Hier beschreiben wir Methoden zum Ausführen von ChIP-Seq und CARIP-FF, einschließlich der Bibliothek Vorbereitung auf Next Generation Sequencing, global epigenomischen und Chromatin-assoziierter RNA zu generieren-Karten von ES-Zellen.
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Methodenartikel
CARIP-Seq und ChIP-Seq: Methoden zur Ermittlung von Chromatin-assoziierter RNA und Protein-DNA-Wechselwirkungen in embryonale Stammzellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Embryonale Stammzellen (ES) Zelle Selbsterneuerung und Differenzierung unterliegt extrinsische Signale und intrinsische Netzwerke von Transkriptionsfaktoren, epigenetische Regulatoren und Post-Übersetzung Modifikationen der Histone, die das Gen kombinatorisch beeinflussen Ausdruck Zustand des nahe gelegenen Gene. RNA hat sich auch gezeigt, zur Interaktion mit verschiedenen Proteinen, Chromatin Dynamik und Genexpression regulieren. Chromatin-assoziierter RNA Immunopräzipitation (CARIP) gefolgt von Next Generation Sequencing (CARIP-Seq) ist eine neuartige Methode zur RNA zugeordnete Chromatin Proteine, während Chromatin Immunopräzipitation gefolgt von Next Generation Sequencing (Umfrage ChIP-Seq) ist eine leistungsstarke Genomik-Technik, um den Lageplan des Post-translationale Modifikation der Histone, Transkriptionsfaktoren und epigenetische Modifikatoren auf einer globalen Skala in ES-Zellen. Hier beschreiben wir Methoden zum Ausführen von CARIP-Seq und ChIP-Seq, einschließlich Bibliotheksbau für Next-Generation Sequenzierung, um globale Chromatin-assoziierter RNA und epigenomischen Karten in Embryonaler Stammzellen zu erzeugen.
Einleitung
Kommunikation zwischen extrazelluläre Signale und eine Reihe von transkriptionelle-Aufsichtsbehörden, einschließlich der Histon-Modifikatoren und Post-Übersetzung Änderung der Histone Tails sind embryonale Stammzellen (ES) Zelle Schicksal Entscheidungen geregelt. Diese Interaktionen Erleichterung Chromatin Zugänglichkeit und Verpacken von Chromatin in einen von zwei Zuständen: Euchromatin, das offen und transcriptionally aktiv ist, und Heterochromatin, das kompakt und in der Regel transcriptionally inaktiv ist. Transkriptionsfaktoren mit DNA-Sequenz-spezifische verbindliche Affinitäten und epigenetische Modifikatoren Associate bei euchromatisch Regionen zur Teilnahme ....
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Protokoll
(1) Kultur der Maus ES Zellen im Feeder-freien Bedingungen.
Hinweis: Maus-ES-Zellen sind konventionell in Medien auf eine Zelle Kulturschale mit Gelatine und eine Mono-Schicht der Maus embryonalen Fibroblasten (MEF), die mitotically inaktiviert wurden beschichtet (iMEFs) kultiviert. Jedoch sollten MEFs vor dem nachgeschalteten epigenetische oder Ausdruck Analysen der Verunreinigung des MEF-assoziierten Chromatin und RNA entfernt werden.
- Vorbereitung eines Feeder-Layers: Gelatine Mantel ein 6-Well Zellplatte Kultur durch Zugabe von 2 mL 0,1 % Gelatine in Wasser, und die Platte bei 37 ° C für 20-30 min inkubieren.
- Bereiten....
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Ergebnisse
Wir verhört erfolgreich die genomweite Bindung von H3K4me3, H3K4me2 und KDM5B in ES-Zellen mit diesem ChIP-Seq-Protokoll-6. ES-Zellen wurden im Feeder-freien Bedingungen (Abbildung 1) und vernetzt wie oben beschrieben. Beschallung wurde anschließend wie in Schritt 3.2 des ChIP-Seq-Protokolls beschrieben durchgeführt und bewertet durch Ausführen von DNA auf einem 2 % Agarosegel (Abbildung 2). Als nächstes w.......
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Diskussion
ChIP-Seq ist eine nützliche Methode, die Lage des globalen Protein-DNA-Wechselwirkungen zu bewerten (zB., Transkription Faktoren/Histon-modifizierende Enzyme/Histon Änderungen und DNA) in ES-Zellen, während der neu entwickelte CARIP-Seq-Protokoll nützlich ist abfragenden genomweite RNAs mit Chromatin Bestandteile. ChIP-Seq ist ein grundlegendes Instrument, das verwendet wird, um epigenetische Landschaften von ES-Zellen und andere Zelltypen zu bewerten. Die Qualität der ChIP-Seq und CARIP-Seq-Bibliotheken ist wei.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von Wayne State University, Karmanos Cancer Institute, ein Stipendium des National Heart, Lung and Blood Institute (1K22HL126842-01A1) an B.L.K. vergeben unterstützt. Diese Arbeit genutzt, die Wayne State Universität High Performance Computing Grid für computational Ressourcen (< Https://www.grid.wayne.edu/>). Wir danken für die Unterstützung bei CARIP-Seq Datenanalyse Jiji Kurup.
AUTOREN-BEITRÄGE:
B.L.K. der CARIP-Seq-Methode konzipiert, entworfen und ChIP-Seq und CARIP-Seq Experimente durchgeführt die Sequenzierungsdaten analysiert und erarbeitet das Manuskript. Alle Autoren haben gelesen und ge....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Maus-Leukämie-Hemmfaktor (ESGRO LIF) | EMD Millipore | 106 oder 107 Einheiten | |
| GSK3&betaInhibitor CHIR99021 (GSK3i) | Stemgent | Lösungsmittel: DMSO 10mM | |
| MEK-Inhibitor PD0325901 (MEKi) | Stemgent | Lösungsmittel: DMSO 10mM | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), hoher Glukosegehalt | Invitrogen | 11965092 | |
| PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) | Invitrogen | 10010031 | |
| Trypsin-EDTA (0,25%), Phenolrot | Gibco | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | Gibco | 15140122 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350010 | |
| MEM-Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100x) | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax 0,1% Gelatinelösung | EMD Millipore | ES-006-B | |
| Glycin | Sigma | G7126-500G | 1,25 M Stamminhalt in Wasser |
| Formaldehydlösung | Sigma | F8775-500ML | |
| TE (Tris EDTA) pH 8,0 1X | Qualität Biologische | 351-011-131 | |
| Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) Lösung | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Natriumdodecylsulfatlösung (20%) | Qualität Biologisch | A611-0837-10 | |
| Q125 Sonifikator | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 Lösung | Sigma | 93443-100ML | |
| Natriumdesoxycholat | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Dynabeads Protein G zur Immunpräzipitation | Invitrogen | 10004D | |
| Dynabeads Protein A zur Immunpräzipitation | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A/Protein G und Magnet Starter Pack | Invitrogen | 10015D | |
| Lithiumchlorid | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA-Aufreinigungskit (für die mRNA-Aufreinigung aus Gesamt-RNA-Präparaten) | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript Doppelsträngige cDNA-Synthese Kit | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR-Aufreinigungskit | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA-Endreparaturset | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow-Fragment (3'→ 5' Exo-) | NEB | M0212L | |
| dATP (10 mM) | Invitrogen | DNA-Ligase | |
| NEB | M0202L | ||
| TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10488085 | |
| E-Gel EX Agarose-Gele, 2% | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion High-Fidelity 2X Mastermix mit HF-Puffer | Thermo Fisher | ||
| ChIPAb+ Trimethyl-Histon H3 (Lys4) - ChIP-validierter Antikörper | EMD Millipore | 17-614 | |
| Anti-Histon H3 (di Methyl K4) Antikörper [Y47] - ChIP Grade (ab32356) | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar Zellkulturplatten mit flachem Boden (6 Well) | Fisher | 720083 | |
| Falcon Standard-Gewebekulturschalen (10 cm) | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit Flurometer 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | |
| Anti-Histon H4 (Trimethyl K20) Antikörper - ChIP Grade (ab9053) | Abcam | ab9053 | |
| Labquake Rotator | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq Plattform | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
Referenzen
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells....
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Nachdrucke und Genehmigungen
