Aqui, apresentamos um protocolo para a geração de pluripotentes induzidas (iPSCs) as células-tronco do paciente fibroblastos derivada de síndrome de Li-Fraumeni (LFS), diferenciação de iPSCs através de células-tronco mesenquimais (MSCs) de osteoblastos e modelagem em vivo tumorigênese usando osteoblastos paciente-derivado do LFS.
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Artigo de método
Modelagem de osteossarcoma usando síndrome de Li-Fraumeni paciente-derivado induzido Pluripotent Stem Cells
Neste artigo
Resumo
Resumo
Síndrome de Li-Fraumeni (LFS) é uma desordem autossômica dominante cancro hereditário. Pacientes com LFS estão predispostos a um vários tipos de tumores, incluindo o osteossarcoma..--Dentre as mais frequentes malignidades não-hematológicas primárias na infância e adolescência. Portanto, LFS fornece um modelo ideal para estudar esta malignidade. Aproveitando-se das metodologias de iPSC, osteossarcoma LFS-associados pode ser modelada com sucesso por diferenciação LFS iPSCs paciente para células-tronco mesenquimais (MSCs) e depois para os osteoblastos, as células de origem dos osteossarcomas. Esses osteoblastos LFS recapitular Propriedades oncogênicas de osteossarcoma, fornecendo um sistema de modelo atraente para delinear a patogênese de osteossarcoma. Este manuscrito demonstra um protocolo para a geração de iPSCs de fibroblastos de pacientes LFS, diferenciação de iPSCs para MSCs, diferenciação de MSCs para osteoblastos e tumorigênese na vivo usando os osteoblastos LFS. Este modelo de doença de iPSC pode ser estendido para identificar potenciais biomarcadores ou alvos terapêuticos para LFS-associado osteossarcoma.
Introdução
Entre 2006 e 2007, vários resultados de avanço dos laboratórios de DRS Shinya Yamanaka e James A. Thomson levaram ao desenvolvimento de pluripotentes induzidas (iPSCs) as células-tronco1,2,3. Ao reprogramar células somáticas com fatores transcricionais definidos de forma iPSCs, pesquisadores foram capazes de gerar células com características chaves, ou seja, pluripotência e auto-renovação, que foi previamente pensada para apenas existem em células estaminais embrionárias humanas (hESCs). iPSCs pode ser gerado a partir de qualquer indivíduo ou o paciente e não precisava ser de....
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Protocolo
Este trabalho foi aprovado pela The University of Texas Health Science Center, em Houston (UTHealth) Comissão de bem-estar Animal. Os experimentos são realizados em estrita conformidade com as normas estabelecidas pelo centro de UTHealth para laboratório Animal medicina & conta (CLAMC) que é credenciado pela Associação Americana para o cuidado de Animal de laboratório (AAALAC International). Os seres humanos neste estudo enquadram cenário um ("não humano sujeitos Research") conforme definido pela documentação do NIH SF424. Portanto, não precisa qualquer aprovação pelo Comitê de ética de pesquisa humana UTHealth.
1. geração de iPSCs LFS (
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Resultados
Este protocolo apresenta os procedimentos, incluindo geração de iPSC LFS, diferenciação MSC, diferenciação osteoblástica e na vivo o ensaio de tumorigênese usando LFS MSC-derivado de osteoblastos.
Esquema para a geração de iPSCs LFS de fibroblastos usando um vírus de Sendai comercialmente disponível kit de reprogramação é mostrada na figura 1A. Baseados em vírus Sendai entrega dos Yamanaka .......
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Discussão
Para conseguir uma eficiência mais elevada diferenciação MSC, vários aspectos são críticos. Um é a condição de cultura de iPSCs antes de iniciar a diferenciação de MSC. O protocolo apresentado no manuscrito baseia-se em anteriores estudos 9,17. iPSCs precisam ser cultivadas em MEFs pelo menos 2 semanas. Manutenção iPSCs em boas condições MEFs são críticas para as células anexar na placa de gelatina-revestido para diferenciação de MSC. Outro aspecto importante é a.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
R. z é suportado pelo UTHealth inovação para câncer prevenção investigação formação programa Pre-Doctoral (prevenção de câncer e Instituto de pesquisa de Texas conceder RP160015). J.T. é suportado pelo programa Ke Lin, da Universidade primeiro afiliado Hospital de Sun Yat-sen. D.-F.L. é o estudioso CPRIT na pesquisa do câncer e suportado pelo NIH caminho para independência prêmio R00 CA181496 e CPRIT RR160019 de prêmio.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Utensílios de plástico | |||
| 100 mm Prato | Corning | 430107 | |
| 60 mm Prato | Corning | 430166 | |
| Prato Falcão de 6 poços | 353046 | ||
| Falcão | de 12 poços | 353043 | |
| Falcão | de 48 poços | 353078 | |
| 1 mL Ponta de Pipeta | USA Scientific | 1111-2721 | |
| 200 µ L Ponta de Pipeta | USA Scientific | 1111-0706 | |
| 10 µ L Pipet Tip | USA Scientific | 1111-3700 | |
| Pipeta sorológica de 5 mL | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
| Pipeta sorológica de 10 mL | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
| Pipeta sorológica de 25 mL | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
| Tubo de 50 mL, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
| Tubo de 15 mL, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
| Materiais de cultura e reagentes | |||
| CytoTune- iPS 2.0 Kit de reprogramação Sendai | Invitrogen | A16517 | Kit comercial de reprogramação de vírus Sendai |
| Corning hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Matriz de membrana basal |
| CF1 MEFs, irradiado | ThermoFisher | A34180 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV& | |
| alpha; MEM | Corning | 10-022-CV | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | Commercial iPSC medium |
| KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
| FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher | A3181502 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| MEM Aminoácidos Não Essenciais | Corning | 25-025-CI | |
| Solução de L-Glutamina | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 2-Mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Humano FGF-básico (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Humano Recombinante PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
| β-Glicerofosfato | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| Dexametasona | Sigma-Aldrich | A4902 | |
| Ácido Ascórbico | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Solução | Corning | 21-031-CV | |
| StemMACS XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | Solução de desprendimento de |
| comercial Accutatse Corning | 25-058-CI | Solução de desprendimento de células | |
| Tiazovavina (Inibidor de ROCK) | Calbiochem | 420220 | |
| 0.25% Solução de tripsina-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Colgenase, Tipo II | ThermoFisher | 17101015 | |
| Anticorpo NANOG Humano | R& D System | AF1997 | |
| OCT4 Anticorpo (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
| Humano/Camundongo SSEA-4 PE-conjugado Anticorpo | & D System | FAB1435P | |
| Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen | DB Biosciences | 560123 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
| PE Mouse Anti-Human CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
| FITC Mouse Anti-Humano CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
| PE Mouse Anti-Humano CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
| PE Mouse Anti-Humano CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
| FITC Mouse Anti-Humano CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
| Soro de Burro | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Soro de Cabra | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Kit de Coloração de Fosfatase Alcalina II | Stemgent | 00-0055 | |
| Vermelho de Alizarina S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Reagente TRIzol | ThermoFisher | 15596018 | |
| Clorofórmio | ThermoFisher | C298-500 | |
| 2-Propanol | ThermoFisher | A416-4 | |
| Etanol, Absoluto, Grau de Biologia Molecular | ThermoFisher | BP28184 | |
| DNase I, livre de RNase (1 U/µ L) | ThermoFisher | EN0521 | |
| Kit de Síntese de cDNA iScript | BioRad | 1708891BUN | |
| iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
| Matriz Matrigel Alta Concentração (HC), Livre de Fenol-Vermelho | Corning | 354262 | |
| Seringa de Ponta Deslizante de 1 mL, Calibre 26 x 5/8 Polegada | DB Biosciences | 309597 |
Referências
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult h....
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Reimpressões e permissões
