여기, 우리 제시 프로토콜 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)의 세대에 대 한 Li Fraumeni 증후군 (LFS) 환자 파생된 섬유 아 세포, 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)를 통해 Ipsc의 차별화에서에서 osteoblasts, 및 모델링 비보 tumorigenesis LFS 환자 파생 osteoblasts를 사용 하 여입니다.
Li Fraumeni 증후군 (LFS)는 상 염색체 지배적인 유전 암 질환 이다. LFS 환자는 종양, 다리-유년기와 청소년 기에 가장 빈번한 기본 비 혈액 악성 종양 중 하나를 포함 하 여 다양 한 유형의 predisposed 이다. 따라서, LFS이이 악성을 공부 하는 이상적인 모델을 제공 합니다. IPSC 방법론의 활용 LFS 연결 다리 LFS 환자 Ipsc 중간 엽 줄기 세포 (MSCs), 그리고 osteoblasts-osteosarcomas에 대 한 원래 셀을 차별화 하 여 성공적으로 모델링할 수 있다. 이러한 LFS osteoblasts 다리, 다리의 병 인을 묘사 하는 매력적인 모델 시스템 제공의 종양 속성 정리. 이 원고는 LFS 환자 fibroblasts, MSCs osteoblasts을 vivo에서 tumorigenesis LFS osteoblasts를 사용 하 여 MSCs의 차별화를 Ipsc의 차별화에서에서 Ipsc의 세대에 대 한 프로토콜을 보여 줍니다. 잠재적인 생체 또는 LFS 연결 다리에 대 한 치료 목표를 식별 하이 iPSC 질병 모델을 확장할 수 있습니다.
2006 년과 2007 년 사이 여러 획기적인 결과 박사 신 야 야 마나카와 제임스 A. 톰슨의 실험실에서 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)1,2,3의 개발을 주도. 양식 Ipsc에 정의 된 transcriptional 요인과 체세포 프로그래밍, 연구팀은 즉 주요 특성을 가진 세포를 생성할 수 있었다, pluripotency, 및 자기 갱신, 이전에 생각 되었다 인간 배아 줄기 세포에 존재 (hESCs)입니다. Ipsc 어떤 개인 이나 환자에서 생성 될 수 있는 고 배아, 광대 하 게 사용 가능한 질병 및 배경 연구에 대 한 레 퍼 토리를 확장에서 파생 될 필요가 없습니다. 이후로, 환자 파생 Ipsc Alzheimer의 질병4 와 루 경화 증5 긴 QT 증후군6,7, 에서 다양 한 인간 질병의 표현 형을 정리 하는 데 사용 되었습니다. 8.
IPSC 연구이 진보는 또한 암 연구를 위한 새로운 길을 열었습니다. 여러 그룹 최근 사용 환자 Ipsc는 취약 유전 배경9,,1011, 모델 암 개발에 다리9, 날짜에 성공적인 응용 프로그램 백혈병10,,1112, 그리고 대 장 암13. IPSC 파생 암 모델 그들의 초기에서 여전히 있지만, 그들은 phenocopying 질병 관련 된 악성 종양, 병 적인 메커니즘 elucidating 고 치료 화합물14를 식별에 큰 잠재력을 증명 하고있다.
Li Fraumeni 증후군 (LFS) TP53 생식 돌연변이15에 의해 발생 하는 상 염색체 지배적인 유전 암 질환 이다. LFS 환자는 악성 다리를 포함 하 여 다양 한 유형의 predisposed 이다 만들고 LFS Ipsc 그들의 파생된 셀이 종은16공부에 특히 적합. 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)로 분화 이후 LFS 환자 파생 Ipsc9 를 사용 하 여 및 다음 osteoblasts, 원본 세포는 iPSC 기반 다리 모델 처음 2015 년에 설립 되었다 다리의. 이러한 LFS osteoblasts osteogenic 차별화 다리 관련 결함 및 종양 속성, “접시에 뼈 종양” 플랫폼으로 서 잠재적인 모델을 보여주는 정리. 흥미롭게도, 게놈 전체 transcriptome 분석 공개 LFS osteoblasts에 다리 유전자 서명의 측면 그리고 다리9, 빈약한 예 지와이 LFS 유전자 표현 프로필의 기능 상관 나타내는 임상 관련성의 기능을 LFS Ipsc 질병 모델의 가능성이 있습니다.
이 원고는 LFS 환자 파생 Ipsc 모델 다리를 사용 하는 방법에 대 한 자세한 설명을 제공 합니다. 그것은 LFS Ipsc, Ipsc MSCs 그리고 osteoblasts, 하의 그리고 vivo에서 이 종이 식 사용 하는 모델 LFS osteoblasts의 사용의 세대를 자세히 설명 합니다. LFS 질병 모델은 몇 가지 이점이, 특히 기계 연구, 바이오 마커 식별 및 약9,14, 심사에 대 한 다리 개발의 모든 단계에서 무제한 세포를 생성 하는 기능 16.
요약 하자면, LFS iPSC 기반 다리 모델 다리 연구 진행을 위한 매력적인 보완 시스템을 제공 합니다. 이 플랫폼은 또한 암 모델링 Ipsc 환자 파생을 사용 하 여-의 증거-개념을 제공 합니다. 아래에 설명 된이 전략 모델 악성 암 선천적인와 다른 유전 질환과 관련 된을 쉽게 확장할 수 있다.
MSC 차별화 능률을 달성 하기 위해 여러 측면은 중요 합니다. 하나는 MSC 차별화를 시작 하기 전에 Ipsc의 문화 상태 이다. 원고에 제시 하는 프로토콜은 이전 연구 9,17를 기반으로 합니다. Ipsc는 적어도 2 주 동안 MEFs에 교양 있이 필요가 있다. 유지 좋은 Ipsc MEFs에 조건은 MSC 차별화 젤라틴 코팅 접시에 연결할 셀에 대 한 중요 한입니다. 또 다른 중요 한 측면…
The authors have nothing to disclose.
R. Z. 친목을 위한 암 예방 연구 훈련 프로그램 Pre-Doctoral (암 예방과 연구 연구소의 텍사스 RP160015 부여) UTHealth 혁신에 의해 지원 됩니다. Jt는 첫 번째 제휴 병원의 썬 얏-센 대학교의 애 린 프로그램에 의해 지원 됩니다. D. 플로리다 암 연구에서 CPRIT 학자 이며 독립 수상 R00 CA181496 및 CPRIT 수상 RR160019 NIH 통로에서 지 원하는.
Plastic ware | |||
100 mm Dish | Corning | 430107 | |
60 mm Dish | Corning | 430166 | |
6-well Plate | Falcon | 353046 | |
12-well Plate | Falcon | 353043 | |
48-well Plate | Falcon | 353078 | |
1 mL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-2721 | |
200 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-0706 | |
10 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-3700 | |
5 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
10 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
25 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
50 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
15 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
Culture materials and Reagents | |||
CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Invitrogen | A16517 | Commercial Sendai virus reprogramming kit |
Corning hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Basement membrane matrix |
CF1 MEFs, irradiated | ThermoFisher | A34180 | |
DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV | |
αMEM | Corning | 10-022-CV | |
StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | Commercial iPSC medium |
KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher | A3181502 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
L-Glutamine Solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Human FGF-basic (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
Recombinant Human PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | A4902 | |
Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
StemMACS Passaging Solution XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | Commercial passaging solution |
Accutatse Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution |
Thiazovivin (ROCK Inhibitor) | Calbiochem | 420220 | |
0.25% Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Collagenase, Type II | ThermoFisher | 17101015 | |
Human NANOG Antibody | R&D System | AF1997 | |
OCT4 Antibody (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody | R&D System | FAB1435P | |
Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen | DB Biosciences | 560123 | |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
PE Mouse Anti-Human CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
FITC Mouse Anti-Human CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
PE Mouse Anti-Human CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
PE Mouse Anti-Human CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
FITC Mouse Anti-Human CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | |
Chloroform | ThermoFisher | C298-500 | |
2-Propanol | ThermoFisher | A416-4 | |
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | ThermoFisher | BP28184 | |
DNase I, RNase-free (1 U/µL) | ThermoFisher | EN0521 | |
iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891BUN | |
iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free | Corning | 354262 | |
1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch | DB Biosciences | 309597 |