Aqui, apresentamos um protocolo para a geração de pluripotentes induzidas (iPSCs) as células-tronco do paciente fibroblastos derivada de síndrome de Li-Fraumeni (LFS), diferenciação de iPSCs através de células-tronco mesenquimais (MSCs) de osteoblastos e modelagem em vivo tumorigênese usando osteoblastos paciente-derivado do LFS.
Síndrome de Li-Fraumeni (LFS) é uma desordem autossômica dominante cancro hereditário. Pacientes com LFS estão predispostos a um vários tipos de tumores, incluindo o osteossarcoma..–Dentre as mais frequentes malignidades não-hematológicas primárias na infância e adolescência. Portanto, LFS fornece um modelo ideal para estudar esta malignidade. Aproveitando-se das metodologias de iPSC, osteossarcoma LFS-associados pode ser modelada com sucesso por diferenciação LFS iPSCs paciente para células-tronco mesenquimais (MSCs) e depois para os osteoblastos, as células de origem dos osteossarcomas. Esses osteoblastos LFS recapitular Propriedades oncogênicas de osteossarcoma, fornecendo um sistema de modelo atraente para delinear a patogênese de osteossarcoma. Este manuscrito demonstra um protocolo para a geração de iPSCs de fibroblastos de pacientes LFS, diferenciação de iPSCs para MSCs, diferenciação de MSCs para osteoblastos e tumorigênese na vivo usando os osteoblastos LFS. Este modelo de doença de iPSC pode ser estendido para identificar potenciais biomarcadores ou alvos terapêuticos para LFS-associado osteossarcoma.
Entre 2006 e 2007, vários resultados de avanço dos laboratórios de DRS Shinya Yamanaka e James A. Thomson levaram ao desenvolvimento de pluripotentes induzidas (iPSCs) as células-tronco1,2,3. Ao reprogramar células somáticas com fatores transcricionais definidos de forma iPSCs, pesquisadores foram capazes de gerar células com características chaves, ou seja, pluripotência e auto-renovação, que foi previamente pensada para apenas existem em células estaminais embrionárias humanas (hESCs). iPSCs pode ser gerado a partir de qualquer indivíduo ou o paciente e não precisava ser derivadas de embriões, vastamente, expandindo o repertório de doenças disponíveis e planos de fundo para o estudo. Desde então, paciente-derivado iPSCs foram usados para recapitular o fenótipo de várias doenças humanas, de doença de Alzheimer4 e esclerose lateral amiotrófica5 a longa QT síndrome6,7, 8.
Estes avanços na pesquisa de iPSC também abriram novos caminhos para a pesquisa do câncer. Muitos grupos têm usado recentemente iPSCs paciente ao desenvolvimento de câncer de modelo sob um fundo genético suscetível9,10,11, com a aplicação bem sucedida demonstrada até à data no osteossarcoma9, leucemia de11,10,12e câncer colorretal13. Embora modelos de iPSC-derivado de câncer estão ainda em sua infância, demonstraram ter grande potencial em phenocopying associada a doenças malignas, elucidar mecanismos patológicos e identificação de compostos terapêuticos14.
Síndrome de Li-Fraumeni (LFS) é uma desordem autossômica dominante cancro hereditário causada por TP53 germline mutação15. Pacientes com LFS estão predispostos a um vário tipo de malignidades, incluindo osteossarcoma, tornando o LFS iPSCs e suas células derivadas particularmente bem adaptado para estudar esta malignidade16. Um modelo baseado em iPSC osteossarcoma primeiro foi estabelecido em 2015 usar LFS paciente-derivado iPSCs9 posteriormente diferenciadas em células-tronco mesenquimais (MSCs) e em seguida de osteoblastos, o originando células de osteossarcoma. Esses osteoblastos LFS recapitular associado osteossarcoma diferenciação osteogênica defeitos e propriedades oncogênicas, demonstrando o modelo potencial como uma plataforma de “tumor ósseo em um prato”. Curiosamente, todo o genoma transcriptome análise revela aspectos de uma assinatura de gene de osteossarcoma em osteoblastos LFS e características desse perfil de expressão de gene LFS correlacionados com mau prognóstico no osteossarcoma9, indicando a potencial dos modelos de doença iPSCs LFS para revelar características de relevância clínica.
Este manuscrito fornece uma descrição detalhada de como usar LFS paciente-derivado iPSCs de osteossarcoma de modelo. Ele detalha a geração de iPSCs LFS, diferenciação de iPSCs para MSCs e em seguida a osteoblastos e uso de um modelo xenoenxertos na vivo usando os osteoblastos LFS. O modelo de doença LFS compreende várias vantagens, principalmente a capacidade de gerar células ilimitadas em todas as fases de desenvolvimento de osteossarcoma para estudos mecanicistas, identificação de biomarcadores e9,14, de despistagem de drogas 16.
Em resumo, o modelo de iPSC-baseado osteossarcoma LFS oferece um atraente sistema complementar para fazer avançar a pesquisa de osteossarcoma. Esta plataforma também fornece um prova de conceito para modelagem de câncer usando iPSCs paciente-derivado. Esta estratégia descrita abaixo pode ser facilmente estendida para malignidades modelo associadas com outras doenças genéticas com predisposições de câncer.
Para conseguir uma eficiência mais elevada diferenciação MSC, vários aspectos são críticos. Um é a condição de cultura de iPSCs antes de iniciar a diferenciação de MSC. O protocolo apresentado no manuscrito baseia-se em anteriores estudos 9,17. iPSCs precisam ser cultivadas em MEFs pelo menos 2 semanas. Manutenção iPSCs em boas condições MEFs são críticas para as células anexar na placa de gelatina-revestido para diferenciação de MSC. Outro as…
The authors have nothing to disclose.
R. z é suportado pelo UTHealth inovação para câncer prevenção investigação formação programa Pre-Doctoral (prevenção de câncer e Instituto de pesquisa de Texas conceder RP160015). J.T. é suportado pelo programa Ke Lin, da Universidade primeiro afiliado Hospital de Sun Yat-sen. D.-F.L. é o estudioso CPRIT na pesquisa do câncer e suportado pelo NIH caminho para independência prêmio R00 CA181496 e CPRIT RR160019 de prêmio.
Plastic ware | |||
100 mm Dish | Corning | 430107 | |
60 mm Dish | Corning | 430166 | |
6-well Plate | Falcon | 353046 | |
12-well Plate | Falcon | 353043 | |
48-well Plate | Falcon | 353078 | |
1 mL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-2721 | |
200 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-0706 | |
10 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-3700 | |
5 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
10 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
25 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
50 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
15 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
Culture materials and Reagents | |||
CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Invitrogen | A16517 | Commercial Sendai virus reprogramming kit |
Corning hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Basement membrane matrix |
CF1 MEFs, irradiated | ThermoFisher | A34180 | |
DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV | |
αMEM | Corning | 10-022-CV | |
StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | Commercial iPSC medium |
KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher | A3181502 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
L-Glutamine Solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Human FGF-basic (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
Recombinant Human PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | A4902 | |
Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
StemMACS Passaging Solution XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | Commercial passaging solution |
Accutatse Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution |
Thiazovivin (ROCK Inhibitor) | Calbiochem | 420220 | |
0.25% Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Collagenase, Type II | ThermoFisher | 17101015 | |
Human NANOG Antibody | R&D System | AF1997 | |
OCT4 Antibody (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody | R&D System | FAB1435P | |
Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen | DB Biosciences | 560123 | |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
PE Mouse Anti-Human CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
FITC Mouse Anti-Human CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
PE Mouse Anti-Human CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
PE Mouse Anti-Human CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
FITC Mouse Anti-Human CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | |
Chloroform | ThermoFisher | C298-500 | |
2-Propanol | ThermoFisher | A416-4 | |
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | ThermoFisher | BP28184 | |
DNase I, RNase-free (1 U/µL) | ThermoFisher | EN0521 | |
iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891BUN | |
iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free | Corning | 354262 | |
1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch | DB Biosciences | 309597 |