利用石墨烯液体池透射电子显微技术研究 原位 纳米晶体刻蚀

摘要

石墨烯液体池电子显微技术可用于在液体环境中以比其他液体池电子显微技术更高的空间分辨率观察纳米晶体的动力学行为。利用石墨烯液体池透射电子显微镜对预先制备的纳米晶体进行刻蚀并追踪其形貌变化，可获得有关纳米颗粒转化的重要机理信息。

摘要

石墨烯液体池电子显微技术能够实现在液体环境中实时观察纳米尺度的化学转化与动态过程。本文以金纳米晶体刻蚀的石墨烯液体池透射电子显微镜（TEM）实验为例，描述了石墨烯液体池的制备流程。制备石墨烯液体池的方案包括：在镀金的带孔碳膜TEM载网上覆盖化学气相沉积法生长的石墨烯，然后利用这些石墨烯包覆的载网将液体封装于两层石墨烯表面之间。含有目标纳米材料的这些液体微腔可在电子显微镜下成像，从而观察纳米尺度过程的动态变化，本例中即为金纳米棒的氧化刻蚀过程。通过调控电子束剂量率——该参数可调节液体池中刻蚀物种的生成——可以更深入地理解原子如何从纳米晶体中被移除并形成不同晶面和形貌的基本机制。石墨烯液体池TEM技术具有空间分辨率高、与传统TEM样品 holder 兼容以及研究团队启动成本低等优势。当前的局限性包括样品制备较为精细、缺乏液体流动能力，以及依赖电子束诱导产生的辐射分解产物来驱动反应。随着进一步的发展与控制，石墨烯液体池有望成为纳米材料与生物学研究中的普遍技术，目前已广泛用于在单颗粒水平上研究纳米材料在液体环境中生长、刻蚀和自组装过程的机制。

引言

可控地合成纳米晶体¹并将纳米颗粒组装成更大的结构^2,3，需要深入理解原子和纳米颗粒之间相互作用与结合的基本机制。理想情况下，对这些纳米尺度过程的研究应在其天然的液体环境中进行，并具备足以观察目标现象的相应空间分辨率。然而，由于这些系统作用的尺度在纳米级别，上述要求带来了巨大挑战。研究人员长期以来希望利用电子显微镜的空间分辨率来成像这些过程，但电子显微镜柱内的高真空环境要求对液体溶液进行封装⁴。一些早期的液体池电子显微镜实验将液体封装在两片氮化硅膜之间^5,6,7,8，该方法如今已发展成为一种商业化的技术，用于研究动态的纳米尺度过程。

市售的氮化硅液体池透射电子显微镜（TEM）样品杆已具备足够的分辨率，可用于观察和理解多种有趣的纳米尺度现象^{9,10,11,12,13,14,15,16}。部分商用液体池TEM样品杆还具备加热、液体流动和电学连接等附加功能，进一步拓展了可研究的纳米尺度过程范围。然而，尽管具备上述功能，商用系统并未针对实现最高空间分辨率进行优化。对于需要更高空间分辨率的研究人员而言，减小窗口厚度和液体层厚度是降低电子束散射、提高分辨率的两种可行途径¹⁷。一些使用氮化硅液体池的研究团队自行制备窗口，从而更精确地控制窗口和液体层的厚度¹⁸。这些自制液体池因散射更少，已实现更高空间分辨率的电子显微镜观测，包括原子级分辨率的研究^19,20,21。

由于封装材料的厚度是影响液体池实验空间分辨率的不利因素之一，原子级薄且低原子序数（low-Z）的材料（如石墨烯）是理想的封装材料^22,23石墨烯片层仍具有足够的强度，以保护液体腔室免受柱状压差的影响。此外，这些石墨烯液体腔室通常包含更薄的液层，进一步提高了可实现的空间分辨率。利用石墨烯液体腔室，已研究了多种有趣的纳米尺度过程，包括追踪纳米颗粒晶面轨迹以及以原子分辨率研究纳米颗粒动力学。^{23,24,25,26,27}石墨烯液体池技术的一个意外优势在于，无需购买不同的透射电子显微镜（TEM）样品杆或进行专门的氮化硅加工，即可实现高空间分辨率。使用氮化硅液体池实现高分辨率的实验通常需要由重原子组成的大尺寸纳米颗粒，而石墨烯液体池所获得的分辨率则能够对小于2 nm的纳米颗粒实现原子级分辨率。²⁵此外，由于石墨烯具有柔性的封装特性，石墨烯液体池为利用电子显微镜研究生物样品开辟了新的机会^28,29 以及石墨烯减轻电子束部分损伤效应的能力³⁰由于这些优势，一旦有更多研究人员深入了解该技术是否有助于其研究以及如何应用该技术，石墨烯液体池电子显微技术有望成为纳米科学领域的一项标准技术。

化学、纳米材料、生物学及其他领域中希望实现空间分辨的科研人员 原位 采用石墨烯液体池电子显微镜技术可使这些转化过程受益。 原位 该方法对于需要在转变过程中进行可视化观察的非平衡过程尤为有价值。液相透射电子显微镜技术的一个显著缺点是，扰动性的电子束会引发辐射分解产物的生成。³¹，这可能会在敏感样品中引发不良变化。研究人员已开发出模型，试图量化束流驱动的化学反应^31,32，目前正在开发减轻这些影响的策略^30,32石墨烯液体池透射电子显微镜技术在制备上具有额外的挑战性，其样品通常较为脆弱且制备困难，尤其对于刚接触该技术的研究人员而言。本文旨在分享石墨烯液体池透射电子显微镜实验的具体操作细节图1），以观察纳米晶体单颗粒刻蚀的示例实验为例，旨在表明几乎所有具备电子显微镜条件的科研团队均可开展石墨烯液体池实验。本实验方案将涵盖载网的石墨烯包覆、液体池的构建、石墨烯液体池刻蚀实验中的透射电子显微镜（TEM）使用，以及图像分析技术。在液体池制备的关键步骤中，将重点讨论封装液滴的尺寸、液体溶液成分的审慎选择，以及仅使用直接转移法石墨烯的必要性，并提供额外建议，以避免重蹈先前研究者的覆辙。石墨烯液体池透射电镜技术是一种新兴的纳米尺度研究方法，本文将帮助新进入该领域的研究者快速掌握并应用该技术。

方案

1. 制备石墨烯包覆的透射电镜载网

1. 剪下一小块约 2 cm² 的预制石墨烯-铜复合材料（参见材料表），其尺寸应可覆盖 6 至 8 个透射电镜（TEM）载网。
   注意：使用 3–5 层石墨烯而非单层石墨烯，可在不损失分辨率的情况下更高效地封装液体 pockets。由于石墨烯是一种原子级厚度的低原子序数（low-Z）材料，石墨烯液体池的分辨率损失主要来源于液体层的厚度。
2. 用丙酮清洗石墨烯（图 2A）。
   注意：此步骤旨在去除沉积过程中残留在石墨烯表面的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）。若使用者确认其石墨烯表面洁净，则可省略此步骤。
   1. 将石墨烯-铜片放入玻璃培养皿中，并加入丙酮。
      注意：选用丙酮是因为 PMMA 可溶于丙酮。
   2. 将丙酮溶液轻轻加热（约 50 °C）5 分钟，期间定期轻轻摇动溶液。
      注意：需密切观察丙酮及温度，以防起火。此操作应在通风橱中进行。
   3. 用镊子将石墨烯-铜片从丙酮中取出，并更换为新的洁净丙酮。
      注意：操作时需小心，避免镊子刮擦或损坏石墨烯表面。
   4. 重复清洗过程共 3 次。
   5. 在进入下一步前，让石墨烯-铜片充分自然晾干。
3. 展平石墨烯-铜片以消除任何宏观褶皱（图 2B）。
   注意：此展平过程旨在确保穿孔支撑膜-TEM 载网（参见材料表）能够与石墨烯表面良好贴合。石墨烯-铜片上的凸起和折痕会妨碍良好接触。
   1. 取两片洁净的载玻片，在底片上放置一片折叠的擦拭纸（参见材料表）。将石墨烯-铜片置于擦拭纸上，最后盖上第二片载玻片。
      注意：应将石墨烯-铜片的石墨烯面朝上（接触载玻片），以避免组织擦拭纸刮伤石墨烯。折叠的擦拭纸用于逐步压出褶皱，并防止产生新的折痕。
   2. 按压上层载玻片，逐步展平石墨烯-铜片中的褶皱。逐渐减少擦拭纸的折叠层数并重复按压过程。持续操作，直至最后在无擦拭纸的情况下将两片载玻片直接压合。
4. 将 TEM 载网放置在石墨烯-铜片上（图 2C）。
   1. 将带孔的非晶碳支撑膜-TEM 载网（参见材料表）放置在石墨烯上，确保非晶碳层与石墨烯接触。
      注意：使用镊子夹取载网时需小心，避免弯曲或变形。弯曲的载网无法与石墨烯良好结合。应夹取载网边缘以防止变形。此处使用金质 TEM 载网，以避免在后续去除石墨烯-铜片中铜层的步骤中发生载网腐蚀。
   2. 在载网上滴加几滴异丙醇。
      注意：若载网发生重叠，可在滴加异丙醇后用镊子尖端轻轻移动载网。操作时需避免损伤石墨烯表面。
   3. 干燥 2 小时以上，以确保载网与石墨烯充分结合。此干燥过程有助于带孔的非晶碳层与石墨烯实现更紧密的接触。
      注意：为检查载网是否已牢固粘附于石墨烯，可轻轻夹起石墨烯-铜片并翻转。若载网未因重力脱落，则表明已良好结合。
5. 使用过硫酸钠溶液蚀刻铜层（图 2D）。
   1. 将 1 g 过硫酸钠溶于 10 mL 去离子水中，配制成溶液。
   2. 用镊子小心地将石墨烯-铜片放置于过硫酸钠溶液中，铜面朝下。使样品漂浮于溶液表面（图 2D）。
   3. 让样品在溶液中静置过夜。注意，随着铜层被蚀刻，溶液将变为蓝色；蚀刻完成后，石墨烯片下方不再可见铜层（图 2E）。
6. 清洗载网以去除残留的过硫酸钠。
   1. 将漂浮的载网从溶液中取出，转移至第二个培养皿中的洁净去离子水表面（过滤材料参见材料表）。
      注意：最简便的转移方法是使用载玻片捞起载网，再将其放入盛水的第二个培养皿中。部分载网在转移过程中可能沉至培养皿底部，这通常表明载网上的石墨烯已出现裂纹或损伤。
   2. 重复此清洗过程 3 次，以彻底去除石墨烯载网上残留的过硫酸钠。
   3. 用镊子夹起载网，将石墨烯面朝上放置于滤纸上，使其自然干燥。
      注意：此最后一次从水洗步骤中取出载网的操作可能较困难，因残留水分产生的毛细作用力常导致载网粘附于镊子上。

2. 制备液体池腔室

1. 取两个石墨烯包覆的透射电镜（TEM）载网，将石墨烯面朝上放置在玻璃载片上。使用小型外科手术刀片，切去其中一个石墨烯包覆TEM载网的边缘部分，切除面积约为载网总面积的1/4至1/8（图3A）。
   注意：切去一个载网的边缘被认为有助于使两个载网上的石墨烯更紧密接触，从而增强石墨烯-石墨烯相互作用，形成封闭的液滴微腔。
2. 准备待封装的溶液。
   注意：该溶液专用于纳米晶体刻蚀实验。
   1. 使用去离子水配制浓度为10–100 mM的Tris缓冲盐酸溶液。
      注意：我们发现，在制备水相金属纳米颗粒溶液时，使用Tris缓冲盐酸溶液可获得更高的稳定微腔形成成功率，尽管尚需进一步研究以明确其作用机制。在此情况下，使用Tris缓冲碱或不添加Tris缓冲液的体系，微腔形成的成功率均显著降低。每种溶剂和样品可能都需要优化条件，以在不干扰所研究化学过程的前提下形成稳定的微腔。文献简要调查显示，邻二氯苯/油胺（9:1）、²³ 0.5×Tris-硼酸-EDTA（TBE）加200 mM NaCl溶液、³³ 水相0.15 M NaCl溶液³⁰，以及本文所述的水相Tris缓冲盐酸体系均已被成功应用。
   2. 在去离子水中加入每毫升水含1.8 µL HCl的盐酸溶液，配制40 mM的FeCl₃溶液。
      注意：FeCl₃是本刻蚀实验中的刻蚀剂。其他实验可根据具体需求添加不同的溶液。
   3. 制备金纳米棒，并在清洗后对纳米棒样品进行浓缩^1,34。
   4. 将0.15 mL的0.01–0.1 mM Tris缓冲盐酸溶液、0.1 mL的40 mM FeCl₃盐酸溶液以及10 µL纳米棒混合。
3. 在未切割的石墨烯包覆TEM载网上滴加约0.5 µL待封装溶液。滴加时使用镊子夹住TEM载网边缘，防止毛细作用导致载网上翘（图3B）。
   注意：应尽量使液滴体积最小，并尽可能靠近载网中心位置。
4. 迅速而小心地将切角后的石墨烯包覆TEM载网覆盖在液滴上，目标是使上层载网平稳落在下层载网上，且无液体被挤出（图3C）。
   注意：预先将上层载网置于可自闭合的镊子中，可使此操作更快速简便。这可以说是液体池构建过程中最具挑战性的步骤，存在多种潜在失败情况。在放下上层载网的同时移除镊子时容易发生卡滞，导致镊子夹在两层载网之间。通常，先将上层TEM载网的一边轻轻放下，再逐步松开镊子，效果最佳。若观察到玻璃载片上有液体渗出，则表明微腔可能未成功密封。
5. 静置5分钟，使石墨烯液体池微腔形成。
   注意：在微腔形成过程中可能发生少量液体蒸发，但一旦形成气密性密封，液体进一步损失的可能性极低。溶液中各组分的相对浓度应保持恒定。
6. 将样品转移至透射电镜（TEM）进行成像。
   注意：不同研究人员预留的密封时间有所不同。对于刻蚀实验，应尽量缩短液体池制备后至送入TEM之间的时间，以避免发生预刻蚀。

3. 加载与成像石墨烯液体池

注意：透射电子显微镜的操作遵循用户手册中的标准流程。每台透射电子显微镜的校准流程可能有所不同。

1. 将石墨烯液体池放入传统的透射电子显微镜（TEM）单倾转样品杆中（图4）。
   注意：也可使用其他标准样品杆，如双倾转样品杆或加热样品杆。使用螺钉式结构固定TEM载网的样品杆可能会施加剪切力，从而破坏石墨烯液体池。
2. 将TEM样品杆装入TEM镜筒中。
   注意：由于石墨烯液体池所含液体体积极小，且无储液结构、仅形成独立的微腔，因此无需像氮化硅液体池实验那样严格检测是否泄漏。即使某个石墨烯液体池微腔破裂，也只会释放极少量液体，不足以破坏TEM的真空系统。
3. 利用样品中的纳米颗粒和非晶碳对TEM电子束进行正确对准（包括电子枪倾斜、聚光镜光阑对中和聚光镜像散调节），并对图像进行优化（Z轴高度调节、物镜像散调节、旋转中心对准，以及如适用时的像差校正器调谐）。然后将样品杆移出电子束路径，并校准电子束剂量率。
   1. 在开始校准前至少提前20分钟开启TEM灯丝，以确保其稳定，从而获得可重复的剂量率；具体等待时间可能因TEM系统和电子枪类型而异。
      注意：电子显微学研究人员通常使用“剂量率”一词表示单位时间单位面积上入射的电子数（e^-/Ųs）。而在辐射化学领域，该参数被称为“通量密度”，而“剂量率”则定义为单位时间单位面积上吸收的能量。由于在液体池中复杂的几何结构下难以准确计算样品吸收的能量，且为了与TEM研究领域保持一致，本文采用“剂量率”表示单位时间单位面积上的电子数。
   2. 使用观察屏幕将电子束汇聚至实验所需最集中的状态（即最高剂量率）（图5A），读取并记录此时聚光镜的电流值。
      注意：在步骤3.3.2至3.3.5中，编写了一个自定义的DigitalMicrograph脚本，用于控制TEM的聚光镜系统，以校准第二聚光镜（C2）电流与实际电子剂量率之间的关系。这使得研究人员能够在实验过程中可重复地将电子剂量率设定为任意所需值。
   3. 使用观察屏幕将电子束扩展至实验所需最发散的状态（即最低剂量率）（图5B），读取并记录此时聚光镜的电流值。
   4. 将聚光镜电流范围划分为10个等间距的数值，并使用CCD相机对每个电流值采集图像。
   5. 根据CCD灵敏度和放大倍数校准结果，将CCD计数值转换为对应的剂量率。
   6. 利用不同聚光镜电流下的电子通量数据绘制校准曲线，并在后续实验中使用该曲线精确控制电子束通量至目标值。
   7. 将样品重新插入电子束路径中。
4. 在保持低剂量率（通常约为20 e^-/Ųs）的同时，开始在液体微腔中寻找纳米颗粒。
   注意：在搜索纳米颗粒时保持低剂量率可防止纳米颗粒发生刻蚀。
5. 当在液体微腔中发现纳米颗粒后，在维持低剂量率的条件下精细调节该纳米颗粒的焦距。
   注意：判断纳米颗粒是否位于液体微腔中可能存在困难，但若观察到气泡或颗粒运动，通常是存在稳定液体微腔的良好迹象。有时微腔内的物质并非液体，而是类似高度浓缩凝胶的状态，其中气泡移动极为缓慢。这种情况可能是由于石墨烯密封不严或出现裂纹导致液体蒸发所致。无运动的凝胶态与含有快速移动并不断改变形状气泡的液态环境较易区分。在形成优质液体池微腔的过程中可能会发生一定程度的蒸发，但反应物之间的相对浓度保持不变。
6. 使用校准曲线（参见步骤3.3）设定聚光镜电流，以达到所需的剂量率（图5D）。
   注意：使用实验室自编脚本设定聚光镜电流及图像采集参数。
7. 开始采集一系列TEM图像的时间序列，并将剂量率和时间戳等元数据嵌入图像文件中。
8. 当纳米颗粒完成刻蚀后，扩展电子束并继续在液体微腔中寻找其他纳米颗粒。
9. 当已收集足够数量的纳米颗粒刻蚀视频后，按照标准TEM操作流程将样品杆从TEM中取出，并将石墨烯液体池从样品杆中取出。
   注意：一次典型的成像会话持续约2–3小时，通常采集约30段视频。可用数据的视频数量取决于微腔质量及刻蚀实验类型。

4. 使用计算软件对透射电子显微镜视频进行图像分析

注意：由于透射电子显微镜（TEM）视频是三维结构的二维投影，因此需要进行仔细的图像分析，以提取刻蚀速率或形状变化信息。

1. 使用 ImageJ 将原始 DM3 视频文件转换为 avi 格式，并将 avi 视频导入计算软件（参见材料表）。
2. 分析视频中每一帧的每个纳米棒。
   1. 通过图像阈值分割确定纳米棒的轮廓（图7A）。
      注：金属纳米颗粒的高对比度使图像分析更为简便。对于对比度较低的体系，在阈值分割前可能需要额外的滤波处理。
   2. 根据纳米棒的轮廓，确定最接近拟合椭圆的长轴和短轴（图7B）。
      注：内置图像分析软件在确定长轴和短轴时默认形状为椭圆。对于并非椭圆形状的纳米棒，这些数值不应用于纳米颗粒的尺寸测量。
   3. 利用长轴将纳米棒轮廓切割为两半（图7C）。
   4. 对每一半轮廓，通过将其绕长轴旋转一周，计算所形成立体的体积和表面积。
      注：该微积分方法有时称为“圆环法”。此分析方法仅在纳米棒沿长轴对称时适用。通过比较两半的体积和表面积，可初步验证纳米棒是否真正具备旋转对称性。
3. 提取视频每一帧中纳米棒的体积和表面积后，汇总并解读数据。
   注：该轮廓分析方法也可用于具有明确形貌的纳米晶体晶面分析。

结果

在电子束剂量率为 800 e^-/Ųs 的条件下，对纳米棒进行刻蚀的代表性视频帧如图6所示。在开始氧化刻蚀前，该过程需要约 20 秒的电子束照射。一旦纳米棒开始刻蚀，其原子去除速率保持稳定，同时纳米棒的长径比也保持恒定。在视频记录过程中，纳米棒通常没有明显的移动，这与此前使用类似尺寸纳米颗粒的液相透射电镜研究结果一致²⁴。由于纳米颗粒移动不明显，气泡的生成和运动通常是判断纳米颗粒是否处于液体区域的最佳依据。当纳米棒尺寸变小时，开始出现旋转并进出焦平面，从而证实其处于液体环境中。

石墨烯液体池最常见的失效原因是无法封装稳定的液体区域。有时这会导致完全干燥的区域，表现为无气泡、无纳米颗粒运动或尺寸变化。此外，某些区域可能初始时含有液体和气泡，但在纳米颗粒完全蚀刻之前便已干燥。通常情况下，一个性能良好的液体池中，每个液体区域在蚀刻剂量率下可稳定维持约2-3分钟，而区域干燥问题通常仅在大尺寸纳米颗粒或缓慢蚀刻过程中成为限制因素。有时，液体可能从区域中蒸发，留下高盐浓度的凝胶状溶液。这类凝胶在成像时通常易于识别，表现为溶液对比度高，气泡和颗粒运动极为缓慢。在这些凝胶状溶液中采集的数据不可靠。

收集液相池透射电镜数据后，需对包含纳米颗粒刻蚀过程的视频进行分析。可进一步提取并评估其体积、表面积以及晶面（若适用）（图7）。干燥区域的一个表现为刻蚀速率随时间显著减缓，因此将体积随时间变化作图是检验液滴稳定性及数据可靠性的一种有效方法。其他非理想结果包括出现非对称刻蚀，表明液滴内成分不均一，以及氯化铁刻蚀剂中氢氧化铁物种的不期望析出。总体而言，成功构建石墨烯液相池最关键的要素是稳定的液体环境，从而在多个纳米颗粒和多个液滴中实现可重复的纳米晶体动力学行为。

图 1．石墨烯液体池透射电镜技术示意图。（A） 组装石墨烯液体池时，将一滴溶液置于带有石墨烯涂层的多孔碳透射电镜载网上，再将另一个带有石墨烯涂层的载网覆盖在液滴上方，形成一个封闭的液体腔室。请注意，此图未按比例绘制，液滴尺寸大约放大了33%。（B） 金纳米棒在液体腔室内进行透射电镜成像时的局部放大示意图。该示意图同样未按比例绘制。请点击此处查看该图的高清版本。

图2．制备石墨烯包覆透射电镜载网的流程(A) 用温热的丙酮清洗铜基底上的石墨烯片 (B) 通过将铜基底石墨烯夹在两片玻璃载片之间压平，以去除宏观褶皱。在石墨烯-铜片下方放置一片纸巾，以避免产生新的褶皱 (C) 将无定形多孔碳透射电镜载网放置在铜基底石墨烯上，使载网的无定形碳面与石墨烯接触 (D) 将铜/石墨烯/透射电镜载网漂浮于过硫酸钠刻蚀液上。此步骤可去除载网上的铜 (E) 刻蚀去除铜后得到的石墨烯包覆透射电镜载网。溶液呈蓝色，且石墨烯包覆载网上无残留铜。作为尺寸参考，玻璃培养皿的直径约为6 cm，玻璃载片尺寸为7.5 cm × 2.5 cm。请点击此处查看该图的放大版本。

图3．石墨烯液体池的制备流程（A） 将两个涂有石墨烯的透射电镜（TEM）载网置于载玻片上，其中一个载网的边缘已被切除。用于切割载网的外科手术刀片位于图像右上方。（B） 在涂有石墨烯的载网上滴加封装溶液。上方载网上的液滴尺寸合适，并在石墨烯表面形成了良好的液滴凸面；而下方载网上的液滴已穿透石墨烯，可能是由于石墨烯存在裂纹所致。（C） 将第二个涂有石墨烯的载网覆盖在已加液滴的第一个载网上。该石墨烯液体池现已准备就绪，可装入透射电镜进行观察。作为尺寸参考，载玻片尺寸为7.5 cm × 2.5 cm。请点击此处查看该图的放大版本。

图4．将石墨烯液体池装入标准单倾转透射电镜样品杆。 石墨烯液体池可像普通透射电镜载网一样装入标准单倾转透射电镜样品杆中。作为尺寸参考，透射电镜载网的直径为3 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 5．透射电子显微镜（TEM）电子束控制。（A） 使用荧光屏观察用于剂量率校准的聚焦电子束。（B） 使用荧光屏观察用于剂量率校准的扩展电子束。由于单位面积单位时间内的电子数量减少，强度随之降低，因此电子束非常微弱。（C） 电子束剂量率与聚光镜电流之间的校准曲线。该校准曲线用于在成像过程中控制电子束的剂量率。（D） 在石墨烯液体池中采集纳米颗粒透射电子显微镜视频时所使用的参数。每个参数的具体数值可能根据被成像材料和所需分辨率的不同而有所调整。请点击此处查看该图的放大版本。

图 6。金纳米棒在石墨烯液体池腔室中的刻蚀过程。 代表性透射电子显微镜视频帧，显示金纳米棒在800 e^-/Ųs的剂量率下发生刻蚀。在经历一段无明显刻蚀的初始阶段后，纳米棒以恒定速率持续刻蚀。请点击此处查看该图的高清版本。

图7. 视频帧分析方法（A） 使用图像分析软件中的阈值分割法勾勒出纳米棒的轮廓（参见材料表）。该方法可将纳米颗粒与背景分离，并为定量分析提供形状信息。（B） 确定纳米棒的长轴和短轴。（C） 沿长轴将二维轮廓切分为两半，并提取每一半轮廓。利用这些轮廓，通过绕x轴旋转重建三维形状。请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

石墨烯液体池电子显微技术能够以高空间分辨率提供有关纳米晶体生长与刻蚀的机理信息，但由于制备石墨烯液体池过程复杂且操作精细，该技术需要极为细致的操作才能获得可用的数据。即使经过大量练习，所制备的液体池中仅有约一半到四分之一能够成功封装液体溶液。形成液体池的关键步骤是将第二片载网放置在液滴上方。常见错误包括镊子卡在两片载网之间、第二片载网放置过于偏离中心，以及初始液滴体积过大。由于石墨烯液体池的组装过程极为精细，且需要良好的手部操作技能，通常需要多次练习才能成功制备出液体腔室。鉴于石墨烯镀膜透射电镜载网成本较高，强烈建议初次使用石墨烯液体池的研究人员先在传统的铜质非晶碳透射电镜载网上练习液体池制备流程，以节省费用。

确定液体池失效的原因可能具有挑战性，因为研究人员通常要等到最终对样品成像时才能判断每个步骤是否成功，而诸如划伤石墨烯等错误可能未被察觉。最容易识别的错误是组装不当，因为研究人员会立即观察到液体从石墨烯液体池中泄漏。在铜网格上制备石墨烯时出现的问题（例如石墨烯开裂）则更难定位。石墨烯的质量可在涂覆透射电镜（TEM）网格前后通过拉曼光谱进行检测，但通常在测试后石墨烯便无法继续使用。此外，必须使用直接转移法获得的石墨烯，因为需要将两层石墨烯的洁净表面贴合，才能通过范德华力有效形成密封。若采用聚合物转移方法制备石墨烯涂层网格，可能会在石墨烯预期结合的一侧残留聚合物。如果按照正确的操作流程并使用合适的TEM网格，石墨烯液体池实验失败通常归因于在组装和制备过程中对石墨烯和网格的不当操作。

石墨烯液体池透射电子显微镜（TEM）通过采用更薄的封装材料，改进了现有的液体池TEM技术，该材料可兼容任何传统的TEM样品杆，使得高分辨率成像及晶面轨迹追踪实验变得更加容易。与商用氮化硅薄膜液体池的分辨率相比，在石墨烯液体池中通过刻蚀纳米晶体所能获得的大量晶面信息和动力学信息在氮化硅液体池中将会丢失。石墨烯液体池TEM实验还可直接在现有的单倾TEM样品杆上进行，无需购置昂贵的专用样品杆。此外，由于石墨烯液体池可适配任何支持标准TEM网格样品的样品杆，因此可在多种先进功能的样品杆（如加热、双倾、冷却、冷冻、阴极荧光样品杆）中开展液体池实验，而目前尚无适用于这些设备的氮化硅液体池设计。另外，即使石墨烯液体池中的液体囊破裂，也不会像其他液体池TEM技术那样存在破坏TEM镜筒真空的风险。尽管目前石墨烯液体池技术尚未在纳米晶体研究领域广泛应用，但凭借其操作简便性和优异的空间分辨率，未来有望得到更广泛的采用。

尽管具有诸多优势，石墨烯液体池透射电子显微镜（TEM）在可进行的实验类型方面仍存在一定的局限性。由于液体会在形成液滴小囊时发生部分蒸发，因此很难精确确定溶液中物种的浓度，即使不考虑电子束的影响也是如此。此外，石墨烯液体池中的小囊在尺寸、高度和分布上具有随机性，相比之下，氮化硅流动池则具有更可量化的辐照前浓度以及大面积、均匀的液体层。如本研究所述，使用石墨烯液体池在TEM中仅能观察预先封装的样品，无法引入其他溶液以触发化学反应。电子束与液体相互作用产生的辐射分解产物是唯一可用于启动反应的触发因素。尽管尚未被证实，但理论上可通过标准加热台在石墨烯液体池中引发热驱动过程。目前，电子束诱导的辐射分解效应仍未被完全理解，且难以控制。研究人员已建立了动力学模型，用于确定电子束作用后液体池小囊内的成分^31,32，但这些模型的准确性受限于模型中所包含反应的数量，以及因液体干燥导致的未知浓度变化。对于初始小囊内容物较为复杂、包含多种反应物种（如FeCl₃、Tris缓冲液，甚至石墨烯³⁰）的情况，使用动力学模型进行全面解析尤为困难。液体池电子显微技术的另一个缺点是，难以表征动态过程中形成的晶体的化学组成。例如，在多组分体系的生长实验中，若新生的纳米晶体为非晶态或未处于带轴方向，则可能无法分辨正在生长的具体物相或物种。这正是为何优先选择在已知带轴上、具有确定组成的预形成纳米晶体进行刻蚀实验的另一个原因。最后，目前仍存在一些争议认为，石墨烯液体池中由电子束诱导的反应并不能真实反映在烧瓶中进行的ex situ反应条件。

未来的石墨烯液体池实验将有助于缓解其中一些问题，同时利用透射电子显微镜（TEM）的新进展，进一步探究纳米晶体的内在奥秘。关联的非原位（ex situ）纳米晶体合成与刻蚀实验对于验证液体池TEM实验中观察到的机制至关重要。此外，研究人员已开始致力于在石墨烯液体池TEM中引入流动功能³⁵，并构建更可控的液体腔室³⁶，包括利用光刻制备的孔洞来形成石墨烯液体池阵列³⁷。电子显微镜分辨率和相机速度的进步将使石墨烯液体池能够更深入地研究纳米晶体转变过程中的原子级动力学行为。将少量液体包裹在石墨烯等原子级厚度材料中用于电子显微镜观察，具有广泛的应用前景，无疑将成为未来纳米科学研究中的常规手段。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-丙醇（异丙醇）	Sigma Aldrich	190764-4L
丙酮	Fisher Chemical	A949-4 HPLC 级
FeCl3	Sigma Aldrich	44944-250g
金质 Quantifoil 无定形碳透射电镜载网	SPI Supplies	4230G-XA	300 目金网，R1.2/1.3 —— 通常长期缺货
石墨烯	ACS Materials	GnVCu3~5L-4x2in	我们特别订制单面石墨烯产品。双面产品的货号为 CVCU3022。通常我们使用 3–5 层石墨烯制备石墨烯液体池。  如果研究人员需要单层石墨烯用于其液体池，我们最近一直在使用 Grolltex
加热板	IKA	C-MAG HS 7 数字型
盐酸	Fisher Chemical	7647-01-0
Kimwipe 擦镜纸	Kimberly-Clark	34120
Matlab	Mathworks
Millipore 水过滤系统	Millipore	F4NA85846D
过硫酸钠	Sigma Aldrich	71890-500g
外科手术刀片	Swann-Morton	No. 6
透射电子显微镜（TEM）	FEI	Tecnai T20 S-Twin	透射电镜需连接相机采集软件，以便进行剂量率校准程序。
用于原位数据采集的 TEM 相机	Gatan	Orius SC200	定制的 DigitalMicrograph 脚本（自主编写），用于将 C2 透镜值校准至剂量率并采集原位数据集
TEM 单倾样品杆	FEI
三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐（Tris 缓冲液 HCl）	Fisher Biotech	1185-53-1
镊子	Excelta	7-SA