Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para a geração de pluripotentes induzidas (iPSCs) as células-tronco do paciente fibroblastos derivada de síndrome de Li-Fraumeni (LFS), diferenciação de iPSCs através de células-tronco mesenquimais (MSCs) de osteoblastos e modelagem em vivo tumorigênese usando osteoblastos paciente-derivado do LFS.
Abstract
Síndrome de Li-Fraumeni (LFS) é uma desordem autossômica dominante cancro hereditário. Pacientes com LFS estão predispostos a um vários tipos de tumores, incluindo o osteossarcoma..--Dentre as mais frequentes malignidades não-hematológicas primárias na infância e adolescência. Portanto, LFS fornece um modelo ideal para estudar esta malignidade. Aproveitando-se das metodologias de iPSC, osteossarcoma LFS-associados pode ser modelada com sucesso por diferenciação LFS iPSCs paciente para células-tronco mesenquimais (MSCs) e depois para os osteoblastos, as células de origem dos osteossarcomas. Esses osteoblastos LFS recapitular Propriedades oncogênicas de osteossarcoma, fornecendo um sistema de modelo atraente para delinear a patogênese de osteossarcoma. Este manuscrito demonstra um protocolo para a geração de iPSCs de fibroblastos de pacientes LFS, diferenciação de iPSCs para MSCs, diferenciação de MSCs para osteoblastos e tumorigênese na vivo usando os osteoblastos LFS. Este modelo de doença de iPSC pode ser estendido para identificar potenciais biomarcadores ou alvos terapêuticos para LFS-associado osteossarcoma.
Introduction
Entre 2006 e 2007, vários resultados de avanço dos laboratórios de DRS Shinya Yamanaka e James A. Thomson levaram ao desenvolvimento de pluripotentes induzidas (iPSCs) as células-tronco1,2,3. Ao reprogramar células somáticas com fatores transcricionais definidos de forma iPSCs, pesquisadores foram capazes de gerar células com características chaves, ou seja, pluripotência e auto-renovação, que foi previamente pensada para apenas existem em células estaminais embrionárias humanas (hESCs). iPSCs pode ser gerado a partir de qualquer indivíduo ou o paciente e não precisava ser derivadas de embriões, vastamente, expandindo o repertório de doenças disponíveis e planos de fundo para o estudo. Desde então, paciente-derivado iPSCs foram usados para recapitular o fenótipo de várias doenças humanas, de doença de Alzheimer4 e esclerose lateral amiotrófica5 a longa QT síndrome6,7, 8.
Estes avanços na pesquisa de iPSC também abriram novos caminhos para a pesquisa do câncer. Muitos grupos têm usado recentemente iPSCs paciente ao desenvolvimento de câncer de modelo sob um fundo genético suscetível9,10,11, com a aplicação bem sucedida demonstrada até à data no osteossarcoma9, leucemia de11,10,12e câncer colorretal13. Embora modelos de iPSC-derivado de câncer estão ainda em sua infância, demonstraram ter grande potencial em phenocopying associada a doenças malignas, elucidar mecanismos patológicos e identificação de compostos terapêuticos14.
Síndrome de Li-Fraumeni (LFS) é uma desordem autossômica dominante cancro hereditário causada por TP53 germline mutação15. Pacientes com LFS estão predispostos a um vário tipo de malignidades, incluindo osteossarcoma, tornando o LFS iPSCs e suas células derivadas particularmente bem adaptado para estudar esta malignidade16. Um modelo baseado em iPSC osteossarcoma primeiro foi estabelecido em 2015 usar LFS paciente-derivado iPSCs9 posteriormente diferenciadas em células-tronco mesenquimais (MSCs) e em seguida de osteoblastos, o originando células de osteossarcoma. Esses osteoblastos LFS recapitular associado osteossarcoma diferenciação osteogênica defeitos e propriedades oncogênicas, demonstrando o modelo potencial como uma plataforma de "tumor ósseo em um prato". Curiosamente, todo o genoma transcriptome análise revela aspectos de uma assinatura de gene de osteossarcoma em osteoblastos LFS e características desse perfil de expressão de gene LFS correlacionados com mau prognóstico no osteossarcoma9, indicando a potencial dos modelos de doença iPSCs LFS para revelar características de relevância clínica.
Este manuscrito fornece uma descrição detalhada de como usar LFS paciente-derivado iPSCs de osteossarcoma de modelo. Ele detalha a geração de iPSCs LFS, diferenciação de iPSCs para MSCs e em seguida a osteoblastos e uso de um modelo xenoenxertos na vivo usando os osteoblastos LFS. O modelo de doença LFS compreende várias vantagens, principalmente a capacidade de gerar células ilimitadas em todas as fases de desenvolvimento de osteossarcoma para estudos mecanicistas, identificação de biomarcadores e9,14, de despistagem de drogas 16.
Em resumo, o modelo de iPSC-baseado osteossarcoma LFS oferece um atraente sistema complementar para fazer avançar a pesquisa de osteossarcoma. Esta plataforma também fornece um prova de conceito para modelagem de câncer usando iPSCs paciente-derivado. Esta estratégia descrita abaixo pode ser facilmente estendida para malignidades modelo associadas com outras doenças genéticas com predisposições de câncer.
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Protocol
Este trabalho foi aprovado pela The University of Texas Health Science Center, em Houston (UTHealth) Comissão de bem-estar Animal. Os experimentos são realizados em estrita conformidade com as normas estabelecidas pelo centro de UTHealth para laboratório Animal medicina & conta (CLAMC) que é credenciado pela Associação Americana para o cuidado de Animal de laboratório (AAALAC International). Os seres humanos neste estudo enquadram cenário um ("não humano sujeitos Research") conforme definido pela documentação do NIH SF424. Portanto, não precisa qualquer aprovação pelo Comitê de ética de pesquisa humana UTHealth.
1. geração de iPSCs LFS (figura 1A)
- Dia -2, placa de 2 x 104 fibroblastos de pacientes LFS em um poço de uma placa de 6 e cultura das células com o meio de fibroblasto (tabela 1) a 37 ° C em um 5% umidificado incubadora de CO2 . Certifique-se que os fibroblastos chegar a confluência de 50-60% no dia da transdução (dia 0).
- Realize a transdução vírus Sendai no dia 0. Para fazer isso, substitua o gasto médio com médio pré-aquecido fibroblasto. Descongele o comercial Sendai vírus reprogramação kit (veja a Tabela de materiais) no gelo. Infectar fibroblastos LFS com vírus de Sendai misturados de acordo com as instruções do fabricante.
- Manutenção das células transduzidas em meio de fibroblasto (dia 1-6):
- No dia 1, 24h depois de transdução, remover o meio de fibroblasto contendo o restante dos vírus Sendai e substituí-lo com 2 mL de meio de fibroblasto fresco. Cultura de fibroblastos transduzidos a 37 ° C em um 5% umidificado incubadora de CO2 .
- Mude o meio com o meio de fibroblasto todos os dias a partir do dia 2-6.
- Manutenção das células transduzidas na condição de cultura de alimentador (dia 7-28):
- Irradiados CF1 fibroblasto embrionário de rato se prepare pratos de cultura (MEF) no dia 6. Para fazer este casaco seis pratos de cultura de tecidos de 100mm pela adição de 5 mL de gelatina de 0,1% para cada chapa em temperatura ambiente por 30 min. Aspire a gelatina de 0,1%, após o revestimento.
- Remova MEFs do contêiner de nitrogênio líquido. Descongele o MEFs usando o sistema de descongelamento comercialmente disponível seguindo as instruções do fabricante. As células com as placas de gelatina-revestido da placa com meio de cultura MEF/MSC (tabela 1) com uma densidade de semeadura de em torno de 6,7 x 105 células por prato de cultura de tecidos de 100 mm.
- Inocular as células transduzidas em placas MEF (dia 7): Trypsinize as células transduzidas com 1 mL de 0,25% Trypsin-EDTA por prato de 100 mm para 2-4 min à temperatura ambiente. Neutralize a tripsina com 9 mL de meio de fibroblasto. Células de transferência para tubos cônicos e células de centrífuga a 230 x g a 37 ° C por 4 min. placa transduzidos fibroblastos nos MEF seis pratos preparados no dia 6 e a cultura deles em 8 mL de meio de fibroblasto por prato.
Nota: A confluência de MEFs é de cerca de 20% antes da semeadura transduzida célula em placas MEF. - No dia 8, descartar o meio de fibroblasto e substituir com hESC médio (tabela 1).
- Espere o surgimento de clones de iPS dos dias 9-28 (Figura 1C). Mudar a hESC gasto médio de cada outro dia e monitorar o surgimento de clones de iPS sob o microscópio. Esperar por clones de iPSCs grandes o suficiente para ser observado a olho nu e então continuar a expandir clones de iPS em condição de cultura livre do alimentador.
- Expansão dos iPS surgiu clones em condição de cultura livre de alimentador (dia 29-79 ~ 99):
- Para preparar a placa matriz-revestido, revesti uma placa de 48 com 120 µ l da solução de revestimento de matriz de membrana basal (tabela 1) por poço. Verifique se a solução de revestimento de matriz de membrana basal abrange o poço e reveste a superfície do prato de cultura. Deixá-lo em temperatura ambiente por 1 h. aspirar a solução de revestimento, imediatamente antes do uso e adicionar 250 µ l de meio hESC por alvéolo com inibidor ROCK 2 µM Thiazovivin.
- O dia 28, aspirar a hESC gasto médio e clones de iPS com 1 x DPBS de lavar. Pega iPS visível clones com uma ponta da pipeta de 1 mL e transferir para um poço de uma placa de 48-bem tratada (etapa 1.4.1). Uma colônia de sementes por alvéolo de placa de 48.
- Centrifugue a placa a 230 x g, durante 4 min facilitar a fixação da célula. Cultura de clones de iPS a 37 ° C em um 5% umidificado incubadora de CO2 .
- No dia seguinte (dia 29), remover a hESC gasto médio e adicionar 250 µ l do meio de iPSC comercialmente disponíveis em cada poço.
- Manter os clones de iPS a 37 ° C em um 5% umidificado incubadora de CO2 e alterar o meio de iPSC todos os dias.
- Quando iPS clones atingem 85% confluência, subcultura células em um 01:10 relação, em área de cultura. Adicione 60 µ l da solução comercial passaging para separar as células e incubar a 37 ° C por 3 min.
- Metade do iPSCs isolada em uma placa de 12-poços de matriz-revestido da membrana basal em 1 mL de meio de hESC com inibidor ROCK 2 µM Thiazovivin as sementes. Cultura de clones de iPS em uma placa de 12 com 1 mL do meio de iPSC comercialmente disponível por poço e a subcultura iPSCs em um 01:10 relação até atingirem a passagem 10.
Nota: iPSCs são sub cultivada em 5-7 dias em um 01:10 proporção. Demora até 10 semanas para alcançar a passagem 10 iPS clones. caracterizações de iPSC, incluindo morfologia celular, atividade de fosfatase alcalina (AP) e a expressão de fatores de pluripotência e marcadores hESC, podem ser examinadas após a confirmação da remoção do vírus Sendai em iPSCs (geralmente demonstrada após cerca de 10 passagens) (figura 1B-E). Informações de anticorpo e primer para caracterização de iPSC estão incluídos na tabela 2 e 4.
2. diferenciação de iPSCs LFS para células tronco mesenquimais (MSCs) (Figura 2A)
- Clones de iPSC de cultura em placas MEF pelo menos 2 semanas (dia ~ -14-0): preparar os pratos MEF (pratos de cultura de tecidos de 100mm) como descritos anteriormente (1.3.1 - 1.3.2). Manter iPSCs hESC médio e mudar meio todos os dias. Sempre que iPSCs alcançar 90% confluência, subcultura iPSCs pela 01:10 diluição.
- Remoção de MEFs de iPSCs (dia 0):
- Depois de manter iPSCs em MEFs por 2 semanas, cultura iPSCs em pratos de cultura de tecidos de 100 mm até células alcançar confluência de 80-90%. Retire a hESC gasto médio e lave iPSCs com 5 mL de 1 x DPBS. Adicione 1 mL da solução de desprendimento de célula para separar as células e incubar a temperatura ambiente por 3 min.
- Adicione 9 mL do meio de cultura MEF/MSC para a placa para neutralizar a atividade de solução de desprendimento celular e transferir as células destacadas para um novo prato de cultura de tecidos de 100 mm sem qualquer revestimento.
- Incube as celulas em temperatura ambiente por 30 min permitir que os MEFs anexar à placa.
- Recolha cuidadosamente o sobrenadante que contém iPSCs desanexado e centrifugar 230 x g a 4 ° C por 4 min.
Nota: Rubor descuidadamente a placa inferior leva ao desprendimento de MEFs.
- Diferenciação de iPSCs em direção MSCs (dia 0 - 28):
- Casaco três poços de uma placa de 6 com 1 mL de 0.1% de gelatina por bem à temperatura ambiente por 30 min.
- Retire o sobrenadante das iPSCs coletados 2.2.4.
- Resuspenda iPSCs em 6 mL de meio de diferenciação de MSC (tabela 1) e células de sementes em três poços revestidos com 2 mL por bem (dia 0).
- Altere o meio de diferenciação de MSC em dois dias para remover células desanexadas e/ou mortas (dia 1 - 28).
- Maturação de iPSC-derivado MSCs (dia 28-45):
- Remover o gasto médio de diferenciação de MSC e lavam-se células com 1 mL de 1 x DPBS.
- Trypsinize MSCs com 0,5 mL de 0,25% Trypsin-EDTA por bem à temperatura ambiente por 3 min.
- Neutralizar a tripsina por 1,5 mL do meio de cultura de MEF/MSC e coletar MSCs de três poços em um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar a 230 x g a 4 ° C por 4 min.
- Remover o sobrenadante e ressuspender MSCs em 3 mL de meio de cultura MEF/MSC e placa sobre uma 60mm 0,1% gelatina-placa revestida (dia 28).
- MSCs a cultura em meio de cultura MEF/MSC e mudar a médio em dois dias. Quando as células atingem 100% confluência, subcultura MSCs na proporção de 1:3, usando 0,25% Trypsin-EDTA.
Nota: Os MSCs exibem uma morfologia de fibroblasto tipo (Figura 2B). Quando MSCs crescerem em um high-density, MSCs alongadas podem formar um redemoinho padrão (Figura 2B). - Executar a coloração imunofluorescente para avaliar MSCs iPSC-derivado através da análise de marcadores de superfície MSC CD44, CD73, CD105 e CD166 (Figura 2).
Nota: A diluição de anticorpos são mostrados na tabela 2. A coloração imunofluorescente de células vivas é realizada de acordo com as instruções do fabricante. - Após a confirmação, expanda MSCs na proporção de 1:3 em pratos de cultura de tecidos de 100 mm. Congelar para baixo frascos (3 frascos por prato de cultura de tecidos de 100mm) usando o meio de congelação contendo DMSO 10% e 90% FBS.
Nota: Para enriquecer a população MSC, MSCs podem ser classificados usando CD105+, CD24-critério por citometria de fluxo9,17. iPSC-derivado MSCs diferenciadas usando o método PDGF-AB-baseado geralmente podem ser mantidas por 2-3 meses em cultura sem perda de identidade MSC9. Congele o MSCs de um número de passagem antecipada após a confirmação de características MSC.
3. diferenciação de LFS MSCs para osteoblastos (Figura 3A)
- Preparação do MSCs para a diferenciação osteogênica (dia -1)
- Para garantir uma quantidade adequada de células para completar o protocolo de diferenciação osteogênica, começam com MSCs cultivadas em pratos de cultura de tecidos de 100 mm a confluência de 95%. Retire o gasto médio de cultura e lave MSCs com 5 mL de 1 x DPBS.
- Trypsinize MSCs com 1 mL de 0,25% do trypsin-EDTA por prato de 100mm em temperatura ambiente por 3 min. Para garantir que as células não são mais trypsinized, parar tripsinização quando 50% do destacamento celular é observada ao microscópio.
- Neutralizar a tripsina por 9 mL do meio de cultura MEF/MSC e coletar MSCs de 3 poços em um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar a 230 x g a 4 ° C por 4 min.
- Aspire o sobrenadante e ressuspender MSCs em 5 mL de meio MSC contar o número de células por um hemocytometer.
- Placa número adequado de MSCs numa placa de cultura.
Nota: O detalhe dos números de telemóvel de placa de 12 6-placa e pratos de cultura de tecidos de 100mm são resumidos na tabela 3.
- Indução de diferenciação osteogênica por meio de diferenciação osteoblástica (ODM) (tabela 1) (dia 0 - 24):
- Aspire o meio de cultura MEF/MSC e substituir com o volume adequado de ODM (1ml, 2ml e 8 mL para cada poço da placa de 12, cada poço da placa de 6 e cultura de tecidos de 100 mm do prato, respectivamente) para diferenciar MSCs para osteoblastos (dia 0).
- Aspirar o ODM irradiado e substituir com o volume adequado de ODM em dois dias durante o processo de diferenciação osteogênica.
- Executar a fosfatase alcalina (AP) e a alizarina Red S (ARS) coloração para detectar a fosfatase alcalina óssea associada produzida por pré-osteoblastos e deposição mineral produzido por amadurecer osteoblastos, respectivamente, no dia 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 e 24 ( Figura 3B).
Nota: AP manchando e ARS coloração são executadas usando o kit disponível comercialmente, seguindo o protocolo do fabricante. - Examinar os níveis de expressão de marcadores de osteoblastos maduros e preosteoblast (ALPL e COL1A1 para pré-osteoblastos; PTH1R e BGLAP para amadurecem os osteoblastos) por qRT-PCR (Figura 3).
Nota: Coloração positiva AP é esperada após dia 9 de diferenciação osteogênica e coloração positiva de ARS pode ser esperado após o dia 21 de diferenciação osteogênica. Os MSCs crescendo em meio de cultura MEF/MSC podem ser servidos como um controle negativo de AP mancha e mancha de ARS.
4. o modelo de enxerto para estudar na Vivo tumorigênese dos osteoblastos LFS MSC-derivado (Figura 4A)
- Diferenciação de LFS MSCs para osteoblastos:
- Semente 3-4.5 x 105 MSCs em placa de cultura de tecido de 100 mm. Prepare cinco pratos para uma injeção subcutânea.
- Cultura MSCs no ODM para diferenciar MSCs de osteoblastos, conforme descrito em 3.2 até o dia 14.
- Preparação dos osteoblastos diferenciados para injeção subcutânea:
- Para preparar a solução de desprendimento de osteoblastos (tabela 1), dissolva colagenase II tipo 1 g em 1.000 mL de meio αMEM tornar a solução II de colagenase (1 mg/mL). Manter a solução II de colagenase a-20 ° C. Misture a 0,25% Trypsin-EDTA e a solução II de colagenase na proporção de 1:1 para fazer os osteoblastos solução de desprendimento.
- Retire o ODM irradiado e lave osteoblastos diferenciados com 5 mL de 1 x DPBS por prato de 100 mm.
- Adicionar 1,5 mL da solução de desprendimento osteoblast por prato de 100mm e incubar pratos a 37 ° C por 30 min. Examine e garantir o destacamento de osteoblastos por microscopia.
- Neutralizar a solução de desprendimento de osteoblastos pelos ODM e coletar os osteoblastos isolados em um tubo cónico de 50 mL. Centrifugar a 230 x g a 4 ° C por 5 min.
- Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 25 mL de meio ODM. Passe as células através de um filtro de célula 70 µm para remover agregados de células. Conte o número de células usando um hemocytometer.
- Prepare-se 1 x 107 osteoblastos por injeção subcutânea e células de centrífuga a 230 x g a 4 ° C por 4 min.
- Resuspenda os 1 x 107 osteoblastos em 50 µ l gelada 1 x DPBS. Mix diferenciado osteoblastos com 50 µ l de matriz livre da membrana basal de vermelho de fenol (osteoblastos matriz suspensão e membrana basal foram misturados na proporção de 1:1) e manter os osteoblastos no gelo antes da injeção.
-
Em vivo modelo de tumor do enxerto heterólogo de osteoblastos LFS MSC-derivado:
- ANESTHETIZE ratos NU/NU imunocomprometidos fêmeas por 8 semanas em uma câmara de fornecimento de 5% (v/v) inalado isoflurano em 1 L/min de oxigênio (fornecido pelo CLAMC). Depois que o animal se torna reclinado, mude o sistema de entrega de anestésico para o cone de nariz, fornecimento de 2% (v/v) inalado isoflurano em 200mL/min de oxigênio (fornecido pelo CLAMC). Monitore a profundidade da anestesia, verificando os reflexos da córnea e pedais para fazer os ratos são suficientemente anestesiados e não sofrem de desconforto durante o procedimento.
- Desinfete a área a ser injetado com cotonetes alternadas de clorexidina e 70% de isopropanol. Use agulha 26G para realizar a injeção subcutânea de membrana basal misturado a matriz osteoblastos LFS em um lado de patas de ratos NU/NU 8-week-old imunocomprometidos (Figura 4A).
- Monitor de ratos através da realização de palpação semanal em locais de injeção para crescimento de densidades nodulares subcutâneas. Formação de tumor pode ser observada cerca de 6 a 10 semanas após a injeção (Figura 4B).
- Eutanásia em ratos pelo método de asfixia de dióxido de carbono seguido por deslocamento cervical. Disse os tumores desenvolvidos. Determine o grau do tumor e o índice de diferenciação, pré-osteoblastos e osteoblastos maduros por vários métodos de coloração (por exemplo, hematoxilina e eosina (H & E) coloração, coloração Picro Sirius vermelho e von Kossa coloração respectivamente).
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Representative Results
Este protocolo apresenta os procedimentos, incluindo geração de iPSC LFS, diferenciação MSC, diferenciação osteoblástica e na vivo o ensaio de tumorigênese usando LFS MSC-derivado de osteoblastos.
Esquema para a geração de iPSCs LFS de fibroblastos usando um vírus de Sendai comercialmente disponível kit de reprogramação é mostrada na figura 1A. Baseados em vírus Sendai entrega dos Yamanaka quatro fatores é um método de reprogramação não-integração. Portanto, clones de iPSC LFS estáveis devem ser livres de genoma do vírus Sendai e perda de exógenos OCT4, SOX2, KLF4 e c-MYC transgenes, que pode ser examinada por RT-PCR utilizando primers específicos (figura 1B). Como sugere-se nas instruções do fabricante, geração de iPSCs isento de vírus Sendai depende de condições tanto a cultura e a passagem. Sob as condições de cultura descrito neste protocolo, remoção de vírus Sendai em iPSCs geralmente pode ser detectada após 10 passagens (figura 1B). Os clones de iPSC LFS estabelecidos devem expor a morfologia típica hESC e mostram a atividade positiva de AP (Figura 1). LFS iPSCs altamente express pluripotência fator mRNAs (NANOG, OCT4, SOX2, DPPA4e REX1), comparável à linha hESC H1 e muito maior do que o fibroblasto parental (Figura 1). A expressão de fatores de pluripotência (NANOG, OCT4) e marcadores hESC (SSEA4 e TRA-1-81) também pode ser examinada pela coloração imunofluorescente (Figura 1E).
iPSCs são mantidos em MEFs pelo menos 14 dias antes de iniciar a diferenciação de MSC (Figura 2A). Embora muita morte celular ocorrem durante a diferenciação do MSC, massas de células diferenciadas são visíveis na placa de cultura de células e fibroblasto como MSCs na borda das massas celulares podem ser observados no dia 28. (Figura 2B). Depois sub cultivo diferenciadas células em meio de cultura MEF/MSC, MSCs diferenciadas proliferaram rapidamente mostram a morfologia dos fibroblastos, como em torno de 35 dias e então gradualmente representam uma forma alongada e formam um padrão de redemoinho em 40 dias (Figura 2B ). Diferenciada LFS MSCs expressar marcadores MSC, incluindo CD44, CD73, CD105 e CD166 pela mancha (Figura 2).
Figura 3A descreve diferenciação osteoblástica. Quando MSCs são sujeitas aos sinais de diferenciação osteogênica, as células diferenciadas começam a mostrar atividade de fosfatase alcalina positivo no dia 9 (Figura 3B). ARS a coloração pode ser usada para detectar a deposição mineral produzida por osteoblastos maduros. A cor vermelha brilhante, coloração em vez de manchas de cor marrom indica o resultado positivo da ARS coloração, que pode ser observado após 21 dias (Figura 3B). Os diferenciação de osteoblastos mostram expressão crescente nível de genes preosteoblast (ALPL e COL1A1) e genes de osteoblastos maduros (BGLAP e PTH1R) durante a diferenciação osteogênica.
Modelo de enxerto heterólogo in vivo pode ser estabelecido através da injeção por via subcutânea LFS MSC-derivado de osteoblastos em camundongos NU/NU (Figura 4A). Tumores podem ser observados 6-10 semanas após a injeção subcutânea (Figura 4B). Os tumores de osteoblasto-derivado de LFS demonstraram características osteoblast imaturo, atividade de AP positiva (coloração de AP), deposição de matriz de colagénio positiva (coloração de picrosirius vermelho) mas negativa mineralização (von Kossa coloração) (Figura 4) .
Figura 1 : geração de iPSC do pacientes fibroblastos LFS. (A) diagrama esquemático da geração de iPSC. (B) deteção de RT-PCR do genoma do vírus Sendai e transgenes (KOS (KLF4, OCT4, e SOX2), KLF4, e c-MYC) no clone de iPSC reprogramadas após 10 passagens (à esquerda) e pós-infecção do fibroblasto dia 11 (à direita, controlo positivo). LFS iPSC clone está livre de vírus Sendai após 10 passagens. GAPDH é mostrado como controle interno. (C) morfologia do LFS iPSCs e AP coloração de células. Barra de escala, 50 µm (D) qRT-PCR de NANOG, OCT4, SOX2, DPPA4e expressão de RNAm de REX1 em iPSCs LFS. linha hESC H1 e fibroblastos LFS parentais são usados como um positivo e um negativo, respectivamente. A expressão do mRNA é normalizada para GAPDH expressão. A expressão do mRNA relativo é ajustada para hESC linha H1 como 1. (E) imunocoloração de fatores de transcrição de pluripotentes hESC (NANOG e OCT4) e marcadores de superfície de hESC (SSEA4 e TRA-1-81) em iPSCs LFS. Barra de escala, 50 µm. A diluição de anticorpos utilizados neste estudo são mostrados na tabela 2. As sequências de primeira demão são mostradas na tabela 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Diferenciação de iPSCs LFS para MSCs. (A) diagrama esquemático da diferenciação MSC PDGF-AB-induzida. (B) morfologia do LFS iPSC-derivado MSCs em diferenciação dia 28, 36 de dia e dia 40 + da pilha. Barra de escala, 100 µm. (C) mancha da imunofluorescência demonstra que diferenciada LFS MSCs exibem CD44+, CD73+, CD105+, CD166+e CD24 assinatura– . Barra de escala, 30 µm. A diluição de anticorpos utilizados neste estudo são mostrados na tabela 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Diferenciação de LFS MSCs para osteoblastos. (A) diagrama esquemático da diferenciação osteogênica. (B) AP e ARS coloração são realizados em pontos diferentes de tempo (dia 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 e 24). Diferenciação osteoblástica de osteoblastos LFS MSC-derivado devem conduzir a positivo AP coloração próximo dia 9 e ARS positivo mancha no dia 21. (C) o qRT-PCR análise demonstra o aumento da expressão de pre-osteoblastos (ALPL e COL1A1) e osteoblastos maduros (PTH1R e BGLAP) genes durante a diferenciação osteogênica. A expressão do mRNA é normalizada para GAPDH expressão. Níveis de expressão foram em relação a células em diferenciação dia 0. As sequências de primeira demão são mostradas na tabela 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Na vivo tumorigênese dos osteoblastos derivados LFS MSC. (A) diagrama esquemático de enxerto heterólogo tumor dos osteoblastos LFS. (B) ratos NU/NU bear tumores osteoblast-derivado de LFS após 10 semanas de injeção subcutânea. (C) LFS osteoblast-derivado tumores foram examinados por H & E, AP, picrosirius vermelho e von Kossa mancha para morfologia, osso associada AP, colágeno e os depósitos minerais, respectivamente. Os tumores LFS-derivados representam características de osteoblastos imaturos mostrando positiva atividade AP, colágeno positivo e negativa mineralização mineral. Barra de escala, 1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Médio de fibroblastos (500 mL) | |
| DMEM | 440 mL |
| FBS inactivadas pelo calor | 50 mL |
| Antibiotics(Pen/Strep) (100 x) | 5 mL |
| Aminoácido não essencial (100 x) | 5 mL |
| 2-Mercaptoetanol | 3.5 Μ l |
| Meio de cultura MEF/MSC (500 mL) | |
| DMEM | 440 mL |
| FBS inactivadas pelo calor | 50 mL |
| Antibiotics(Pen/Strep) (100 x) | 5 mL |
| L-glutamina (100 x) | 5 mL |
| hESC médio (500 mL) | |
| DMEM/F-12 | 384,5 mL |
| Substituição de soro nocaute | 100 mL (total: 20%) |
| Aminoácido não essencial (100 x) | 5 mL |
| Antibióticos (caneta/Strep) (100x) | 5 mL |
| L-glutamina (100 x) | 5 mL |
| bFGF (10 µ g/mL) | 500 Μ l |
| 2-Mercaptoetanol | 3.5 Μ l |
| Meio de diferenciação de MSC (500 mL) | |
| Nocaute DMEM/F-12 ou DMEM/F-12 | 445 mL |
| Substituição de soro nocaute | 50 mL |
| bFGF (10 µ g/mL) | 500 µ l (10 ng/mL) |
| PDGF-AB (25 µ g/mL) | 200 µ l (10 ng/mL) |
| Aminoácido não essencial (100 x) | 5 mL |
| 2-Mercaptoetanol | 3.5 Μ l |
| Meio de diferenciação osteoblástica (ODM) (500 mL) | |
| ΑMEM | 395 mL |
| FBS inactivadas pelo calor | 50 mL |
| β-glicerofosfato de 10 mM | 50 mL (1,08 g em 50 mL αMEM) |
| Dexametasona 0,1 µM (sensível à luz) | 10 µ l de dexametasona 5 mM |
| Ácido ascórbico de 200 µM (sensível à luz) | 100 µ l de ácido ascórbico de 1 mM |
| Antibióticos (caneta/Strep) (100x) | 5 mL |
| Solução de revestimento Matrigel (50 mL) | |
| Matriz de membrana basal | 2 mL |
| DMEM/F-12 (pre-frio 4 ° C) | 48 mL |
| Solução de desprendimento de osteoblastos (50 mL) | |
| 0,25% trypsin-EDTA | 25 mL |
| Solução II de colagenase (1 mg/mL) | 25 mL |
| Nota: Prepare direito fresco de osteoblastos destacamento solução antes do uso. Solução II de colagenase é armazenada a-20 ° C por até 6 meses. | |
Tabela 1: Composições de médio de fibroblasto, meio de cultura MEF/MSC, hESC médio, médio de diferenciação do MSC, ODM e solução de desprendimento de osteoblastos.
| Nome de anticorpo | Diluição |
| NANOG | 1: 500 |
| OCT4 | 1: 300 |
| SSEA-4 PE-conjugados | 1:600 |
| TRI-1-81 | 1:600 |
| Burro de anti-cabra IgG | 1: 500 |
| Cabra de anti-coelho IgG | 1: 500 |
| CD105 | 1: 500 |
| CD44 | 1: 500 |
| CD73 | 1: 500 |
| CD166 | 1: 500 |
| CD24 | 1: 500 |
Tabela 2: Diluição anticorpo.
| Placa de cultura | Densidade de semeadura | Ensaio |
| Placa de 12 | células de4 0.67x10 por bem | Fosfatase alcalina, coloração (coloração de AP) |
| Vermelho de alizarina S coloração (coloração de ARS) | ||
| Placa de 6 | 2 x 104 células por poço | Deteção de RT-PCR |
| Preosteoblast marcadores: ALPL, COL1A1 | ||
| Maduras marcadores de osteoblastos: PTH1R, BGLAP | ||
| Prato de 100mm | 3 - 4.5x105 células por placa | Tumorigênese na vivo |
Tabela 3: Semeando a densidade do MSCs para diferenciação osteoblástica.
| Vírus Sendai Primers | |
| Alvo | Primeira demão moda |
| SeV | Para a frente: GGATCACTAGGTGATATCGAGC |
| Reverso: ACCAGACAAGAGTTTAAGAGATATGTATC | |
| KOS (KLF4/OCT4/SOX2) | Para a frente: ATGCACCGCTACGACGTGAGCGC |
| Reverso: ACCTTGACAATCCTGATGTGG | |
| KLF4 | Para a frente: TTCCTGCATGCCAGAGGAGCCC |
| Reverso: AATGTATCGAAGGTGCTCAA | |
| c-MYC | Para a frente: TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG |
| Reverso: TCCACATACAGTCCTGGATGATGATG | |
| Iniciadores de RT-PCR | |
| Alvo | Primeira demão moda |
| NANOG | Para a frente: TTTGTGGGCCTGAAGAAAACT |
| Reverso: AGGGCTGTCCTGAATAAGCAG | |
| SOX2 | Para a frente: AGAAGAGGAGAGAGAAAGAAAGGGAGAGA |
| Reverso: GAGAGAGGCAAACTGGAATCAGGATCAAA | |
| OCT4 | Para a frente: AACCTGGAGTTTGTGCCAGGGTTT |
| Reverso: TGAACTTCACCTTCCCTCCAACCA | |
| DPPA4 | Para a frente: GACCTCCACAGAGAAGTCGAG |
| Reverso: TGCCTTTTTCTTAGGGCAGAG | |
| REX1 | Para a frente: GCCTTATGTGATGGCTATGTGT |
| Reverso: ACCCCTTATGACGCATTCTATGT | |
| ALPL | Para a frente: GGGACTGGTACTCAGACAACG |
| Reverso: GTAGGCGATGTCCTTACAGCC | |
| COL1A1 | Para a frente: GTGCGATGACGTGATCTGTGA |
| Reverso: CGGTGGTTTCTTGGTCGGT | |
| PTH1R | Para a frente: AGTGCGAAAAACGGCTCAAG |
| Reverso: GATGCCTTATCTTTCCTGGGC | |
| BGLAP | Para a frente: GGCGCTACCTGTATCAATGG |
| Reverso: GGCGCTACCTGTATCAATGG |
Tabela 4: Informações de Primer.
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Discussion
Para conseguir uma eficiência mais elevada diferenciação MSC, vários aspectos são críticos. Um é a condição de cultura de iPSCs antes de iniciar a diferenciação de MSC. O protocolo apresentado no manuscrito baseia-se em anteriores estudos 9,17. iPSCs precisam ser cultivadas em MEFs pelo menos 2 semanas. Manutenção iPSCs em boas condições MEFs são críticas para as células anexar na placa de gelatina-revestido para diferenciação de MSC. Outro aspecto importante é a densidade de iPSCs em MEFs antes de diferenciação. 80 - confluência de 90% de iPSCs é preferida para iniciar a diferenciação de MSC. O crescimento excessivo de iPSCs prejudicará a sobrevivência da pilha durante o processo de diferenciação. O último ponto crítico é a densidade de semeadura, quando se inicia a diferenciação do MSC. Em nossas mãos, densidade de pilha alta promove iPSC apego à placa de gelatina-revestido. Uma 100mm prato iPSCs pode ser semeado em três poços da placa de 6. Iniciação de diferenciação MSC diretamente resuspending e chapeamento iPSCs num meio de diferenciação de MSC produz grandes tensões em iPSCs, portanto ocasionalmente resultando em morte celular severa após a semeadura. Alta densidade de iPSCs aumenta a taxa de sucesso de diferenciação de MSC.
Ao contrário da diferenciação da MSC, o processo de diferenciação osteoblástica é mais simples. Para obter resultados reprodutíveis diferenciação, certifique-se dos que números MSC iniciante são consistentes. Resultados da diferenciação osteoblástica da mesma linha celular podem variar de lote para lote, portanto, estabelecer uma diferenciação para linhas diferentes ao mesmo tempo dará mais resultados comparativos entre os grupos. O aumento dos números MSC encurtar o processo de diferenciação, indicado pela positiva AP e ARS coloração em um ponto do tempo anterior. Além disso, assegurar a mudança de meio ODM é tratada de uma forma suave e poderoso sistema de sucção de vácuo não é recomendado na fase final de diferenciação (dia 18 - 24), devido o potencial desprendimento dos osteoblastos agregados durante o processo de cultura.
Os osteoblastos diferenciados usados para o experimento de enxerto heterólogo em vivo são osteoblastos no ponto 14 dias de tempo de diferenciação. Os osteoblastos, o mais tardar dia 14 podem agregar e ser difícil dissociar devido os enormes acúmulos de colágenos e outros materiais de matriz óssea produzidos pelos osteoblastos. Para evitar a dificuldade de dissociação de osteoblastos, LFS MSCs pode ser semeado em 2 - 3 vezes maior densidade na etapa de iniciação da diferenciação osteoblástica, para facilitar a diferenciação de osteoblastos. Osteoblastos LFS MSC-derivado podem ser dissociados e recolhidos no dia 6-10 momento de diferenciação relativamente a tumorigênese na vivo do ensaio no dia 6 - ponto de tempo 7 diferenciação. O modelo de tumor de enxerto heterólogo LFS demonstra LFS MSC-derivado osteoblastos recapitulate em capacidade oncogenicidade vivo , que fornece uma plataforma alternativa para estudar LFS-associado osteossarcoma.
Em resumo, um modelo baseado em iPSC osteossarcoma LFS fornece um recurso valioso para a pesquisa de osteossarcoma. Além de osteossarcoma, pacientes LFS sofrem de vários outros tipos de tumor cerebral, câncer de mama e cancros como o sarcoma de tecidos moles. Portanto, modelos de doença baseada em iPSC LFS podem ser estendidos modelar outros LFS relacionados com neoplasias malignas. Combinando o LFS paciente-derivado iPSCs e engenharia p53 mutante (mutp53) hESCs18, modelo de doença LFS também tem grande valor em delinear a patogênese das neoplasias malignas mutp53 associados e desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas visando oncogênica p5316.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
R. z é suportado pelo UTHealth inovação para câncer prevenção investigação formação programa Pre-Doctoral (prevenção de câncer e Instituto de pesquisa de Texas conceder RP160015). J.T. é suportado pelo programa Ke Lin, da Universidade primeiro afiliado Hospital de Sun Yat-sen. D.-F.L. é o estudioso CPRIT na pesquisa do câncer e suportado pelo NIH caminho para independência prêmio R00 CA181496 e CPRIT RR160019 de prêmio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic ware | |||
| 100 mm Dish | Corning | 430107 | |
| 60 mm Dish | Corning | 430166 | |
| 6-well Plate | Falcon | 353046 | |
| 12-well Plate | Falcon | 353043 | |
| 48-well Plate | Falcon | 353078 | |
| 1 mL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-2721 | |
| 200 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-0706 | |
| 10 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-3700 | |
| 5 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
| 10 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
| 25 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
| 50 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
| 15 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
| Culture materials and Reagents | |||
| CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Invitrogen | A16517 | Commercial Sendai virus reprogramming kit |
| Corning hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Basement membrane matrix |
| CF1 MEFs, irradiated | ThermoFisher | A34180 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV | |
| αMEM | Corning | 10-022-CV | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | Commercial iPSC medium |
| KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
| FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher | A3181502 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| L-Glutamine Solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Human FGF-basic (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Recombinant Human PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
| β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | A4902 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
| StemMACS Passaging Solution XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | Commercial passaging solution |
| Accutatse Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution |
| Thiazovivin (ROCK Inhibitor) | Calbiochem | 420220 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Collagenase, Type II | ThermoFisher | 17101015 | |
| Human NANOG Antibody | R&D System | AF1997 | |
| OCT4 Antibody (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
| Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody | R&D System | FAB1435P | |
| Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen | DB Biosciences | 560123 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
| PE Mouse Anti-Human CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
| PE Mouse Anti-Human CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
| PE Mouse Anti-Human CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
| Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | |
| Chloroform | ThermoFisher | C298-500 | |
| 2-Propanol | ThermoFisher | A416-4 | |
| Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | ThermoFisher | BP28184 | |
| DNase I, RNase-free (1 U/µL) | ThermoFisher | EN0521 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891BUN | |
| iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
| Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free | Corning | 354262 | |
| 1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch | DB Biosciences | 309597 |
References
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