråkdel magnetiskt kan berikas med lämplig isolering teknik. Detta tillåter en anrikning av CD133+ SCs med livskraft och renhet som är högre än 80%, vilket kan avgöras genom flödescytometri (figur 1). Nedan, användes endast SC produkter som matchar kraven för ytterligare experiment.

Transfection metoden beskrivs här tillåter en mycket effektiv introduktion av miR i dessa isolerade nymalen mänskliga CD133+ SCs med ett upptag av ca 80% av livskraftiga celler (figur 2)30. Dessutom finns det inga betydande cytotoxiska effekter uppenbart 18 h efter transfection jämfört med kontrollgruppen celler (figur 2)30. Dessutom kan en tillräcklig och vanliga distribution transfection komplexa föreningar (miR, PEI och MNPs) observeras inom cytoplasman i celler med SIM (figur 3).

Figure 1
Figur 1: Representant Boolean gating strategi för CD133+ SC karakterisering. (A-E) Skildring av en 5-stegs val av strategi för en noggrann utvärdering av cellernas viabilitet och renhet av isolerade CD133+ SC samt (F) CD133 isotypen kontroll med hjälp av lämpliga obehandlad BM provet. (A) exklusive skräp från intakt cell befolkningen i fram/sida (FSC/SSC) dot spridningsdiagram, följt av successiva val av (B) CD45+ cell befolkningen, (C) livskraftiga CD45+ cell befolkningen, (D) livskraftig dubbel positiv CD45+/CD34+ cell befolkningen, och (E) livskraftiga trippel positiva CD45+/CD34+/CD133+ cell befolkningen. Orange: CD45+/CD34+/CD133+ celler markeras inom varje urval steg. Legend: APC-Cy7: anti-CD45, FITC: anti-CD34, FSC: framåt Scatter kanal, PE: anti-CD133, SSC: Side Scatter kanal, 7-AAD: 7-aminoactinomycin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: representativa gating strategi för utvärdering av miR upptag effektivitet och cytotoxiciteten hos den komplexa transfection. Usenets strategier (A, B) transfekterade CD133+ SCs-samt som (C, D) icke-transfekterade CD133+ SCs för analyser av (A, C) Cyanine3 dye märkt föregångare-miRNA upptag effektivitet () röd: livskraftig Cy3+ celler) och (B, D) cytotoxiska effekter av transfection förfarandet präglas av en amine reaktiva färgämne att skilja mellan levande och döda celler (blå: döda celler). Legend: SSC: Side Scatter kanal, celler endast: icke-transfekterade CD133+ SCs, miRNA/PEI/MNP: CD133+ SCs transfekterade med Cy3-märkt miR vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: intracellulära visualisering av den komplexa transfection. CD133+ SCs var transfekterade med tre färger heter miR/PEI/MNP komplexa (miR: 20 pmol, PEI: N/P förhållandet 7.5, MNP: 3 µg/mL). Representativa visualisering utfördes 18 h efter transfection använder strukturerade belysningen mikroskopi. MiR var märkt med Cyanine5 färgämne (röd), PEI med en ljus grön fluorescens färg (grön), och MNPs med rodamin färgämne konjugerat till biotin (gul), och kärnan var counterstained med DAPI (blå). Skalstapeln = 5 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

prov FCR blockerande reagens [µL] MACS buffert [µL] antikroppar [µL] totalt [µL]
antal preparatet celler [µL] CD133-PE-isotyp CD133-PE CD34-FITC CD45-APC-Cy7 LÄGG TILL
1 BM 10 10 12.5 5 - 5 2.5 5 50
2 BM 10 10 12.5 - 5 5 2.5 5 50
3 CD133+ (1 x 104) 10 12.5 - 5 5 2.5 5 50

Tabell 1: pipettering layout för karakterisering av CD133 + SCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Under de senaste åren, CD133+ SCs har dykt upp som en lovande cell befolkningen för SC-baserade terapier vilket framgår av flera fas I, II och III kliniska prövningar43,44,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för standardiserade manuell rening och flöde flödescytometrisk karakterisering av dessa celler från mänskliga sternala BM. Förfarandet beskrivs Mac-baserade isolering representerar en skonsam, snabb och effektiv strategi för att få en mycket ren och livskraftig hematopoetiska SC bråkdel. Den god kompatibilitet i kombination med den snabba nedbrytningen av samtidig injicerade MACS mikrokulor används för cellen sortering har visats tidigare i vår grupp55,56.

Proceduren isolering utvecklades med mänskliga sternala BM som utgångsmaterial, och protokollet kan därför för närvarande rening av hematopoetiska SCs avsedd för användning i icke-kliniska forskning. Om CD133+ SCs är isolerade från andra vävnader (t.ex. BM erhållits från höftbenskammen) flera steg i protokollet såsom enzymatisk vävnad matsmältningen och densitet centrifugering kan kräva anpassning. För kliniska cell program, vår grupp ytterligare etablerat en egen tillverkningsmetod som GMP-conformant använder den automatiska system för att uppfylla ytterligare krav för kliniska behov57.

Konstruktion av SCs före sin ansökan är en ny strategi för att övervinna vissa hinder i SC terapi, inklusive lågt retention och massiva celldöd. Det nuvarande protokollet består av instruktioner för produktion av en viral-fri multifunktionella transfection system baserat på grenade PEI bunden till MNPs och dess effektiva införande i CD133+ SCs30. Tillämpningen av detta system möjliggör genetisk cell modifiering, magnetiskt kontrollerade cell vägledning och icke-invasiv cell spårning via MRI eller MPI30,31,40,42,58 , 59 , 60.

Ännu viktigare, villkor som beskrivs transfection har optimerats för övergående genetisk modifiering av CD133+ BM-derived SCs30. I tidigare verk, här transfection system har också framgångsrikt använts för leverans av plasmid DNA och miR till andra cell typer31,40,60. Dessa experiment har visat att transfection effektivitet samt cytotoxicitet är cell typberoende. Därför, den optimala kompositioner av NAs, PEI och MNPs måste definieras för varje celltyp.

På grund av dess höga effektivitet är PEI en av de vanligaste polymererna för icke-virala genetiska cell engineering61. Den kliniska tillämpning61,62 av PEI är dock mycket begränsad hittills på grund av dess allmän toxicitet61,63. Intressant, visat vår grupp nyligen att MNPs minska PEI toxicitet när ingår i transfection system31,60. Samtidigt, den möjliga toxiciteten av järnoxid baserat nanopartiklar orsakas av produktionen av reaktiva syreradikaler (ROS) är dosberoende och flera typer av superparamagnetiska nanopartiklar är godkända för MRI64,65 . Dock måste uppmärksammas att toxiciteten av systemet in vitro- och in vivo.

Sammantaget är protokollet ganska komplexa, som innehåller många kritiska steg som behöver åtgärdas mycket noggrant. För detta ändamål har vi betonat dessa punkter i avsnittet protokoll med noter. I synnerhet vill vi påpeka vikten av en helt RNAse-fri miljö och undvika eventuella ljusexponering vid hantering av tillämpad fluorescerande färgerna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar någon intressekonflikt.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av det federala ministeriet för utbildning och forskning Tyskland (FKZ 0312138A och FKZ 316159), den statliga Mecklenburg-Västra Pomerania med EU: S strukturfonder (ESF/IVWM-B34-0030/10 och ESF/IVBM-B35-0010/12) och DFGEN (DA1296/2-1), den Tyska hjärtat Foundation (F/01/12), BMBF (VIP + 00240) och fuktig Foundation. Dessutom stöds F.H. och P.M. av FORUN Program av Rostock University Medical Centre (889001).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-AAD BD Biosciences 559925
Acetic Acid with Methylene Blue Stemcell Technologies 7060 3%
anti-CD133/2-PE (clone: 293C3) Miltenyi Biotec GmbH 130-090-853
anti-CD34-FITC (clone: AC136) Miltenyi Biotec GmbH 130-081-001
anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1) BD Biosciences 560178
rhodamine dye; Atto 565 dye conjugated to biotin ATTO-TEC GmbH AD 565-71
BD FACS LSRII flow cytometer BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2 BD Biosciences
BSA Sigma-Aldrich GmbH A7906
CD133 antibody-linked superparamagnetic iron dextran particles; CD133 MicroBead Kit Miltenyi Biotec GmbH 130-097-049
collagenase B Roche Diagnostics GmbH 11088831001
counting chamber Paul Marienfeld GmbH & Co. KG
Cyanine 3 dye labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 Ambion AM17120
Cyanine 5 dye miR labelling kit; Cy5 dye Label IT miRNA Labeling Kit Mirus Bio MIR 9650
DNAse I Roche Diagnostics GmbH 10104159001 (100 U/mL)
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope Carl Zeiss Jena GmbH
FcR Blocking Reagent, human Miltenyi Biotec GmbH 130-059-901
bright green protein labeling kit; Oregon Green 488 Protein Labeling Kit Thermo Fisher Scientific O10241
aqueous mounting medium; Fluoroshield Sigma-Aldrich GmbH F6182
density gradient centrifugation tube; Leukosep Centrifuge Tube Greiner Bio-One 89048-932
MACS magnet holder; MACS MultiStand Miltenyi Biotec GmbH 130-042-303
MACS pre-separation filter Miltenyi Biotec GmbH 130-041-407 30 µm
MACS separation column (MS / LS) Miltenyi Biotec GmbH 130-042-201 / 130-042-401
MACS permanent magnet; MACS Separator Miltenyi Biotec GmbH 130-042-302
Millex-HV PVDF Filter Merck SLHV013SL 0.45 μm
mouse IgG 2b-PE Miltenyi Biotec GmbH 130-092-215
amine reactive dye; Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
human lymphocyte separating medium; Pancoll Pan Biotech GmbH P04-60500 density: 1.077 g/mL
PBS Pan Biotech GmbH P04-53500 without Ca and Mg
PEI Sigma-Aldrich GmbH 408727 branched; 25 kDa
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 100 U/mL, 100 μg/mL
PFA Merck Schuchardt OHG 1040051000
unlabelled precursor miR; Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 Ambion AM17110
RBC lysis buffer eBioscience 00-4333-57
RNAse decontamination solution; RNaseZap Thermo Fisher Scientific AM9780
human lymphocyte medium; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Pan Biotech GmbH P04-16500
recombinant human cytokine supplement; StemSpan CC100 Stemcell Technologies 2690
serum-free haematopoietic cell expansion medium; StemSpan H3000 Stemcell Technologies 9800
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles Promega Corporation Z5481
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich GmbH T8154 0.4 %
UltraPure EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 0.5 M; pH 8.0
ZEN2011 software Carl Zeiss Jena GmbH
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Sonorex RK 100 SH sonicating water bath Bandelin electronic Ultrasonic nominal output: 80 W; Ultrasonic frequency: 35 kHz

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meregalli, M., Farini, A., Belicchi, M., Torrente, Y. CD133(+) cells isolated from various sources and their role in future clinical perspectives. Expert opinion on biological therapy. 10 (11), 1521-1528 (2010).
  2. Lee, S., Yoon, Y. -S. Revisiting cardiovascular regeneration with bone marrow-derived angiogenic and vasculogenic cells. British journal of pharmacology. 169 (2), 290-303 (2013).
  3. Beksac, M., Preffer, F. Is it time to revisit our current hematopoietic progenitor cell quantification methods in the clinic? Bone marrow transplantation. 47 (11), 1391-1396 (2012).
  4. Bongiovanni, D., et al. The CD133+ cell as advanced medicinal product for myocardial and limb ischemia. Stem cells and development. 23 (20), 2403-2421 (2014).
  5. Wang, X., et al. The Clinical Status of Stem Cell Therapy for Ischemic Cardiomyopathy. Stem cells international. 2015, 135023 (2015).
  6. Ma, N., et al. Intramyocardial delivery of human CD133+ cells in a SCID mouse cryoinjury model: Bone marrow vs. cord blood-derived cells. Cardiovascular research. 71 (1), 158-169 (2006).
  7. Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
  8. Wang, D., Gao, G. State-of-the-art human gene therapy: part I. Gene delivery technologies. Discovery medicine. 18 (97), 67-77 (2014).
  9. Sart, S., Ma, T., Li, Y. Preconditioning stem cells for in vivo delivery. BioResearch open access. 3 (4), 137-149 (2014).
  10. Liu, J., et al. Early stem cell engraftment predicts late cardiac functional recovery: preclinical insights from molecular imaging. Circulation. Cardiovascular imaging. 5 (4), 481-490 (2012).
  11. Lang, C., et al. In vivo comparison of the acute retention of stem cell derivatives and fibroblasts after intramyocardial transplantation in the mouse model. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 41 (12), 2325-2336 (2014).
  12. Goussetis, E., et al. Intracoronary infusion of CD133+ and CD133-CD34+ selected autologous bone marrow progenitor cells in patients with chronic ischemic cardiomyopathy: cell isolation, adherence to the infarcted area, and body distribution. Stem cells. 24 (10), Dayton, Ohio. 2279-2283 (2006).
  13. Caveliers, V., et al. In vivo visualization of 111In labeled CD133+ peripheral blood stem cells after intracoronary administration in patients with chronic ischemic heart disease. Q J Nucl Med Mol Imaging. 51 (1), 61-66 (2007).
  14. Terrovitis, J. V., Smith, R. R., Marbán, E. Assessment and optimization of cell engraftment after transplantation into the heart. Circulation research. 106 (3), 479-494 (2010).
  15. Rosado-de-Castro, P. H., et al. Biodistribution of bone marrow mononuclear cells after intra-arterial or intravenous transplantation in subacute stroke patients. Regenerative medicine. 8 (2), 145-155 (2013).
  16. Kang, W. J., Kang, H. -J., Kim, H. -S., Chung, J. -K., Lee, M. C., Lee, D. S. Tissue distribution of 18F-FDG-labeled peripheral hematopoietic stem cells after intracoronary administration in patients with myocardial infarction. Journal of nuclear medicine official publication, Society of Nuclear Medicine. 47 (8), 1295-1301 (2006).
  17. Blocklet, D., et al. Myocardial homing of nonmobilized peripheral-blood CD34+ cells after intracoronary injection. Stem cells. 24 (2), Dayton, Ohio. 333-336 (2006).
  18. Penicka, M., et al. One-day kinetics of myocardial engraftment after intracoronary injection of bone marrow mononuclear cells in patients with acute and chronic myocardial infarction. Heart (British Cardiac Society). 93 (7), 837-841 (2007).
  19. Schächinger, V., et al. Pilot trial on determinants of progenitor cell recruitment to the infarcted human myocardium. Circulation. 118 (14), 1425-1432 (2008).
  20. Dedobbeleer, C., et al. Myocardial homing and coronary endothelial function after autologous blood CD34+ progenitor cells intracoronary injection in the chronic phase of myocardial infarction. Journal of cardiovascular pharmacology. 53 (6), 480-485 (2009).
  21. Musialek, P., et al. Randomized transcoronary delivery of CD34(+) cells with perfusion versus stop-flow method in patients with recent myocardial infarction: Early cardiac retention of (m)Tc-labeled cells activity. Journal of nuclear cardiology official publication of the American Society of Nuclear Cardiology. 18 (1), 104-116 (2011).
  22. Kyrtatos, P. G., et al. Magnetic tagging increases delivery of circulating progenitors in vascular injury. JACC. Cardiovascular interventions. 2 (8), 794-802 (2009).
  23. Vandergriff, A. C., et al. Magnetic targeting of cardiosphere-derived stem cells with ferumoxytol nanoparticles for treating rats with myocardial infarction. Biomaterials. 35 (30), 8528-8539 (2014).
  24. Huang, Z., et al. Magnetic targeting enhances retrograde cell retention in a rat model of myocardial infarction. Stem cell research & therapy. 4 (6), 149 (2013).
  25. Yanai, A., et al. Focused magnetic stem cell targeting to the retina using superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Cell transplantation. 21 (6), 1137-1148 (2012).
  26. Arbab, A. S., Jordan, E. K., Wilson, L. B., Yocum, G. T., Lewis, B. K., Frank, J. A. In vivo trafficking and targeted delivery of magnetically labeled stem cells. Human gene therapy. 15 (4), 351-360 (2004).
  27. Cores, J., Caranasos, T. G., Cheng, K. Magnetically Targeted Stem Cell Delivery for Regenerative Medicine. Journal of functional biomaterials. 6 (3), 526-546 (2015).
  28. Cheng, K., et al. Magnetic enhancement of cell retention, engraftment, and functional benefit after intracoronary delivery of cardiac-derived stem cells in a rat model of ischemia/reperfusion. Cell transplant. 21 (6), 1121-1135 (2012).
  29. Li, W., et al. Enhanced thoracic gene delivery by magnetic nanobead-mediated vector. The journal of gene medicine. 10 (8), 897-909 (2008).
  30. Müller, P., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem cells international. 2016, 7152761 (2016).
  31. Voronina, N., et al. Non-viral magnetic engineering of endothelial cells with microRNA and plasmid-DNA-An optimized targeting approach. Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. , (2016).
  32. Noort, W. A., et al. Mesenchymal stromal cells to treat cardiovascular disease: strategies to improve survival and therapeutic results. Panminerva Med. 52 (1), 27-40 (2010).
  33. Jakob, P., Landmesser, U. Role of microRNAs in stem/progenitor cells and cardiovascular repair. Cardiovascular Research. 93 (4), 614-622 (2012).
  34. Sen, C. K. MicroRNAs as new maestro conducting the expanding symphony orchestra of regenerative and reparative medicine. Physiological genomics. 43 (10), 517-520 (2011).
  35. Papapetrou, E. P., Zoumbos, N. C., Athanassiadou, A. Genetic modification of hematopoietic stem cells with nonviral systems: past progress and future prospects. Gene therapy. 12, Suppl 1. S118-S130 (2005).
  36. Chira, S., et al. Progresses towards safe and efficient gene therapy vectors. Oncotarget. 6 (31), 30675-30703 (2015).
  37. Hobel, S., Aigner, A. Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo. Wiley interdisciplinary reviews. Nanomedicine and nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).
  38. Villate-Beitia, I., Puras, G., Zarate, J., Agirre, M., Ojeda, E., Pedraz, J. L. First Insights into Non-invasive Administration Routes for Non-viral Gene Therapy. Gene Therapy - Principles and Challenges. Hashad, D. , (2015).
  39. Cubillos-Ruiz, J. R., Sempere, L. F., Conejo-Garcia, J. R. Good things come in small packages: Therapeutic anti-tumor immunity induced by microRNA nanoparticles. Oncoimmunology. 1 (6), 968-970 (2012).
  40. Schade, A., et al. Magnetic nanoparticle based nonviral microRNA delivery into freshly isolated CD105(+) hMSCs. Stem Cells Int. 2014, 197154 (2014).
  41. Sutherland, D. R., Anderson, L., Keeney, M., Nayar, R., Chin-Yee, I. The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. International society of hematotherapy and graft engineering. Journal of hematotherapy. 5 (3), 213-226 (1996).
  42. Voronina, N., et al. Preparation and in vitro characterization of magnetized mir-modified endothelial cells. Journal of visualized experiments. (123), (2017).
  43. Stamm, C., et al. Intramyocardial delivery of CD133+ bone marrow cells and coronary artery bypass grafting for chronic ischemic heart disease:Safety and efficacy studies. The journal of thoracic and cardiovascular surgery. 133 (3), 717-725 (2007).
  44. King, A., et al. REpeated AutoLogous Infusions of STem cells In Cirrhosis (REALISTIC): A multicentre, phase II, open-label, randomised controlled trial of repeated autologous infusions of granulocyte colony-stimulating factor (GCSF) mobilised CD133+ bone marrow stem cells in patients with cirrhosis. A study protocol for a randomised controlled trial. BMJ open. 5 (3), e007700 (2015).
  45. Martinez, H. R., et al. Stem cell transplantation in amyotrophic lateral sclerosis patients: methodological approach, safety, and feasibility. Cell transplantation. 21 (9), 1899-1907 (2012).
  46. Jimenez-Quevedo, P., et al. Selected CD133(+) progenitor cells to promote angiogenesis in patients with refractory angina: final results of the PROGENITOR randomized trial. Circulation research. 115 (11), 950-960 (2014).
  47. Raval, A. N., et al. Bilateral administration of autologous CD133+ cells in ambulatory patients with refractory critical limb ischemia: lessons learned from a pilot randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Cytotherapy. 16 (12), 1720-1732 (2014).
  48. Andreone, P., et al. Reinfusion of highly purified CD133+ bone marrow-derived stem/progenitor cells in patients with end-stage liver disease: A phase I clinical trial. Digestive and liver disease. 47 (12), 1059-1066 (2015).
  49. Arici, V., et al. Autologous immuno magnetically selected CD133+ stem cells in the treatment of no-option critical limb ischemia: clinical and contrast enhanced ultrasound assessed results in eight patients. Journal of translational medicine. 13, 342 (2015).
  50. Zali, A., et al. Intrathecal injection of CD133-positive enriched bone marrow progenitor cells in children with cerebral palsy: feasibility and safety. Cytotherapy. 17 (2), 232-241 (2015).
  51. Al-Zoubi, A., et al. Transplantation of purified autologous leukapheresis-derived CD34+ and CD133+ stem cells for patients with chronic spinal cord injuries: long-term evaluation of safety and efficacy. Cell transplantation. 23, Suppl 1. S25-S34 (2014).
  52. Isidori, A., et al. Positive selection and transplantation of autologous highly purified CD133(+) stem cells in resistant/relapsed chronic lymphocytic leukemia patients results in rapid hematopoietic reconstitution without an adequate leukemic cell purging. Biology of blood and marrow transplantation. 13 (10), 1224-1232 (2007).
  53. Nasseri, B. A., et al. Autologous CD133+ bone marrow cells and bypass grafting for regeneration of ischaemic myocardium: the Cardio133 trial. European heart journal. 35 (19), 1263-1274 (2014).
  54. Steinhoff, G., et al. Cardiac Function Improvement and Bone Marrow Response -: Outcome Analysis of the Randomized PERFECT Phase III Clinical Trial of Intramyocardial CD133(+) Application After Myocardial Infarction. EBioMedicine. 22, 208-224 (2017).
  55. Muller, P., et al. Intramyocardial fate and effect of iron nanoparticles co-injected with MACS(R) purified stem cell products. Biomaterials. 135, 74-84 (2017).
  56. Müller, P., Gaebel, R., Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Data on the fate of MACS® MicroBeads intramyocardially co-injected with stem cell products. Data in brief. 13, 569-574 (2017).
  57. Skorska, A., et al. GMP-conformant on-site manufacturing of a CD133+ stem cell product for cardiovascular regeneration. Stem cell research & therapy. 8 (1), 33 (2017).
  58. Delyagina, E., Li, W., Ma, N., Steinhoff, G. Magnetic targeting strategies in gene delivery. Nanomedicine (Lond). 6 (9), 1593-1604 (2011).
  59. Schade, A., et al. Innovative strategy for microRNA delivery in human mesenchymal stem cells via magnetic nanoparticles. International journal of molecular sciences. 14 (6), 10710-10726 (2013).
  60. Delyagina, E., et al. Improved transfection in human mesenchymal stem cells: Effective intracellular release of pDNA by magnetic polyplexes. Nanomedicine. 9 (7), London, England. 999-1017 (2014).
  61. Yin, H., Kanasty, R. L., Eltoukhy, A. A., Vegas, A. J., Dorkin, J. R., Anderson, D. G. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
  62. Chen, J., Guo, Z., Tian, H., Chen, X. Production and clinical development of nanoparticles for gene delivery. Molecular therapy. Methods & clinical development. 3, 16023 (2016).
  63. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6518-6548 (2016).
  64. Soenen, S. J., Rivera-Gil, P., Montenegro, J. -M., Parak, W. J., de Smedt, S. C., Braeckmans, K. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano today. 6 (5), 446-465 (2011).
  65. Estelrich, J., Sánchez-Martín, M. J., Busquets, M. A. Nanoparticles in magnetic resonance imaging: From simple to dual contrast agents. International journal of nanomedicine. 10, 1727-1741 (2015).

Tags

Bioteknik fråga 136 Stem cell CD133 genetisk modifiering icke-virala transfection mikroRNA magnetiska inriktning magnetiska nanopartiklar polyethylenimine
Protokoll för mikroRNA överföring till benmärgen-härrör hematopoetiska stamceller att aktivera Cell teknik kombinerat med magnetiska inriktning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hausburg, F., Müller, P.,… More

Hausburg, F., Müller, P., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting. J. Vis. Exp. (136), e57474, doi:10.3791/57474 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter