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Cancer Research

ली-Fraumeni सिंड्रोम रोगी-व्युत्पंन प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल का उपयोग ऑस्टियो मॉडलिंग

Published: June 13, 2018 doi: 10.3791/57664
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1, 4, 1, 1,2,5,6
1Department of Integrative Biology and Pharmacology, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston, 2Graduate School of Biomedical Sciences, The University of Texas MD Anderson Cancer Center UTHealth, 3Department of Musculoskeletal Oncology, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 4Women's Health Institute, Cleveland Clinic Foundation, 5Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, The Brown Foundation Institute of Molecular Medicine for the Prevention of Human Diseases, The University of Texas Health Science Center at Houston, 6Center for Precision Health, School of Biomedical Informatics and School of Public Health, The University of Texas Health Science Center at Houston

Summary

यहां, हम प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) से ली-Fraumeni सिंड्रोम (LFS) रोगी व्युत्पंन fibroblasts, iPSCs के माध्यम से mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) osteoblasts के भेदभाव, और vivo में मॉडलिंग की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद LFS रोगी-प्राप्त osteoblasts का उपयोग tumorigenesis.

Abstract

ली-Fraumeni सिंड्रोम (LFS) एक autosomal प्रमुख वंशानुगत कैंसर विकार है । LFS के साथ रोगियों ऑस्टियो--बचपन और किशोरावस्था में सबसे लगातार प्राथमिक गैर hematologic द्रोह में से एक सहित ट्यूमर के एक विभिन्न प्रकार के लिए संवेदनशील हैं । इसलिए, LFS इस द्रोह का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल प्रदान करता है । iPSC के तरीके का लाभ उठाते हुए, LFS-एसोसिएटेड ऑस्टियो सफलतापूर्वक iPSCs स्टेम सेल (mesenchymal) के लिए LFS रोगी MSCs अंतर द्वारा मॉडलिंग की जा सकती है, और फिर osteoblasts के लिए-osteosarcomas के लिए मूल की कोशिकाओं । ये LFS osteoblasts दोहराऊंगा के oncogenic गुण ऑस्टियो, delineating के रोगजनन के लिए एक आकर्षक मॉडल प्रणाली प्रदान करते हैं. इस पांडुलिपि LFS रोगी fibroblasts से iPSCs की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल को दर्शाता है, iPSCs के भेदभाव MSCs करने के लिए, MSCs को osteoblasts के भेदभाव, और vivo tumorigenesis में LFS osteoblasts का उपयोग कर । यह iPSC रोग मॉडल LFS-संबद्ध ऑस्टियो के लिए संभावित उपचिह्न या चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है ।

Introduction

२००६ और २००७ के बीच, डीआरएस की प्रयोगशालाओं से कई सफलता निष्कर्षों । Shinya यामानाका और जेंस ए थॉमसन प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs)1,2,3के विकास के लिए नेतृत्व किया । परिभाषित transcriptional कारकों के साथ दैहिक कोशिकाओं reprogramming द्वारा iPSCs फार्म के लिए, शोधकर्ताओं ने प्रमुख विशेषताओं अर्थात्, pluripotency, और आत्म नवीकरण, जो पहले ही मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं में मौजूद करने के लिए सोचा था के साथ कोशिकाओं को उत्पंन कर रहे थे (hESCs) । iPSCs किसी भी व्यक्ति या रोगी से उत्पंन किया जा सकता है और करने के लिए भ्रूण से प्राप्त होने की नहीं है, काफी अध्ययन के लिए उपलब्ध रोगों और पृष्ठभूमि की प्रदर्शनों की मांगें का विस्तार । तब से रोगी-व्युत्पन्न iPSCs विभिन्न मानव रोगों के phenotype को दोहराऊंगा करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, अल्जाइमर रोग से4 और पेशीशोषी पार्श्वस्केलेरोसिस 5 से लांग क्यूटी सिंड्रोम6,7, 8.

iPSC अनुसंधान में इन अग्रिमों ने भी कैंसर अनुसंधान के लिए नए रास्ते खोले हैं । कई समूहों ने हाल ही में एक अतिसंवेदनशील आनुवंशिक पृष्ठभूमि9,10,11के तहत रोगी iPSCs मॉडल कैंसर के विकास के लिए इस्तेमाल किया है, सफल आवेदन के साथ9ऑस्टियो में तारीख को प्रदर्शित, ल्यूकेमिया10,11,12, और कोलोरेक्टल कैंसर13. हालांकि iPSC-व्युत्पंन कैंसर मॉडल अपनी प्रारंभिक अवस्था में अब भी कर रहे हैं, वे phenocopying रोग में महान क्षमता-संबद्ध द्रोह, elucidating रोग तंत्र का प्रदर्शन किया है, और चिकित्सीय यौगिकों14की पहचान ।

ली-Fraumeni सिंड्रोम (LFS) एक autosomal प्रमुख वंशानुगत कैंसर TP53 germline उत्परिवर्तन15की वजह से विकार है । LFS के साथ रोगियों ऑस्टियो सहित द्रोह के एक विभिन्न प्रकार के लिए संवेदनशील हैं, LFS iPSCs बनाने और उनके व्युत्पंन कोशिकाओं को विशेष रूप से अच्छी तरह से इस द्रोह16का अध्ययन करने के लिए अनुकूल. एक iPSC आधारित ऑस्टियो मॉडल पहले २०१५ में स्थापित किया गया था LFS रोगी व्युत्पंन iPSCs9 बाद में mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) में विभेदित और फिर osteoblasts, ऑस्टियो की उत्पत्ति कोशिकाओं । ये LFS osteoblasts दोहराऊंगा ऑस्टियो-जुड़े osteogenic विभेदक दोषों और oncogenic गुण, एक डिश में एक "अस्थि ट्यूमर" मंच के रूप में मॉडल क्षमता का प्रदर्शन । दिलचस्प है, जीनोम चौड़ा transcriptome विश्लेषण LFS osteoblasts में एक ऑस्टियो जीन हस्ताक्षर के पहलुओं को उजागर और यह LFS जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल की विशेषताएं9ऑस्टियो में गरीब पूर्वानुमान के साथ संबंधित हैं, का संकेत नैदानिक प्रासंगिकता की विशेषताएं प्रकट करने के लिए LFS iPSCs रोग मॉडल की क्षमता ।

यह पांडुलिपि कैसे LFS रोगी-व्युत्पंन iPSCs मॉडल ऑस्टियो का उपयोग करने के लिए का एक विस्तृत वर्णन प्रदान करता है । यह LFS iPSCs की पीढ़ी, iPSCs के भेदभाव MSCs के लिए और फिर osteoblasts करने के लिए, और xenograft LFS का उपयोग कर vivo osteoblasts मॉडल में एक का उपयोग विवरण । LFS रोग मॉडल कई फायदे शामिल हैं, सबसे विशेष रूप से यंत्रवत अध्ययन, के लिए ऑस्टियो विकास के सभी चरणों में असीमित कोशिकाओं को उत्पन्न करने की क्षमता, अगोचर पहचान, और दवा स्क्रीनिंग9,14, 16.

संक्षेप में, LFS iPSC आधारित ऑस्टियो मॉडल ऑस्टियो अनुसंधान को आगे बढ़ाने के लिए एक आकर्षक पूरक प्रणाली प्रदान करता है । इस मंच भी रोगी व्युत्पंन iPSCs का उपयोग कर कैंसर मॉडलिंग के लिए एक सबूत की अवधारणा प्रदान करता है । इस रणनीति के नीचे वर्णित आसानी से मॉडल कैंसर की गड़बड़ी के साथ अंय आनुवंशिक विकारों के साथ जुड़े दुष्टों को बढ़ाया जा सकता है ।

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Protocol

यह काम टेक्सास विश्वविद्यालय के स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र ह्यूस्टन (UTHealth) पशु कल्याण समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था । प्रयोगों प्रयोगशाला पशु चिकित्सा और देखभाल (CLAMC) जो प्रयोगशाला पशु देखभाल (AAALAC इंटरनेशनल) के लिए अमेरिकन एसोसिएशन द्वारा मांयता प्राप्त है के लिए UTHealth केंद्र द्वारा स्थापित मानकों के साथ सख्त अनुसार प्रदर्शन कर रहे हैं । इस अध्ययन में मानव विषयों एक परिदृश्य के तहत गिर ("कोई मानव विषयों अनुसंधान") NIH SF424 प्रलेखन द्वारा परिभाषित के रूप में । इसलिए, यह UTHealth मानव अनुसंधान नैतिकता समिति द्वारा किसी भी अनुमोदन की जरूरत नहीं है ।

1. LFS iPSCs की जनरेशन (फिगर 1a)

  1. दिन-2 पर, प्लेट 2 x 104 LFS रोगी एक में अच्छी तरह से एक 6-अच्छी प्लेट के fibroblasts, और संस्कृति fibroblast मध्यम (तालिका 1) के साथ कोशिकाओं में ३७ ° c में एक humidified 5% CO2 मशीन । सुनिश्चित करें कि fibroblasts पहुंच ५०-६०% transduction के दिन पर संगम (0 दिन) ।
  2. 0 दिन पर सेंडाइ वायरस transduction निष्पादित करें । ऐसा करने के लिए, पूर्व-उष्ण fibroblast माध्यम से गुजारे हुए माध्यम को प्रतिस्थापित करें । पिघल वाणिज्यिक सेंडाइ वायरस reprogramming किट ( सामग्री की तालिकादेखें) बर्फ पर । निर्माता के निर्देशों के अनुसार मिश्रित सेंडाइ विषाणुओं से संक्रमित LFS fibroblasts ।
  3. fibroblast माध्यम में transduced कोशिकाओं का रखरखाव (दिवस 1-6):
    1. दिन 1, 24 ज transduction के बाद, fibroblast मध्यम शेष सेंडाइ वायरस से युक्त निकालें और इसे 2 मिलीलीटर ताजा fibroblast माध्यम से प्रतिस्थापित करें । संस्कृति एक humidified 5% CO2 मशीन में ३७ ° c पर transduced fibroblasts ।
    2. fibroblast माध्यम से हर दूसरे दिन 2-6 दिन से माध्यम बदल जाते हैं ।
  4. फीडर संस्कृति हालत में transduced कोशिकाओं का रखरखाव (दिवस 7-28):
    1. 6 दिन पर विकिरणित CF1 माउस भ्रूण fibroblast (MEF) संस्कृति व्यंजन तैयार करें । के लिए 30 min. महाप्राण के लिए कमरे के तापमान पर प्रत्येक प्लेट को ०.१% जिलेटिन की 5 मिलीलीटर कोटिंग के बाद ०.१% जिलेटिन जोड़कर इस कोट ६ १०० mm ऊतक संस्कृति व्यंजन है ।
    2. तरल नाइट्रोजन कंटेनर से MEFs निकालें । गल MEFs निर्माता के निर्देशों के बाद व्यावसायिक रूप से उपलब्ध गल प्रणाली का उपयोग कर । MEF/MSC संस्कृति मध्यम (तालिका 1) के साथ जिलेटिन पर लेपित प्लेटों प्लेट १०० mm ऊतक संस्कृति डिश प्रति ६.७ x 105 कोशिकाओं के एक बीज का घनत्व पर ।
    3. MEF प्लेट्स (Day 7) पर transduced कोशिकाओं को Inoculate: Trypsinize रूम के तापमान पर 2-4 मिनट के लिए ०.२५% transduced-Trypsin प्रति १०० mm डिश का इस्तेमाल करते हुए EDTA सेल । fibroblast मध्यम के 9 मिलीलीटर के साथ trypsin बेअसर । शंकु ट्यूबों के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण और ३७ डिग्री सेल्सियस पर २३० x g पर कोशिकाओं के लिए 4 min. थाली के लिए transduced fibroblasts पर तैयार छह MEF पकवान 6 दिन और डिश के प्रति fibroblast माध्यम के 8 मिलीलीटर में उंहें संस्कृति पर ।
      नोट: MEF प्लेट्स पर transduced सेल बोने से पहले MEFs का प्रवाह 20% के आसपास होता है ।
    4. दिन 8 पर, fibroblast मध्यम त्यागें और hESC मध्यम (तालिका 1) के साथ प्रतिस्थापित करें ।
    5. 9-28 दिनों से आईपीएस क्लोनों के उद्भव के लिए रुको (चित्रा 1सी) । हर दूसरे दिन गुजारे hESC मीडियम को बदलें और माइक्रोस्कोप के तहत आईपीएस क्लोनों के उभार पर नजर रखें । iPSCs क्लोन काफी बड़ी नग्न आंखों से मनाया और फिर फीडर में आईपीएस क्लोन-मुक्त संस्कृति की स्थिति का विस्तार करने के लिए आगे बढ़ने के लिए रुको ।
  5. फीडर में उभरे आईपीएस क्लोनों का विस्तार-मुक्त संस्कृति की हालत (दिन 29-79 ~ 99):
    1. मैट्रिक्स लेपित थाली तैयार करने के लिए, कोट एक ४८-अच्छी तरह से तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कोटिंग समाधान (तालिका 1) के प्रति अच्छी तरह से १२० µ एल के साथ थाली । सुनिश्चित करें कि तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कोटिंग समाधान अच्छी तरह से कवर और कोट संस्कृति पकवान सतह । 1 h. महाप्राण कोटिंग समाधान तुरंत उपयोग करने से पहले के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें और 2 µ एम रॉक अवरोधक Thiazovivin के साथ अच्छी तरह से प्रति hESC मध्यम के २५० µ एल जोड़ें ।
    2. 28 दिन, महाप्राण hESC मध्यम और धो आईपीएस क्लोन 1x DPBS के साथ । एक 1 मिलीलीटर पिपेट टिप और एक इलाज ४८ अच्छी तरह से प्लेट (step 1.4.1) के एक कुआं में हस्तांतरण के साथ दिखाई आईपीएस क्लोन उठाओ । ४८-अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से बीज एक कॉलोनी ।
    3. 4 मिनट के लिए २३० x g पर थाली केंद्रापसारक सेल लगाव की सुविधा । संस्कृति ३७ ° c में एक humidified 5% CO2 मशीन में आईपीएस क्लोन ।
    4. अगले दिन (29 दिन), खर्च hESC मध्यम निकालें और एक अच्छी तरह से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध iPSC माध्यम के २५० µ एल जोड़ें ।
    5. एक humidified 5% CO2 मशीन में ३७ ° c पर आईपीएस क्लोन बनाए रखें, और iPSC माध्यम हर दूसरे दिन बदल जाते हैं ।
    6. जब आईपीएस क्लोन ८५% संगम, संस्कृति क्षेत्र द्वारा एक 1:10 अनुपात में उपसंस्कृति कोशिकाओं तक पहुंचने । वाणिज्यिक passaging समाधान के ६० µ एल जोड़ें कोशिकाओं को अलग और 3 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
    7. एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पर अलग iPSCs के बीज आधा-लेपित 12 hESC मध्यम के 1 मिलीलीटर में अच्छी तरह से थाली 2 µ m रॉक अवरोधक Thiazovivin के साथ । संस्कृति एक 12 में आईपीएस क्लोन अच्छी तरह से और उपसंस्कृति iPSCs प्रति व्यावसायिक रूप से उपलब्ध iPSC मध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ एक 1:10 अनुपात में जब तक वे 10 बीतने तक पहुंचने ।
      नोट: iPSCs हर 5-7 दिन एक 1:10 अनुपात में संस्कृति उप रहे हैं । यह 10 सप्ताह तक के लिए ले जाता है आईपीएस क्लोन तक पहुंचने के लिए 7 गद्यांश । सेल आकृति विज्ञान, क्षारीय फॉस्फेट (एपी) गतिविधि, और pluripotency कारकों और hESC मार्करों की अभिव्यक्ति सहित iPSC characterizations, सेंडाइ में iPSCs वायरस को हटाने की पुष्टि के बाद जांच की जा सकती है (आमतौर पर लगभग 10 के बाद प्रदर्शन मार्ग) (आंकड़ा 1b-E) । एंटीबॉडी और प्राइमर iPSC लक्षण वर्णन के लिए जानकारी तालिका 2 और 4में शामिल हैं ।

2. LFS iPSCs का Mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) (चित्रा 2a) का विभेद

  1. संस्कृति iPSC क्लोनों के लिए MEF प्लेटों पर कम से 2 सप्ताह (दिन ~-14-0): MEF व्यंजन तैयार (१०० mm ऊतक संस्कृति व्यंजन) के रूप में पहले से वर्णित (1.3.1-1.3.2) । hESC मीडियम और चेंज मीडियम में हर दूसरे दिन iPSCs बनाए रखें । जब भी iPSCs ९०% संगम तक पहुंचता है, उपसंस्कृति iPSCs 1:10 कमजोर पड़ने से ।
  2. iPSCs (0 दिन) से MEFs का निष्कासन:
    1. 2 सप्ताह के लिए MEFs पर iPSCs बनाए रखने के बाद, १०० mm ऊतक संस्कृति व्यंजन में संस्कृति iPSCs तक कोशिकाओं तक पहुंचने ८०-९०% संगम । खर्च hESC मीडियम निकालें और 5 मिलीलीटर 1x DPBS के साथ iPSCs धो लें । सेल टुकड़ी समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें कोशिकाओं को अलग और 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
    2. थाली के लिए MEF/MSC संस्कृति मध्यम के 9 मिलीलीटर जोड़ें सेल टुकड़ी समाधान गतिविधि को बेअसर और किसी भी कोटिंग के बिना एक नया १०० mm ऊतक संस्कृति डिश के लिए अलग कोशिकाओं हस्तांतरण ।
    3. MEFs प्लेट के लिए संलग्न करने के लिए अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं की मशीन ।
    4. ध्यान से supernatant जो संलग्न iPSCs शामिल हैं, और 4 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर २३० x g पर केंद्रापसारक इकट्ठा ।
      नोट: लापरवाही प्लेट नीचे फ्लश MEFs की टुकड़ी की ओर जाता है ।
  3. MSCs की ओर iPSCs का विभेद (दिन 0-28):
    1. कोट 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अच्छी तरह से प्रति ०.१% जिलेटिन की 1 मिलीलीटर के साथ एक 6-अच्छी तरह से थाली के तीन कुओं ।
    2. एकत्र iPSCs के supernatant को 2.2.4 से हटा दें ।
    3. एमएससी विभेदक मध्यम (तालिका 1) और अच्छी तरह से (0 दिन) प्रति 2 मिलीलीटर के साथ तीन लेपित कुओं में बीज कोशिकाओं के 6 मिलीलीटर में iPSCs reसस्पेंड ।
    4. एमएससी विभेदक को हर दो दिन में बदलने के लिए और//या मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए (दिन 1-28) ।
  4. iPSC की परिपक्वता-व्युत्पंन MSCs (दिवस 28-45):
    1. खर्च एमएससी विभेदक मध्यम और धो कोशिकाओं 1x DPBS के 1 मिलीलीटर के साथ निकालें ।
    2. Trypsinize MSCs के ०.५ मिलीलीटर के साथ ०.२५% Trypsin-EDTA प्रति अच्छी तरह से कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए ।
    3. MEF/MSC संस्कृति के माध्यम से १.५ मिलीलीटर द्वारा trypsin बेअसर और तीन कुओं से १ १५ मिलीलीटर शंकु ट्यूब में MSCs इकट्ठा । 4 मिनट के लिए 4 ° c पर २३० x g पर केंद्रापसारक ।
    4. supernatant निकालें और १ ६० mm ०.१% जिलेटिन कोटेड प्लेट (28 दिन) पर MEF/MSC संस्कृति मध्यम और प्लेट के 3 मिलीलीटर में MSCs reसस्पेंड ।
    5. MEF/एमएससी कल्चरल मीडियम और चेंज मीडियम में कल्चर MSCs हर दो दिन में. जब कोशिकाएँ १००% संगम तक पहुँचती हैं, तो उपसंस्कृति MSCs ०.२५% Trypsin-EDTA का उपयोग करते हुए 1:3 अनुपात पर.
      नोट: MSCs एक fibroblast की तरह आकृति विज्ञान (चित्रा b) प्रदर्शित करते हैं । जब MSCs एक उच्च घनत्व में हो जाना, लंबी MSCs एक भंवर की तरह पैटर्न (चित्रा बी) फार्म कर सकते हैं ।
    6. MSC सरफेस मार्करों CD44, CD73, CD105, और CD166 (चित्रा 2c) की जांच करके iPSC-व्युत्पन्न MSCs का मूल्यांकन करने के लिए immunofluorescent धुंधला प्रदर्शन ।
      नोट: एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने 2 तालिकामें दिखाए जाते हैं । Immunofluorescent जीवित कोशिकाओं के धुंधला निर्माता के निर्देशों के अनुसार किया जाता है ।
    7. पुष्टि के बाद, विस्तार MSCs में 1:3 अनुपात में १०० मिमी ऊतक संस्कृति व्यंजन. नीचे शीशियों फ्रीज (१०० mm ऊतक संस्कृति पकवान प्रति 3 शीशियों) 10% DMSO और ९०% FBS युक्त ठंड मध्यम का उपयोग कर ।
      नोट: एमएससी जनसंख्या को समृद्ध करने के लिए, MSCs CD105 का उपयोग कर हल किया जा सकता+, CD24-मापदंड द्वारा प्रवाह cytometry9,17. iPSC-व्युत्पंन MSCs विभेदित PDGF-AB-आधारित विधि सामांयतः 2-3 के लिए संस्कृति में एमएससी9पहचान की हानि के बिना महीने के लिए बनाए रखा जा सकता है । एमएससी विशेषताओं की पुष्टि के बाद एक प्रारंभिक बीतने संख्या से MSCs फ्रीज ।

3. LFS MSCs का Osteoblasts (चित्रा 3ए) का विभेद

  1. osteogenic विभेद के लिए MSCs की तैयारी (Day-1)
    1. osteogenic भेदभाव प्रोटोकॉल को पूरा करने के लिए कोशिकाओं की एक पर्याप्त मात्रा सुनिश्चित करने के लिए, ९५% संगम करने के लिए १०० मिमी ऊतक संस्कृति व्यंजन में MSCs कल्चरल के साथ शुरू करते हैं । खर्च संस्कृति मध्यम निकालें और 1x DPBS के 5 मिलीलीटर के साथ MSCs धो लो ।
    2. Trypsinize MSCs 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ०.२५% trypsin-EDTA प्रति १०० mm डिश के 1 मिलीलीटर के साथ । कोशिकाओं trypsinized खत्म नहीं कर रहे हैं यह सुनिश्चित करने के लिए, trypsinization बंद करो जब सेल टुकड़ी के ५०% माइक्रोस्कोप के तहत मनाया जाता है ।
    3. MEF/MSC संस्कृति माध्यम के 9 मिलीलीटर द्वारा trypsin बेअसर और १ १५ मिलीलीटर शंकु ट्यूब में 3 कुओं से MSCs इकट्ठा । 4 मिनट के लिए 4 ° c पर २३० x g पर केंद्रापसारक ।
    4. supernatant को महाप्राण, एमएससी मीडियम के 5 एमएल में MSCs को रिसस्पेंड कर दीजिये, और किसी hemocytometer द्वारा कोशिकाओं की संख्या गिनने दीजिये.
    5. एक संस्कृति की थाली पर MSCs की थाली उचित संख्या ।
      नोट: 12-खैर प्लेट, 6 खैर प्लेट, और १०० मिमी ऊतक संस्कृति व्यंजन के सेल नंबर के विस्तार तालिका 3में संक्षेप हैं ।
  2. osteoblast विभेद माध्यम (ODM) (तालिका 1) (दिन 0-24) द्वारा osteogenic विभेदन की प्रेरण:
    1. महाप्राण MEF/MSC संस्कृति मध्यम और ODM की उचित मात्रा के साथ बदलें (1 मिलीलीटर, 2 मिलीलीटर, और 12 के प्रत्येक अच्छी तरह से थाली के लिए 8 मिलीलीटर, 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से, और १०० मिमी ऊतक संस्कृति पकवान, क्रमशः) osteoblasts (दिन 0) के लिए MSCs अंतर करने के लिए ।
    2. महाप्राण खर्च odm और osteogenic भेदभाव की प्रक्रिया के दौरान हर दो दिन odm की उचित मात्रा के साथ प्रतिस्थापित ।
    3. alkaline फॉस्फेट (एपी) और Alizarin रेड एस (ARS) के लिए अस्थि-संबद्ध alkaline फॉस्फेट द्वारा उत्पादित preosteoblasts और खनिज जमाव परिपक्व osteoblasts द्वारा उत्पादित, क्रमशः 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, और 24 पर का पता लगाने के दाग प्रदर्शन ( चित्र बी) ।
      नोट: एपी धुंधला और ARS धुंधला वाणिज्यिक उपलब्ध किट निंनलिखित निर्माता प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं ।
    4. preosteoblast और परिपक्व osteoblast मार्करों के अभिव्यक्ति स्तर की जांच (ALPL और preosteoblasts के लिए COL1A1; PTH1R और BGLAP के लिए परिपक्व osteoblasts) द्वारा qRT-पीसीआर (चित्रा 3सी) ।
      नोट: सकारात्मक एपी धुंधला osteogenic भेदभाव के दिन 9 के बाद की उंमीद है और सकारात्मक ARS धुंधला osteogenic भेदभाव के दिन 21 के बाद की उंमीद की जा सकती है । MEF में बढ़ रही MSCs/MSC संस्कृति माध्यम एपी धुंधला और ARS धुंधला के एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य किया जा सकता है ।

4. LFS MSC-व्युत्पन्न Osteoblasts (फिगर 4a) के Vivo Tumorigenesis में अध्ययन करने के लिए Xenograft मॉडल

  1. osteoblasts को LFS MSCs का विभेद:
    1. सीड 3-४.५ x 105 MSCs में १०० mm टिशू कल्चर डिश । एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन के लिए पांच व्यंजन तैयार करें ।
    2. संस्कृति ODM में MSCs 14 दिन तक ३.२ में वर्णित के रूप में osteoblasts करने के लिए MSCs अंतर करने के लिए ।
  2. चमड़े के नीचे इंजेक्शन के लिए विभेदित osteoblasts की तैयारी:
    1. osteoblast टुकड़ी समाधान (Table 1) तैयार करने के लिए, collagenase ii सॉल्यूशन (1 mg/एमएल) बनाने के लिए αMEM मीडियम के १,००० एमएल में 1 जी टाइप ii collagenase को भंग करें । -20 डिग्री सेल्सियस पर collagenase द्वितीय समाधान रखें । मिश्रण ०.२५% Trypsin-EDTA और एक 1:1 अनुपात में collagenase द्वितीय समाधान osteoblasts टुकड़ी समाधान करने के लिए ।
    2. खर्च ODM निकालें और १०० mm डिश प्रति 1x DPBS के 5 मिलीलीटर के साथ विभेदित osteoblasts धो लो ।
    3. १०० mm डिश प्रति osteoblast टुकड़ी समाधान के १.५ मिलीलीटर जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन व्यंजन की जांच करें और माइक्रोस्कोपी द्वारा osteoblast टुकड़ी सुनिश्चित करते हैं ।
    4. ODM द्वारा osteoblasts टुकड़ी समाधान बेअसर और एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में अलग osteoblasts इकट्ठा । 5 मिनट के लिए 4 ° c पर २३० x g पर केंद्रापसारक ।
    5. ODM मध्यम के 25 मिलीलीटर में supernatant और reसस्पेंड कोशिकाओं को हटा दें । एग्रीगेट कक्षों को निकालने के लिए ७० µm कक्ष छलनी के माध्यम से कक्षों को पास करें. किसी hemocytometer का उपयोग करके कक्ष संख्याओं की गणना करना.
    6. 1 x 107 osteoblasts प्रति चमड़े के नीचे इंजेक्शन तैयार है, और 4 मिनट के लिए २३० x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं केंद्रापसारक ।
    7. ५० µ एल आइस-कोल्ड 1x DPBS में 1 x 107 osteoblasts reसस्पेंड । मिश्रण phenol के ५० µ एल के साथ विभेदित osteoblasts-लाल मुक्त तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (osteoblasts निलंबन और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स एक 1:1 अनुपात में मिलाया गया) और इंजेक्शन से पहले बर्फ पर osteoblasts बनाए रखने ।
  3. LFS एमएससी-व्युत्पन्न osteoblasts के vivo xenograft ट्यूमर मॉडल में :
    1. Anesthetize 8-सप्ताह पुरानी महिला प्रतिरक्षा nu/एक चैंबर की आपूर्ति में 5% (वी/वी) श्वास isoflurane में 1 L/ऑक्सीजन के मिनट (CLAMC द्वारा प्रदान की) । पशु लेटा हुआ हो जाता है के बाद, नाक शंकु के लिए संवेदनाहारी वितरण प्रणाली स्विच, 2% की आपूर्ति (वी/वी) श्वास isoflurane में 200 मिलीलीटर/ऑक्सीजन की (CLAMC द्वारा प्रदान की) । corneal और पेडल सजगता चूहों पर्याप्त anesthetized कर रहे हैं और प्रक्रिया के दौरान असुविधा से पीड़ित नहीं हैं बनाने के लिए जाँच करके संज्ञाहरण की गहराई पर नजर रखें.
    2. क्षेत्र को संक्रमित chlorhexidine और ७०% isopropanol की बारी झाड़ू के साथ इंजेक्ट किया जा करने के लिए । का प्रयोग करें 26 जी सुई तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के उपचर्म इंजेक्शन-मिश्रित LFS osteoblasts 8 के हिंद पैरों के एक पक्ष में सप्ताह के पुराने प्रतिरक्षा nu/परमाणु चूहों (चित्रा 4a) ।
    3. चमड़े के नीचे गांठदार घनत्व के विकास के लिए इंजेक्शन साइटों पर साप्ताहिक टटोलने का कार्य करके चूहों की निगरानी । ट्यूमर गठन इंजेक्शन (चित्रा 4B) के बाद 6-10 सप्ताह के आसपास मनाया जा सकता है ।
    4. Euthanize कार्बन डाइऑक्साइड asphyxiation विधि द्वारा चूहों गर्भाशय ग्रीवा के बाद विस्थापन । काटना विकसित ट्यूमर । ट्यूमर ग्रेड और विभेदक सूचकांक, preosteoblasts, और कई दाग तरीकों (जैसे Hematoxylin और Eosin (एच एंड ई) धुंधला, Picro Sirius लाल दाग, और वॉन Kossa दाग क्रमशः) द्वारा परिपक्व osteoblasts निर्धारित करें ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल LFS iPSC जनरेशन, एमएससी विभेद, osteoblast भेदभाव सहित प्रक्रियाओं प्रस्तुत करता है, और vivo tumorigenesis LFS एमएससी-व्युत्पंन osteoblasts का उपयोग परख में ।

एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेंडाइ वायरस reprogramming किट का उपयोग करके fibroblasts से LFS iPSCs की पीढ़ी के लिए योजना चित्रा 1aमें दिखाया गया है । यामानाका चार कारकों में से सेंडाइ वायरस आधारित डिलीवरी एक गैर एकीकृत reprogramming विधि है । इसलिए, स्थिर LFS iPSC क्लोन सेंडाइ वायरस जीनोम और exogenous OCT4, SOX2, KLF4, और सी-MYC transgenes, जो आरटी-पीसीआर द्वारा विशिष्ट प्राइमरों (आंकड़ा 1b) का उपयोग कर की जांच की जा सकती है की हानि से मुक्त होना चाहिए । के रूप में यह निर्माता के निर्देश में सुझाव दिया है, सेंडाइ वायरस मुक्त iPSCs की पीढ़ी दोनों संस्कृति और मार्ग की स्थिति पर निर्भर करता है । इस प्रोटोकॉल में वर्णित संस्कृति शर्तों के तहत, iPSCs में सेंडाइ वायरस को हटाने आमतौर पर 10 मार्ग (आंकड़ा 1b) के बाद पता लगाया जा सकता है । स्थापित LFS iPSC क्लोन ठेठ hESC आकृति विज्ञान प्रदर्शन और सकारात्मक एपी गतिविधि दिखाने चाहिए (चित्रा 1C) । LFS iPSCs अत्यधिक एक्सप्रेस pluripotency फैक्टर mRNAs (NANOG, OCT4, SOX2, DPPA4, और REX1), hESC H1 रेखा से तुलनीय और बहुत पैतृक fibroblasts (चित्रा 1 डी) की तुलना में अधिक है । pluripotency कारकों की अभिव्यक्ति (NANOG, OCT4) और hESC मार्करों (SSEA4 और तर्-1-81) भी immunofluorescent धुंधला (चित्रा 1E) द्वारा जांच की जा सकती है ।

iPSCs को एमएससी विभेद (चित्रा 2a) की शुरुआत करने से पहले कम से 14 दिनों के लिए MEFs पर बनाए रखा जाता है । हालांकि कोशिका मृत्यु का एक बहुत एमएससी विभेद के दौरान होता है, विभेदित कोशिकाओं की जनता सेल संस्कृति प्लेट और fibroblast पर दिखाई दे रहे हैं-सेल जनता के किनारे पर MSCs की तरह 28 दिन में मनाया जा सकता है । (चित्रा बी) । MEF/एमएससी संस्कृति माध्यम में उप संवर्धन विभेदित कोशिकाओं के बाद, विभेदित MSCs पैदा करना जल्दी और fibroblast दिन ३५ के आसपास आकृति विज्ञान की तरह दिखाने के लिए, और फिर धीरे-धीरे एक लंबी आकार का प्रतिनिधित्व करते हैं और दिन में एक भंवर की तरह पैटर्न फार्म ४० (चित्रा बी ). विभेदित LFS MSCs एक्सप्रेस MSC मार्करों सहित CD44, CD73, CD105, और CD166 धुंधला (चित्रा 2c) द्वारा इम्यूनोफ्लोरेसेंस ।

चित्रा 3 ए रूपरेखा osteoblastic भेदभाव । जब MSCs osteogenic भेदभाव संकेतों के अधीन हैं, विभेदित कोशिकाओं को 9 दिन में सकारात्मक alkaline फॉस्फेट गतिविधि दिखाने के लिए शुरू (चित्र 3बी) । ARS धुंधला परिपक्व osteoblasts द्वारा उत्पादित खनिज जमाव का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । चमकीले लाल रंग भूरे रंग के दाग के बजाय धुंधला ARS धुंधला के सकारात्मक परिणाम इंगित करता है, जो 21 दिन के बाद मनाया जा सकता है (चित्र बी1) । अंतर osteoblasts preosteoblast जीन (ALPL और COL1A1) और परिपक्व osteoblast जीन की अभिव्यक्ति के स्तर में वृद्धि दिखाने BGLAP भेदभाव के दौरान PTH1R (और osteogenic) ।

vivo में xenograft मॉडल द्वारा स्थापित किया जा सकता है LFS MSC-व्युत्पंन osteoblasts में nu/परमाणु चूहों (चित्र 4a) । ट्यूमर 6-10 सप्ताह उपचर्म इंजेक्शन (चित्रा 4B) के बाद मनाया जा सकता है । LFS osteoblast-व्युत्पंन ट्यूमर अपरिपक्व osteoblast विशेषताओं का प्रदर्शन किया, सकारात्मक एपी गतिविधि (एपी धुंधला), सकारात्मक कोलेजन मैट्रिक्स जमाव (picrosirius लाल दाग) लेकिन नकारात्मक mineralization (वॉन Kossa धुंधला) (आंकड़ा 4c) .

Figure 1
चित्रा 1 : LFS रोगी fibroblasts से iPSC पीढ़ी । (क) iPSC पीढ़ी के योजनाबद्ध आरेख. (ख) सेंडाइ वायरस जीनोम और transgenes (कोस (KLF4, OCT4, and SOX2), KLF4, और सी-MYC) का आरटी-पीसीआर डिटेक्शन 10 अंश (बाएं) और iPSC पद संक्रमण दिवस 11 के बाद re क्लोन (दाएं, सकारात्मक नियंत्रण) । LFS iPSC क्लोन 10 मार्ग के बाद सेंडाइ वायरस मुक्त है । GAPDH आंतरिक नियंत्रण के रूप में दिखाया गया है । (ग) LFS iPSCs और एपी धुंधला की कोशिका आकृति विज्ञान । स्केल बार, ५० µm (D) qRT-पीसीआर ऑफ NANOG, SOX2, OCT4, DPPA4, और REX1 mRNA एक्सप्रेशन इन LFS iPSCs । hESC H1 रेखा और माता पिता का LFS fibroblasts एक सकारात्मक और एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है, क्रमशः । mRNA अभिव्यक्ति GAPDH अभिव्यक्ति के लिए सामान्यीकृत है । सापेक्ष mRNA अभिव्यक्ति 1 के रूप में hESC H1 लाइन के लिए समायोजित किया है । (ङ) OCT4 hESC में hESC pluripotent प्रतिलेखन कारकों (NANOG और SSEA4) और LFS सतह मार्करों (iPSCs और तर्-1-81) का Immunostaining. स्केल बार, ५० µm । इस अध्ययन में प्रयुक्त एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने को तालिका 2में दिखाया गया है । प्राइमरी सीक्वेंस 4 टेबलमें दिखाए गए हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : LFS iPSCs का विभेद MSCs । (क) PDGF-AB-प्रेरित एमएससी विभेद की योजनाबद्ध आरेख । (ख) LFS iPSC की कोशिका आकृति विज्ञान-MSCs दिन में 28, दिन ३६, और 40 दिन + । स्केल बार, १०० µm. (ग) इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला दर्शाता है कि विभेदित LFS MSCs प्रदर्शन CD44+, CD73+, CD105+, CD166+, और CD24- हस्ताक्षर । स्केल बार, 30 µm । इस अध्ययन में प्रयुक्त एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने को तालिका 2में दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : LFS MSCs का विभेद osteoblasts । (क) osteogenic विभेद का योजनाबद्ध आरेख. (ख) एपी और ARS धुंधला अलग समय अंक (दिन 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, और 24) पर प्रदर्शन कर रहे हैं । LFS एमएससी के Osteoblastic भेदभाव व्युत्पंन osteoblasts के लिए सकारात्मक 9 दिन के आसपास धुंधला और सकारात्मक ARS 21 दिन में धुंधला के नेतृत्व की उंमीद है । (ग) qRT-पीसीआर विश्लेषण osteoblast विभेद के दौरान पूर्व-osteoblast (ALPL और COL1A1) और परिपक्व PTH1R (BGLAP और osteogenic) जीनों की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति को प्रदर्शित करता है. mRNA अभिव्यक्ति GAPDH अभिव्यक्ति के लिए सामान्यीकृत है । अभिव्यक्ति का स्तर अंतर 0 दिन में कोशिकाओं के सापेक्ष थे । प्राइमरी सीक्वेंस 4 टेबलमें दिखाए गए हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : वीवो में LFS एमएससी के tumorigenesis-व्युत्पन्न osteoblasts. (क) LFS osteoblasts के ट्यूमर xenograft की योजनाबद्ध आरेख. (ख) nu/परमाणु चूहों भालू LFS osteoblast-व्युत्पंन ट्यूमर के बाद 10 चमड़े के नीचे इंजेक्शन के सप्ताह । (ग) LFS osteoblast-व्युत्पन्न ट्यूमर एच एंड ई, एपी, picrosirius लाल, और वॉन Kossa आकृति विज्ञान, हड्डी से जुड़े एपी, कोलेजन, और खनिज जमा, क्रमशः के लिए दाग की जांच की गई । LFS-व्युत्पन्न ट्यूमर सकारात्मक एपी गतिविधि, सकारात्मक कोलेजन, और नकारात्मक खनिज mineralization दिखा अपरिपक्व osteoblast विशेषताओं का प्रतिनिधित्व करते हैं । स्केल बार, 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Fibroblast मीडियम (५०० mL)
DMEM ४४० एमएल
गर्मी-निष्क्रिय FBS ५० एमएल
एंटीबायोटिक्स (Pen/Strep) (100x) 5 मिलीलीटर
अनावश्यक अमीनो अम्ल (100x) 5 मिलीलीटर
2-Mercaptoethanol ३.५ µ l
MEF/एमएससी कल्चरल मीडियम (५०० mL)
DMEM ४४० एमएल
गर्मी-निष्क्रिय FBS ५० एमएल
एंटीबायोटिक्स (Pen/Strep) (100x) 5 मिलीलीटर
L-Glutamine (100x) 5 मिलीलीटर
hESC मीडियम (५०० mL)
DMEM एफ-12 ३८४.५ एमएल
पीटा सीरम प्रतिस्थापन १०० मिलीलीटर (कुल: 20%)
अनावश्यक अमीनो अम्ल (100x) 5 मिलीलीटर
एंटीबायोटिक्स (Pen/Strep) (100x) 5 मिलीलीटर
L-Glutamine (100x) 5 मिलीलीटर
bFGF (10 µ g/mL) ५०० µ l
2-Mercaptoethanol ३.५ µ l
एमएससी विभेदक मध्यम (५०० मिलीलीटर)
नॉकआउट DMEM एफ-12 या DMEM/ ४४५ एमएल
पीटा सीरम प्रतिस्थापन ५० एमएल
bFGF (10 µ g/mL) ५०० µ l (10 एनजी/
PDGF-AB (25 µ g/एमएल) २०० µ l (10 एनजी/
अनावश्यक अमीनो अम्ल (100x) 5 मिलीलीटर
2-Mercaptoethanol ३.५ µ l
Osteoblast विभेद मध्यम (ODM) (५०० mL)
αMEM ३९५ एमएल
गर्मी-निष्क्रिय FBS ५० एमएल
10 मिमी β-Glycerophosphate ५० मिलीलीटर (१.०८ ग्राम में ५० मिलीलीटर αMEM)
०.१ µ m डेक्समेतएसॉनी (हल्का संवेदनशील) 10 µ l के 5 एमएम डेक्समेतएसॉनी
२०० µ एम Ascorbic एसिड की (हल्की संवेदनशील) 1 मिमी ascorbic एसिड की १०० µ एल
एंटीबायोटिक्स (Pen/Strep) (100x) 5 मिलीलीटर
Matrigel कोटिंग समाधान (५० mL)
तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स 2 मिलीलीटर
DMEM/एफ 12 (पूर्व ठंड 4 डिग्री सेल्सियस) ४८ एमएल
Osteoblast टुकड़ी समाधान (५० mL)
०.२५% Trypsin-EDTA 25 मिलीलीटर
Collagenase द्वितीय समाधान (1 मिलीग्राम/ 25 मिलीलीटर
नोट: उपयोग करने से पहले osteoblast टुकड़ी समाधान ताजा सही तैयार करें । Collagenase द्वितीय समाधान 6 महीने के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है ।

तालिका 1: fibroblast माध्यम की रचनाएं, MEF/msc संस्कृति मध्यम, hESC माध्यम, एमएससी विभेदन मध्यम, ODM, और osteoblast टुकड़ी समाधान ।

एंटीबॉडी नाम पतलापन
NANOG 1:500
OCT4 1:300
SSEA-4 PE-संयुग्मित 1:600
त्रिकोणीय-1-81 1:600
गधा विरोधी बकरी आईजीजी 1:500
बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी 1:500
CD105 1:500
CD44 1:500
CD73 1:500
CD166 1:500
CD24 1:500

तालिका 2: एंटीबॉडी कमजोर पड़ने ।

संस्कृति प्लेट सीडिंग घनत्व परख
12-खैर प्लेट 0.67 x104 कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से क्षारीय फॉस्फेट धुंधला (एपी धुंधला)
Alizarin रेड एस सना (ARS धुंधला)
6-वेल प्लेट 2x104 कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से RT-पीसीआर डिटेक्शन
Preosteoblast मार्करों: ALPL, COL1A1
परिपक्व osteoblast मार्करों: PTH1R, BGLAP
१०० mm डिश 3-4.5 x105 कोशिकाओं प्रति प्लेट vivo tumorigenesis में

तालिका 3: osteoblastic विभेदन के लिए MSCs का घनत्व सीडिंग करना.

सेंडाइ वायरस प्राइमर
लक्ष्य प्राइमर सेट
Sev फॉरवर्ड: GGATCACTAGGTGATATCGAGC
रिवर्स: ACCAGACAAGAGTTTAAGAGATATGTATC
कोस (KLF4/OCT4/SOX2) फॉरवर्ड: ATGCACCGCTACGACGTGAGCGC
रिवर्स: ACCTTGACAATCCTGATGTGG
KLF4 फॉरवर्ड: TTCCTGCATGCCAGAGGAGCCC
रिवर्स: AATGTATCGAAGGTGCTCAA
सी-MYC फॉरवर्ड: TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG
रिवर्स: TCCACATACAGTCCTGGATGATGATG
RT-पीसीआर प्राइमर्स
लक्ष्य प्राइमर सेट
NANOG फॉरवर्ड: TTTGTGGGCCTGAAGAAAACT
रिवर्स: AGGGCTGTCCTGAATAAGCAG
SOX2 फॉरवर्ड: AGAAGAGGAGAGAGAAAGAAAGGGAGAGA
रिवर्स: GAGAGAGGCAAACTGGAATCAGGATCAAA
OCT4 फॉरवर्ड: AACCTGGAGTTTGTGCCAGGGTTT
रिवर्स: TGAACTTCACCTTCCCTCCAACCA
DPPA4 फॉरवर्ड: GACCTCCACAGAGAAGTCGAG
रिवर्स: TGCCTTTTTCTTAGGGCAGAG
REX1 फॉरवर्ड: GCCTTATGTGATGGCTATGTGT
रिवर्स: ACCCCTTATGACGCATTCTATGT
ALPL फॉरवर्ड: GGGACTGGTACTCAGACAACG
रिवर्स: GTAGGCGATGTCCTTACAGCC
COL1A1 फॉरवर्ड: GTGCGATGACGTGATCTGTGA
रिवर्स: CGGTGGTTTCTTGGTCGGT
PTH1R फॉरवर्ड: AGTGCGAAAAACGGCTCAAG
रिवर्स: GATGCCTTATCTTTCCTGGGC
BGLAP फॉरवर्ड: GGCGCTACCTGTATCAATGG
रिवर्स: GGCGCTACCTGTATCAATGG

तालिका 4: प्राइमर जानकारी ।

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Discussion

उच्च एमएससी विभेदक दक्षता प्राप्त करने के लिए, कई पहलुओं महत्वपूर्ण हैं । एक एमएससी विभेद शुरू करने से पहले iPSCs की संस्कृति की स्थिति है । पांडुलिपि में प्रस्तुत प्रोटोकॉल पिछली पढ़ाई 9,17पर आधारित है । iPSCs के लिए MEFs पर कल्चरल होने की जरूरत है कम से 2 सप्ताह. MEFs पर अच्छी स्थिति में iPSCs बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है कोशिकाओं को जिलेटिन पर संलग्न करने के लिए एमएससी विभेद के लिए लेपित प्लेट । एक अंय महत्वपूर्ण पहलू भेदभाव से पहले MEFs पर iPSCs का घनत्व है । ८०-९०% iPSCs के प्रवाह को एमएससी विभेद शुरू पसंद है । iPSCs के अधिक वृद्धि अंतर प्रक्रिया के दौरान सेल अस्तित्व ख़राब होगा । पिछले महत्वपूर्ण बिंदु बोने की सघनता जब एमएससी भेदभाव शुरू है । हमारे हाथ में, उच्च कोशिका घनत्व जिलेटिन लेपित थाली के लिए iPSC लगाव को बढ़ावा देता है । १ १०० mm डिश iPSCs 6-वेल प्लेट के तीन कुओं में सीड की जा सकती है । सीधे reसस्पैंड और एमएससी विभेदक मध्यम में iPSCs चढ़ाना द्वारा एमएससी विभेद की दीक्षा iPSCs पर महान तनाव पैदा करता है, इसलिए कभी कभार गंभीर कोशिका मृत्यु में जिसके परिणामस्वरूप बोने के बाद । iPSCs का उच्च घनत्व एमएससी विभेद की सफलता दर बढ़ जाती है ।

एमएससी भेदभाव के विपरीत, osteoblastic भेदभाव की प्रक्रिया और अधिक सरल है । reproducible विभेदक परिणाम प्राप्त करने के लिए, सुनिश्चित करने के एमएससी संख्या अनुरूप हैं । एक ही सेल लाइन से osteoblastic भेदभाव के परिणाम बैच के जत्थे से भिंन हो सकते हैं, इसलिए, एक ही समय में अलग लाइनों के लिए भेदभाव की स्थापना समूहों के बीच और अधिक तुलनात्मक परिणाम दे देंगे । एमएससी संख्या की वृद्धि अंतर सकारात्मक एपी और एक पहले समय बिंदु पर धुंधला ARS द्वारा संकेत की प्रक्रिया को छोटा । इसके अलावा, ODM मध्यम के परिवर्तन को एक सौंय तरीके से नियंत्रित किया जाता है सुनिश्चित करने और शक्तिशाली वैक्यूम सक्शन प्रणाली संस्कृति की प्रक्रिया के दौरान समग्र osteoblasts की क्षमता की टुकड़ी के कारण देर से भिंनता चरण (दिन 18-24) में अनुशंसित नहीं है ।

vivo xenograft प्रयोग में के लिए इस्तेमाल किया विभेदित osteoblasts दिन में 14 भेदभाव समय बिंदु पर osteoblasts हैं । osteoblasts बाद 14 दिन से बाद में कुल हो सकता है और कोलेजन और अंय अस्थि मैट्रिक्स osteoblasts द्वारा उत्पादित सामग्री की भारी संचय के कारण अलग कर देना के लिए मुश्किल हो । osteoblast पृथक्करण की कठिनाई को रोकने के लिए, LFS MSCs osteoblastic भेदभाव की सुविधा के लिए osteoblast भेदभाव के दीक्षा कदम में 2-3 गुना उच्च घनत्व में वरीयता प्राप्त किया जा सकता है । LFS MSC-व्युत्पंन osteoblasts असंबद्ध और दिन 6-10 में vivo tumorigenesis परख में दिन 6-7 भेदभाव समय बिंदु पर भेदभाव समय बिंदु पर एकत्र किया जा सकता है । LFS xenograft ट्यूमर मॉडल दोहराऊंगा-एसोसिएटेड tumorigenic का अध्ययन करने के लिए एक वैकल्पिक मंच प्रदान करता है जो vivo LFS क्षमता में LFS एमएससी-व्युत्पन्न osteoblasts ऑस्टियो को दर्शाता है ।

संक्षेप में, एक LFS iPSC आधारित ऑस्टियो मॉडल ऑस्टियो अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान सहारा प्रदान करता है । ऑस्टियो के अलावा, LFS रोगियों जैसे कोमल ऊतक सार्कोमा, स्तन कैंसर, और ब्रेन ट्यूमर के रूप में विभिन्न अन्य प्रकार के कैंसर से पीड़ित हैं । इसलिए, LFS iPSC आधारित रोग मॉडल मॉडल अंय LFS संबंधित द्रोह के लिए बढ़ाया जा सकता है । LFS रोगी-व्युत्पंन iPSCs और इंजीनियर उत्परिवर्ती p53 (mutp53) hESCs18के संयोजन, LFS रोग मॉडल भी delineating संबद्ध के रोगजनन mutp53 में महान मूल्य है और उपंयास चिकित्सीय लक्ष्यीकरण रणनीतियों का विकास oncogenic p5316.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

आर. जेड. कैंसर की रोकथाम के लिए UTHealth नवाचार द्वारा समर्थित है अनुसंधान प्रशिक्षण कार्यक्रम पूर्व डॉक्टरेट फैलोशिप (कैंसर की रोकथाम और अनुसंधान टेक्सास अनुदान RP160015 संस्थान) । J.T. सूर्य यत्-सेन विश्वविद्यालय के पहले संबद्ध अस्पताल के Ke लिन कार्यक्रम द्वारा समर्थित है । डी.-F.L. कैंसर अनुसंधान में CPRIT विद्वान है और NIH मार्ग द्वारा स्वतंत्रता पुरस्कार R00 CA181496 और CPRIT पुरस्कार RR160019 द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic ware
100 mm Dish Corning 430107
60 mm Dish Corning 430166
6-well Plate Falcon 353046
12-well Plate Falcon 353043
48-well Plate Falcon 353078
1 mL Pipet Tip USA Scientific 1111-2721
200 µL Pipet Tip USA Scientific 1111-0706
10 µL Pipet Tip USA Scientific 1111-3700
5 mL Serological Pipette SARSTEDT 86.1253.001
10 mL Serological Pipette SARSTEDT 86.1254.001
25 mL Serological Pipette SARSTEDT 86.1685.001
50 mL Tube, PP SARSTEDT 62.547.100
15 mL Tube, PP SARSTEDT 62.554.100
Culture materials and Reagents
CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Invitrogen A16517 Commercial Sendai virus reprogramming kit
Corning hESC-Qualified Matrix Corning 354277 Basement membrane matrix
CF1 MEFs, irradiated ThermoFisher A34180
DMEM Sigma-Aldrich D5671
DMEM/F12 Corning 10-090-CV
αMEM Corning 10-022-CV
StemMACS iPS-Brew XF Miltenyi Biotec 130-104-368 Commercial iPSC medium
KnockOut DMEM/F-12 ThermoFisher 12660012
FBS Opti-Gold GenDEPOT F0900-050
KnockOut Serum Replacement ThermoFisher A3181502
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
MEM Nonessential Amino Acids Corning 25-025-CI
L-Glutamine Solution Sigma-Aldrich G7513
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Human FGF-basic (bFGF) PEPROTECH 100-18B
Recombinant Human PDGF-AB PEPROTECH 100-00AB
β-Glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422
Dexamethasone Sigma-Aldrich A4902
Ascorbic Acid Sigma-Aldrich A5960
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) Corning 21-031-CV
StemMACS Passaging Solution XF Miltenyi Biotec 130-104-688 Commercial passaging solution
Accutatse Cell Detachment Solution Corning 25-058-CI Cell detachment solution
Thiazovivin (ROCK Inhibitor) Calbiochem 420220
0.25% Trypsin-EDTA Solution Sigma-Aldrich T4049
Collagenase, Type II   ThermoFisher 17101015
Human NANOG Antibody R&D System AF1997
OCT4 Antibody (H-134) Santa Cruz sc-9081
Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody R&D System FAB1435P
Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen DB Biosciences 560123
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 705-545-003
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 111-545-144
PE Mouse Anti-Human CD105 eBioscience 12-1057-42
FITC Mouse Anti-Human CD44 DB Biosciences 555478
PE Mouse Anti-Human CD73 DB Biosciences 550257
PE Mouse Anti-Human CD166 DB Biosciences 560903
FITC Mouse Anti-Human CD24 DB Biosciences 555427
Donkey Serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Goat Serum Jackson ImmunoResearch 005-000-121
Alkaline Phosphatase Staining Kit II Stemgent 00-0055
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
TRIzol Reagent ThermoFisher 15596018
Chloroform ThermoFisher C298-500
2-Propanol ThermoFisher A416-4
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade ThermoFisher BP28184
DNase I, RNase-free (1 U/µL) ThermoFisher EN0521
iScript cDNA Synthesis Kit BioRad 1708891BUN
iQ SYBR Green Supermix BioRad 1708884
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free Corning 354262
1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch DB Biosciences 309597

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक १३६ iPSCs ली-Fraumeni सिंड्रोम reprogramming भेदभाव mesenchymal स्टेम सेल osteoblasts ऑस्टियो xenograft
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Zhou, R., Xu, A., Tu, J., Liu, M., Gingold, J. A., Zhao, R., Lee, D. F. Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (136), e57664, doi:10.3791/57664 (2018).

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