Summary

Modelagem de osteossarcoma usando síndrome de Li-Fraumeni paciente-derivado induzido Pluripotent Stem Cells

Published: June 13, 2018
doi:

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para a geração de pluripotentes induzidas (iPSCs) as células-tronco do paciente fibroblastos derivada de síndrome de Li-Fraumeni (LFS), diferenciação de iPSCs através de células-tronco mesenquimais (MSCs) de osteoblastos e modelagem em vivo tumorigênese usando osteoblastos paciente-derivado do LFS.

Abstract

Síndrome de Li-Fraumeni (LFS) é uma desordem autossômica dominante cancro hereditário. Pacientes com LFS estão predispostos a um vários tipos de tumores, incluindo o osteossarcoma..–Dentre as mais frequentes malignidades não-hematológicas primárias na infância e adolescência. Portanto, LFS fornece um modelo ideal para estudar esta malignidade. Aproveitando-se das metodologias de iPSC, osteossarcoma LFS-associados pode ser modelada com sucesso por diferenciação LFS iPSCs paciente para células-tronco mesenquimais (MSCs) e depois para os osteoblastos, as células de origem dos osteossarcomas. Esses osteoblastos LFS recapitular Propriedades oncogênicas de osteossarcoma, fornecendo um sistema de modelo atraente para delinear a patogênese de osteossarcoma. Este manuscrito demonstra um protocolo para a geração de iPSCs de fibroblastos de pacientes LFS, diferenciação de iPSCs para MSCs, diferenciação de MSCs para osteoblastos e tumorigênese na vivo usando os osteoblastos LFS. Este modelo de doença de iPSC pode ser estendido para identificar potenciais biomarcadores ou alvos terapêuticos para LFS-associado osteossarcoma.

Introduction

Entre 2006 e 2007, vários resultados de avanço dos laboratórios de DRS Shinya Yamanaka e James A. Thomson levaram ao desenvolvimento de pluripotentes induzidas (iPSCs) as células-tronco1,2,3. Ao reprogramar células somáticas com fatores transcricionais definidos de forma iPSCs, pesquisadores foram capazes de gerar células com características chaves, ou seja, pluripotência e auto-renovação, que foi previamente pensada para apenas existem em células estaminais embrionárias humanas (hESCs). iPSCs pode ser gerado a partir de qualquer indivíduo ou o paciente e não precisava ser derivadas de embriões, vastamente, expandindo o repertório de doenças disponíveis e planos de fundo para o estudo. Desde então, paciente-derivado iPSCs foram usados para recapitular o fenótipo de várias doenças humanas, de doença de Alzheimer4 e esclerose lateral amiotrófica5 a longa QT síndrome6,7, 8.

Estes avanços na pesquisa de iPSC também abriram novos caminhos para a pesquisa do câncer. Muitos grupos têm usado recentemente iPSCs paciente ao desenvolvimento de câncer de modelo sob um fundo genético suscetível9,10,11, com a aplicação bem sucedida demonstrada até à data no osteossarcoma9, leucemia de11,10,12e câncer colorretal13. Embora modelos de iPSC-derivado de câncer estão ainda em sua infância, demonstraram ter grande potencial em phenocopying associada a doenças malignas, elucidar mecanismos patológicos e identificação de compostos terapêuticos14.

Síndrome de Li-Fraumeni (LFS) é uma desordem autossômica dominante cancro hereditário causada por TP53 germline mutação15. Pacientes com LFS estão predispostos a um vário tipo de malignidades, incluindo osteossarcoma, tornando o LFS iPSCs e suas células derivadas particularmente bem adaptado para estudar esta malignidade16. Um modelo baseado em iPSC osteossarcoma primeiro foi estabelecido em 2015 usar LFS paciente-derivado iPSCs9 posteriormente diferenciadas em células-tronco mesenquimais (MSCs) e em seguida de osteoblastos, o originando células de osteossarcoma. Esses osteoblastos LFS recapitular associado osteossarcoma diferenciação osteogênica defeitos e propriedades oncogênicas, demonstrando o modelo potencial como uma plataforma de “tumor ósseo em um prato”. Curiosamente, todo o genoma transcriptome análise revela aspectos de uma assinatura de gene de osteossarcoma em osteoblastos LFS e características desse perfil de expressão de gene LFS correlacionados com mau prognóstico no osteossarcoma9, indicando a potencial dos modelos de doença iPSCs LFS para revelar características de relevância clínica.

Este manuscrito fornece uma descrição detalhada de como usar LFS paciente-derivado iPSCs de osteossarcoma de modelo. Ele detalha a geração de iPSCs LFS, diferenciação de iPSCs para MSCs e em seguida a osteoblastos e uso de um modelo xenoenxertos na vivo usando os osteoblastos LFS. O modelo de doença LFS compreende várias vantagens, principalmente a capacidade de gerar células ilimitadas em todas as fases de desenvolvimento de osteossarcoma para estudos mecanicistas, identificação de biomarcadores e9,14, de despistagem de drogas 16.

Em resumo, o modelo de iPSC-baseado osteossarcoma LFS oferece um atraente sistema complementar para fazer avançar a pesquisa de osteossarcoma. Esta plataforma também fornece um prova de conceito para modelagem de câncer usando iPSCs paciente-derivado. Esta estratégia descrita abaixo pode ser facilmente estendida para malignidades modelo associadas com outras doenças genéticas com predisposições de câncer.

Protocol

Este trabalho foi aprovado pela The University of Texas Health Science Center, em Houston (UTHealth) Comissão de bem-estar Animal. Os experimentos são realizados em estrita conformidade com as normas estabelecidas pelo centro de UTHealth para laboratório Animal medicina & conta (CLAMC) que é credenciado pela Associação Americana para o cuidado de Animal de laboratório (AAALAC International). Os seres humanos neste estudo enquadram cenário um (“não humano sujeitos Research”) conforme definido pela documentação …

Representative Results

Este protocolo apresenta os procedimentos, incluindo geração de iPSC LFS, diferenciação MSC, diferenciação osteoblástica e na vivo o ensaio de tumorigênese usando LFS MSC-derivado de osteoblastos. Esquema para a geração de iPSCs LFS de fibroblastos usando um vírus de Sendai comercialmente disponível kit de reprogramação é mostrada na figura 1A. Baseados em vírus Sendai entre…

Discussion

Para conseguir uma eficiência mais elevada diferenciação MSC, vários aspectos são críticos. Um é a condição de cultura de iPSCs antes de iniciar a diferenciação de MSC. O protocolo apresentado no manuscrito baseia-se em anteriores estudos 9,17. iPSCs precisam ser cultivadas em MEFs pelo menos 2 semanas. Manutenção iPSCs em boas condições MEFs são críticas para as células anexar na placa de gelatina-revestido para diferenciação de MSC. Outro as…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

R. z é suportado pelo UTHealth inovação para câncer prevenção investigação formação programa Pre-Doctoral (prevenção de câncer e Instituto de pesquisa de Texas conceder RP160015). J.T. é suportado pelo programa Ke Lin, da Universidade primeiro afiliado Hospital de Sun Yat-sen. D.-F.L. é o estudioso CPRIT na pesquisa do câncer e suportado pelo NIH caminho para independência prêmio R00 CA181496 e CPRIT RR160019 de prêmio.

Materials

Plastic ware
100 mm Dish Corning 430107
60 mm Dish Corning 430166
6-well Plate Falcon 353046
12-well Plate Falcon 353043
48-well Plate Falcon 353078
1 mL Pipet Tip USA Scientific 1111-2721
200 µL Pipet Tip USA Scientific 1111-0706
10 µL Pipet Tip USA Scientific 1111-3700
5 mL Serological Pipette SARSTEDT 86.1253.001
10 mL Serological Pipette SARSTEDT 86.1254.001
25 mL Serological Pipette SARSTEDT 86.1685.001
50 mL Tube, PP SARSTEDT 62.547.100
15 mL Tube, PP SARSTEDT 62.554.100
Culture materials and Reagents
CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Invitrogen A16517 Commercial Sendai virus reprogramming kit
Corning hESC-Qualified Matrix Corning 354277 Basement membrane matrix
CF1 MEFs, irradiated ThermoFisher A34180
DMEM Sigma-Aldrich D5671
DMEM/F12 Corning 10-090-CV
αMEM Corning 10-022-CV
StemMACS iPS-Brew XF Miltenyi Biotec 130-104-368 Commercial iPSC medium
KnockOut DMEM/F-12 ThermoFisher 12660012
FBS Opti-Gold GenDEPOT F0900-050
KnockOut Serum Replacement ThermoFisher A3181502
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
MEM Nonessential Amino Acids Corning 25-025-CI
L-Glutamine Solution Sigma-Aldrich G7513
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Human FGF-basic (bFGF) PEPROTECH 100-18B
Recombinant Human PDGF-AB PEPROTECH 100-00AB
β-Glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422
Dexamethasone Sigma-Aldrich A4902
Ascorbic Acid Sigma-Aldrich A5960
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) Corning 21-031-CV
StemMACS Passaging Solution XF Miltenyi Biotec 130-104-688 Commercial passaging solution
Accutatse Cell Detachment Solution Corning 25-058-CI Cell detachment solution
Thiazovivin (ROCK Inhibitor) Calbiochem 420220
0.25% Trypsin-EDTA Solution Sigma-Aldrich T4049
Collagenase, Type II   ThermoFisher 17101015
Human NANOG Antibody R&D System AF1997
OCT4 Antibody (H-134) Santa Cruz sc-9081
Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody R&D System FAB1435P
Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen DB Biosciences 560123
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 705-545-003
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 111-545-144
PE Mouse Anti-Human CD105 eBioscience 12-1057-42
FITC Mouse Anti-Human CD44 DB Biosciences 555478
PE Mouse Anti-Human CD73 DB Biosciences 550257
PE Mouse Anti-Human CD166 DB Biosciences 560903
FITC Mouse Anti-Human CD24 DB Biosciences 555427
Donkey Serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Goat Serum Jackson ImmunoResearch 005-000-121
Alkaline Phosphatase Staining Kit II Stemgent 00-0055
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
TRIzol Reagent ThermoFisher 15596018
Chloroform ThermoFisher C298-500
2-Propanol ThermoFisher A416-4
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade ThermoFisher BP28184
DNase I, RNase-free (1 U/µL) ThermoFisher EN0521
iScript cDNA Synthesis Kit BioRad 1708891BUN
iQ SYBR Green Supermix BioRad 1708884
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free Corning 354262
1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch DB Biosciences 309597

References

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Zhou, R., Xu, A., Tu, J., Liu, M., Gingold, J. A., Zhao, R., Lee, D. Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (136), e57664, doi:10.3791/57664 (2018).

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