여기, 선물이 transgene 식 tebufenozide 치료에 의해 pEUI(+) 단일 유전자 스위치를 사용 하 여 변조에 대 한 프로토콜.
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방법 논문
Ecdysone 수용 체 기반 단일 유전자 스위치 견고성, 가역, 및 무시할 수 시키는 Transgene의 의도적인 표현에 대 한
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
Transgene 식의 정확한 제어 생물 학적 및 임상 연구에 바람직합니다. 그러나, 현재 고용된 유전자 스위치의 바이너리 기능을 단일 셀으로 두 치료 식 단위 전송 동시에 사용 하려면, 때문에 유전자 치료에 대 한 시스템의 실용적인 응용 프로그램 제한 됩니다. Transgene 식 시스템을 단순화 하기 위해 단일 벡터의 transgene 식 모듈의 완전 한 세트를 포함 하는 pEUI(+)로 지정 하는 유전자 스위치를 생성 했습니다. 새로 개발된 된 단일 유전자 스위치 높은 GAL4 DNA 바인딩 도메인의 구성 및 수정된 EcR (GvEcR), 최소 VP16 활성화 도메인 GAL4 DNA 바인딩 도메인 (EcR), 수정 된 초파리 ecdysone 수용 체와 융합 시간 복용량에 따라 방식으로 화학 유도의 관리에 응답. PEUI(+) 벡터는 transgene 식 생물 학적 연구와 전 임상 연구에서의 제어를 향상 시키기 위한 잠재적으로 강력한 도구입니다. 여기, 우리 tebufenozide (Teb)의 치료에 의해 pEUI(+) 벡터를 사용 하는 과도 하 고 안정적인 transgene 식의 변조에 대 한 상세한 프로토콜을 제시. 또한, 우리는 화학 유도로 Teb의 사용에 대 한 중요 한 지침을 공유합니다.
서론
여러 다른 유전자 스위치는 transgene 식 세포 배양 및 동물 모델, 성공1,2,3의 다양 한 각도 정확 하 게 조절 하는 능력에 대 한 탐험 되었습니다. 잠재적인 유전자 스위치 시스템 등 몇 가지 엄격한 기준을 충족 해야: transgene, inducers, 발기인의 무시할 수 시키는, 가역 transgene의 복용량 및 시간에 따른 응답의 정확한 방향 표현 유도 제거, 및 유도 독성 레벨 셀 라인을 실험실 동물1,2,3쾌활 통해 활성화. 항생물질4,5, rapamycin6,7,8, mifepristone9,
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프로토콜
1. Transgene Subcloning
- PEUI(+)의 MCS에 적절 한 제한 효소 인식 사이트 (또는 사이트)을 선택 하 고 원하는 방향으로 (그림 1) 관심사의 유전자를 subclone.
참고: EGFP 또는 플래그 피토 프 태그 ankyrin 반복 도메인 13A EcoRI 사이트에 시퀀스 및 결 찰-독립적인 방법19를 복제 T4 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 pEUI(+) 벡터의 transgene (ANKRD13A) subcloned 이었다. - 37 ° c.에서 1 h EcoRI와 pEUI(+) 선형화 믹스 50 ng / µ L의 PCR 증폭 EGFP 또는 ANKRD13A, µ 40 ng/L 함께 pEUI(+) 선형화 및 T4 DNA 중 합 효소 (1 U) 10 분에 대 한 얼음에 부 화 하기 전에 실내 온도 (RT)에 1 분 동안 추가 10 µ L의 100 µ L 직접 반응 혼합물의 반응 다음 변환에 대 한 DH10B 유능한 세포 실험.
참고: 몇 가지 제한 효소 인식 사이트 pEUI(+) (그림 1B)의 MCS에 추가 된....
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결과
GvEcR 기반 단일 유전자 스위치 그림 1A에서 묘사 된다. PEUI(+) 벡터 Teb와 치료에 의해 규제 transgene 식을 위해 최적화 되었다. PEUI(+) 이펙터 지역 한 10xUAS는 E1b MCS EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI, 및 AflII 제한 효소 인식 사이트를 포함 하 여 최소한의 발기인 따라 구성 되어 있습니다. SV40 많은 신호는 MCS (그림 1B) 뒤에 추가 되었습니다. PAC 유전자 puromycin 저항을 수 여 하는 pEUI(+)의 드라이버와 이펙터 지역 사이 삽입 되었다.
활동을 시키는 pEUI(+)의 평가, 하 우리는 MCS의 EcoRI 사이트에 EGFP 를 su.......
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토론
이진 진 식 스위치를 사용 하 여의 주요 단점은 동시에 대상 셀에 두 개의 별도 플라스 미드 (드라이버 및 이펙터)를 제공 하는 필요. 이 플라스 미드와 inducers,12,3스위치의 일관성이 응답에서 결과의 부동 한 배급을 이어질 수 있습니다. 두 벡터 시스템의 또 다른 단점은 항생제 선택의 2 라운드의 최소 유망한 셀 라인을 식별 하는 데 필요한 것입니다. 따라서, 하나의 단위를 구성 된 유전자를 유도할 수 있는 카세트 오래 생물학 연구에 사용 하기 위해 모색 되었습니다. PEUI(+) 단 수 transgene 식 스위치 transgene 자극에 필요한 모든 규제 장치를 갖춘 단일 벡터에 포함 됩니다. 따라서, pEUI(+), subcloned transgene의 유도 수준 과도 transfection 실험 및 화학 유도의 복용량에서 transfected D.......
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공개 사항
우리는이 보고서와 관련 된 충돌의 관심 있다.
감사의 글
저자는 소중한 의견 및 우리의 원고의 철저 한 독서에 대 한 S Y 최 (전남 대학교) 감사합니다. 이 작품은 충남 대학교의 연구 기금에 의해 지원 되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| pEUI(+) | TransLab | 특허 라이선스가 TransLab Inc.로 이전되었습니다. | |
| Gene-Fect 형질주입 시약 | TransLab | TLC-001 | |
| HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Tebufenozide | Fluka | 31652 | |
| 클로닝 실린더 | Sigma | CLS31668 | |
| Puromycin | Corning | 58-58-2 | |
| 항생제 | Gibco | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Welgene | LS015-01 | |
| DMEM | Welgene | LM001-05 | |
| 소 태아 혈청 | Welgene | S001-01 | |
| 세포 배양 접시 | SPL 생명 과학 | 11090 | |
| 마우스 FLAG M2 | Sigma | F3165 | |
| 안티 알파 튜불린 항체 | Calbiochem | CP06 | |
| 복제 실린더 | Sigma | CLS31668 | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410.1 | |
| M-PER 포유류 단백질 추출 시약 | Thermo Fisher | 78505 | |
| 100X 프로테아제 억제제 수탉. III | T& 나는 | BPI-9200 |
참고문헌
- Rossi, F. M., Blau, H. M. Recent advances in inducible gene expression systems. Curr. Opin. Biotechnol. 9 (5), 451-456 (1998).
- Clackson, T. Regulated gene expression systems. Gene Ther. 7 (2), 120-125 (2000).
- Suzuki, Y., Suzuki, Y. Gene regulatable lentiviral system.
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재인쇄 및 허가
