Summary
Presentamos un método automatizado para la reconstrucción tridimensional de lo elegans de Caenorhabditis del germline. Nuestro método determina el número y la posición de cada núcleo dentro de la línea germinal y análisis del germline proteínas distribución y estructura citoesquelética.
Abstract
La línea germinal de Caenorhabditis elegans (C. elegans) se utiliza para estudiar varios procesos biológicamente importantes, incluyendo dinámicas de desarrollo, apoptosis y el cromosoma de la célula de vástago. Mientras que la línea germinal es un excelente modelo, el análisis es a menudo dos dimensional debido al tiempo y mano de obra necesaria para el análisis tridimensional. Lecturas principales en estos estudios son la posición y número de núcleos y la distribución de la proteína dentro de la línea germinal. Aquí, presentamos un método para realizar el análisis automatizado de la línea germinal con microscopia confocal y los enfoques computacionales para determinar el número y posición de los núcleos en cada región de la línea germinal. Nuestro método analiza también la distribución de la proteína del germline que permite el examen tridimensional de expresión de proteínas en diferentes fondos genéticos. Además, nuestro estudio muestra las variaciones en la arquitectura citoesquelética en regiones distintas de la línea germinal que puede acomodar a los requisitos específicos de desarrollo espaciales. Por último, nuestro método permite conteo automatizado de los espermatozoides de la espermateca de cada línea germinal. Tomados en conjunto, nuestro método permite el análisis fenotípico rápido y reproducible de la línea germinal de C. elegans .
Introduction
La conservación de la señalización de las vías con los mamíferos hace C. elegans un excelente modelo para estudiar varios procesos biológicos1,2. En nuestro laboratorio utilizamos el germline de C. elegans para estudiar el desarrollo de la célula de vástago, apoptosis y expresión génica. Mientras que la línea germinal es una estructura tridimensional, muchos estudios son dos dimensiones debido a la naturaleza desperdiciadora de tiempo y mano de obra intensiva de análisis tridimensional. Es muy probable que el análisis de dos dimensiones pueden tergiversar en vivo eventos en la línea germinal. El hermafrodita adulto de C. elegans tiene dos brazos del germline, que alberga una célula somática punta distal (DTC) que mantiene las células de germen distales en un estado indiferenciado3,4. Estas células germinales empiezan a diferenciar como se alejan de la DTC, escapar de su influencia y se convierten en ovocitos y los espermatozoides que alcanzan el extremo proximal de la línea germinal. Durante este proceso, núcleos de la célula de germen sufren mitosis, antes de hacer la transición a la meiosis5,6. La producción de espermatozoides se completa con la etapa de larvas 4 (L4) del desarrollo, después de lo cual se producen óvulos durante la edad adulta. Los espermatozoides se almacenan en la espermateca donde fertilizan óvulos para generar embriones.
Hay múltiples factores genéticos y ambientales que pueden influir en el desarrollo del germline en C. elegans , dando por resultado cambios en el número de núcleos, número de eventos apoptóticos, dinámica del cromosoma y expresión de la proteína o localización7 ,8,9,10,11. El análisis de estos eventos requiere la identificación de cada etapa de diferenciación basada en la distribución y morfología nuclear. Para analizar con precisión estos parámetros manualmente con un tamaño de muestra grande es trabajosa y requiere mucho tiempo. Para eludir estos inconvenientes y la consistencia del análisis, hemos desarrollado un método automatizado para examen tridimensional del C. elegans del germline para conteo de núcleos, distribución de los núcleos, expresión de la proteína y citoesqueleto estructura. Mediante la combinación de microscopía confocal con representación tridimensional, nos genera parámetros de tamaño y forma para la identificación de cada etapa de la diferenciación de la célula de germen. Además, este método permite conteo de núcleos de la célula de germen y el esperma más puntuación del número de cromosomas en cada ovocito.
Una estructura crucial en la línea germinal es el citoesqueleto, que proporciona estabilidad al compartimiento del germline, SIDA citoplasmática y protección a germline núcleos12. Utilizando procesamiento computacional, se realizó la reconstrucción tridimensional del citoesqueleto del germline e identificaron citoesqueleto características dentro de la línea germinal. Aquí, describimos un protocolo paso a paso para ilustrar cómo computacional análisis combinado con proyección de imagen confocal permite análisis completo de la línea germinal de C. elegans .
Proponemos un método rápido para el análisis tridimensional de C. elegans del germline (figura 1). Utilizando el análisis tridimensional, es posible estudiar la cuenta de la distribución tridimensional de los núcleos de la línea germinal (figura 2 y figura 3), automatizado de células (figura 2), reconstrucción del citoesqueleto del germline ( Figura 3), la distribución de las proteínas (figura 4) y anotar el número de espermatozoides de la espermateca y cromosomas en los óvulos (figura 5). El método no permite fácil y precisa la cuantificación de la línea germinal sólo identifica fenotipos fisiológicamente relevantes.
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Protocol
1. preparación y la cría de gusano
Nota: Consulte la Tabla de materiales para cualquier información del producto.
- OP50 Escherichia coli cultura: cultura OP50 bacteria en caldo de lisogenia (LB) (triptona 1%, 0.5% levadura, 0,5% NaCl, pH 7.0) durante la noche a 37 ° C sin antibióticos.
- Semilla de 400 μL de bacterias OP50 a las placas de los medios de comunicación (NGM) crecimiento nematodos (1,5 g de NaCl, 8,5 g de agar, 1.25 g de peptona, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de colesterol 5 mg/mL en etanol, 1 mL de 1 M MgSO4 y 25 mL de buffer de4 M 1 KPO) y secar la bacteria durante 48 h.
- Recoger lombrices en las placas sembradas de NGM e incubar a 15 ° C o 20 ° C.
- Para el análisis de la línea germinal hermafrodita adulto, escoge bien alimentados gusanos de L4 al césped bacteriano e incubar durante una noche a 20 ° C.
- Para anotar el número de espermatozoides en hermafroditas, incubar L4 gusanos a 20 ° C por 12 h los gusanos hasta la muda L4, adulto. Para sincronizar los gusanos a la etapa de L4, recogiendo gusanos adultos con una gran cantidad de huevos en la solución de lejía (blanqueador en proporción 1:1 y 1 M NaOH) para preparar huevos. Permita que los huevos eclosionan y escoger L4 animales para el experimento.
- Preparar portaobjetos de teflón colocar 25 μl de solución de poli-l-lisina en la diapositiva y que se separa la solución, utilizando una pipeta. Después de quitar la poli-l-lisina exceso con toalla de papel, deje que los portaobjetos secar al aire e incubar los portaobjetos a 65 ° C durante 15-20 min.
2. del Germline disección y tinción6,13
- Punto 10 μl de tetramisole 0.01% (anestésico) sobre un cubreobjetos de 22 x 22 mm y escoger un día de edad gusanos adultos en él.
- Disecar el gusano en la cola que llega a ser sedado mediante una jeringa (5 mL) y una aguja (24 "x 1") y asegúrese de que la línea germinal no.
Nota: La disección debe realizarse antes de que el gusano se convierte en totalmente paralizado por lo que la presión negativa en el gusano y el movimiento de la lombriz ayuda a la expulsión de la línea germinal. De recuento de esperma, deben tomarse precauciones no se dañe la espermateca de la aguja durante la disección. Evite tocar la línea germinal con la aguja excepto el punto de disección después de la espermateca. Si hay rotura en el compartimiento de la línea germinal o cualquier descarga de la línea germinal se observa, la línea germinal no puede usarse para el análisis. - Coloque el cubreobjetos invertido en un portaobjetos recubierto de poli-l-lisina, manteniendo el germline disecado en la diapositiva.
- Quitar exceso de líquido bajo el cubreobjetos colocando una torre de papel en una esquina del cubreobjetos, entonces lugar la diapositiva en nitrógeno líquido para 1min rápidamente retire lo cubreobjetos utilizando una aguja con la germlines de la diapositiva.
- Transfiera los portaobjetos a metanol-20 ° C durante 30-60 s en una cámara, a continuación, incubar durante 30 min en solución de fijación recién preparada (1 x de tampón fosfato salino (PBS) que contiene 0,08 M HEPES pH 6.9, 1,6 mM de MgSO4, glicol de etileno 0,8 mM-bis(beta-aminoethyl éter)-N, N, N', N'-tetraacético ácido (EGTA) y el 3.7% paraformaldehído) a temperatura ambiente.
- Lavar los portaobjetos colocando en una cámara que contiene 1 x PBS, pH 7,4 con 0,1% Tween-20 durante 10 minutos Repita este paso una vez.
- Bloque de germlines con 30 μl de solución de bloqueo (30% de suero de cabra preparado por agregar 900 μl de suero de cabra en 1700 μl de agua destilada H2O y 300 μL de PBS x 10) en una cámara húmeda preparada mediante la colocación de toalla de papel húmeda en una caja de plástico a temperatura ambiente durante 30 minutos.
- Añadir 50 μl de solución de anticuerpo REC-8 preparado en 30% de suero de cabra en una relación 1:300 para cada muestra. Incubar durante una noche a 4° C.
- Lavar los portaobjetos colocando en una cámara que contiene 1 x PBS con un 0.1% Tween-20 durante 10 minutos repetir el paso una vez y quitar exceso de líquido mediante la colocación de una toalla de papel en la esquina de la diapositiva.
- Preparar solución de anticuerpo secundario diluyendo verde fluoróforo (488 nm longitud de onda emisión) anticuerpo secundario conjugado (1: 1000), phalloidin (mancha de actina, 1:4000) y DAPI (tinción de ADN, 1:4000) en el 30% de suero normal de cabra.
- Añadir 50 μl de solución de anticuerpo secundario a la diapositiva.
- Incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
- Lavar los portaobjetos dos veces colocando en una cámara que contiene 1 x PBS con un 0.1% Tween 20 durante 10 minutos Limpie el exceso de líquido.
- Añadir 30 μl de reactivo en la diapositiva de fijación y poner una de 12 mm2 x 1,5 μm cubreobjetos encima y secar los portaobjetos a 4 ° C durante la noche.
3. confocal microscopio
- Encienda el microscopio confocal láser, scanner resonancia y software del microscopio confocal. Coloque los portaobjetos con tinción germlines en el soporte de diapositivas sobre el objetivo X 63.
- Localice una línea germinal, foco en la parte superior de la línea germinal y márquela utilizando el software del microscopio confocal. Del mismo modo se centran en la parte inferior de la línea germinal y marcar para establecer el espesor total del germline.
- Imagen de la línea germinal todo definiendo el espesor de cada rebanada hasta 0.5 μm. marca la completa adquisición del germline y comienzo. Analizar cada rebanada 8 veces y promedio de los valores para mejorar la calidad de la imagen. El escáner de resonancia permite escaneo rápido para evitar la decoloración durante proyección de imagen. Si el microscopio no tiene un escáner de resonancia, reducir el número de exploraciones a cuatro para evitar el blanqueo.
4. post de análisis de núcleos de número y la distribución
Nota: Consulte la figura 1 complementaria para imágenes de los botones usados y herramientas de software.
- Importar la imagen a Imaris 8.4.1 o versiones posteriores del software.
- Definir región mitotic, zona de transición, región meiótica, región de ovocitos y espermateca de la línea germinal por identificar la morfología nuclear en cada región.
- Utilice el botón function superficial (figura suplementaria 1A) del software para seleccionar la región de interés.
- Cancelar el Asistente para la creación automática de superficie y dibujar manualmente la región de interés en el primer y último segmento de la imagen de la pila tridimensional.
- Haga clic en crear superficie.
Nota: El software desarrollará automáticamente las pilas entre la primera y la última pila. - Todos los canales excepto DAPI la máscara haciendo clic en botón de canal de máscara (Suplementario Figura 1B-C).
- Definir los parámetros de tamaño nuclear usando el botón spot (complementario de la figura 1A). Para la región de mitotic, definen un diámetro de 2 μm XY dejando diámetro Z indefinido. Para la zona de transición, definen un diámetro de 2 μm XY y Z diámetro como 1,5 μm. (suplementario Figura 1).
Nota: Resuelva los diámetros según la ampliación y las especificaciones del microscopio. El protocolo actual, el objetivo utilizado fue 63 X y extra 1,70 aumentos durante proyección de imagen. Si el objetivo cambia, por ejemplo 40 X, los diámetros deben modificarse en consecuencia. Solución de problemas debe realizarse con germlines de tipo salvaje para establecer los parámetros correctos. La región mitotic de un brazo del germline de tipo salvaje tiene aproximadamente 250 núcleos. El diámetro debe ser modificado para alcanzar este valor. Use al menos 15 germlines para determinar el valor óptimo para el diámetro. Un enfoque similar puede usarse para calibrar la región meiótica (600-700 núcleos) y zona de transición (núcleos de 150-170). - Límite de detección de puntos definiendo el umbral mínimo (suplementario Figura 1E). Uso DAPI teñido tipo salvaje germlines para establecer el umbral mínimo aumentando el umbral mínimo de representación tridimensional hasta que aparezca el primer lugar fuera de la línea germinal.
- Guardar la imagen y obtener el número de núcleos de la tabla generada automáticamente por el software. Exportar las imágenes como archivos TIF.
5. publicar imagen análisis de recuento de espermatozoides y el número de cromosomas
- Realizar representación tridimensional mediante la selección de la espermateca como la región de interés. Para detectar cada esperma, definir el diámetro del punto entre 0.75 - 1.0 μm para X y Y-eje, mientras que diámetro Z sigue siendo indefinido. Utilice el botón de función de los puntos como se muestra en la figura 1 complementaria.
- Restar el fondo marcando fondo resta caja y utilizando los valores de corrección de fondo calculados por el software (suplementario Figura 1).
Nota: Software Imaris recoge puntos de alta intensidad en primer lugar, por lo tanto el efecto de fondo es mínimo siempre y cuando no hay diferencias significativas entre la región de interés y el fondo. Un segundo método es definir manualmente la corrección de fondo, en su caso, los valores se pueden dar para el fondo. Corrección de fondo manual será apropiado si la intensidad de muestras independientes necesita comparación. - Ajustar el umbral de representación tridimensional para detectar todos de DAPI manchado de esperma en la espermateca (suplementario Figura 1E).
- Para contar los cromosomas, definir el diámetro del punto < 0.75 μm para X y Y-eje antes de desarrollar modelos tridimensionales.
- La imagen de guardar y exportar como archivo TIF.
6. Análisis de imagen para el citoesqueleto reconstrucción de la línea germinal de correos
- Identificar la región de interés en la línea germinal y enmascarar todos los canales excepto phalloidin haciendo clic en el botón máscara de canales .
- Definir un detalle superficial de 0.25 μm utilizando el botón de función superficie (suplementario Figura 1).
Nota: Esto significa que se mostrará cada 0.25 μm en modelos tridimensionales. Detalle superficial puede ser constante para cualquier región de la línea germinal donde se creará un modelo tridimensional de la superficie para cada 0.25 μm. Sin embargo, para la región de ovocitos, detalle superficial se puede aumentar a 0.35 - 0.5 μm debido la presencia de fibras de actina definidas en esta región. - Restar el fondo marcando fondo resta caja y utilizando los valores de corrección de fondo calculados por el software (suplementario Figura 1).
- Ajustar el umbral de representación tridimensional dependiendo de la estructura que requieren análisis (suplementario Figura 1E).
- Guardar la imagen tridimensional desarrollada y exportar como un archivo TIF.
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Representative Results
Figura 1 indica el tiempo requerido para el análisis tridimensional del germline. Hermafroditas de L4 se incubaron a 20 ° C fueron disecados para aislar germlines y teñidas con DAPI, phalloidin y anticuerpos contra las proteínas de la línea germinal. Germlines son imágenes usando microscopia confocal. Microscopía confocal y tinción requiere aproximadamente 24 h. análisis computacional para el germline completado requiere 10-15 minutos para contar el número y la posición de los núcleos, identificar la distribución de proteínas, analizar la estructura citoesquelética y puntuación de la número de espermatozoides. Análisis manual completa requiere más de 2 h por la línea germinal y es sujeto a la influencia del operador, por lo tanto, nuestro método automatizado de alto rendimiento reduce el tiempo de análisis y mejora la reproducibilidad.
Automatizado de núcleos que revela que un brazo del germline alberga aproximadamente 1.000-1.200 núcleos (figura 2C), correspondiente con manual publicado previamente anotando datos1. Para confirmar que la exactitud de la calificación, mutantes y diferentes condiciones son utilizados (figura 2D-G). Por ejemplo, comparamos la rnp-8(tm435), cpb-3(bt17)y gusanos mutantes glp-1(e2141) a los animales de tipo silvestre. Recuento automatizado reproduce la conocida reducción del número de núcleos en el cpb-3 y glp-1 mutante germlines14,15,16,17. También se observó una reducción severa en el número de núcleos en el mutante sensible a la temperatura de glp-1(e2141) cuando se incuban a 25 ° C. La distribución de los núcleos depende de la etapa de diferenciación. La región mitótica, que contiene aproximadamente 250 núcleos de tipo salvaje, es apretada con los núcleos en comparación con el resto de la línea germinal (figura 3)1. La distancia entre núcleos mitóticos es mínima y los núcleos se encuentran en toda la región mitotic. Sin embargo, mientras los núcleos se mueven del extremo distal, que aparecen más a la circunferencia de la línea germinal (figura 3). El cambio en la distribución se inicia en la zona de transición y termina como los núcleos entrar meiosis/paquiteno.
La línea germinal tiene estructuras citoesqueléticas específicas en las diferentes etapas de la diferenciación. Visualizamos la F-actina por la coloración de la línea germinal con phalloidin. La distribución de la F-actina de la distal al extremo proximal de la línea germinal era distinta en cada región (figura 3 y figura 5). En general, hay dos estructuras independientes que aparecen como un cilindro a cilindro. En la región de mitotic, actina interna aparece como una masa sólida con una forma específica (figura 3). Que la línea germinal llega a la zona de transición, la actina interna asume una estructura más cilíndrica y se convierte en un cilindro hueco que llega tardío paquiteno. La segunda capa de la actina cubre la capa interna que da forma a la línea germinal. Esta estructura de actinia 'cilindro a cilindro' desaparece hacia la región de ovocitos (figura 5). En la región de ovocitos, actina aparece como fibras gruesas. Los ovocitos están separados por un raquis de actina, aunque parece ser dinámica para permitir la circulación de los ovocitos a la espermateca. Por último, la actinia en la espermateca también forma paquetes gruesos de fibras de actina. Sin embargo, las fibras parecen ser embalado más cerca que en la región de ovocitos. La estructura citoesquelética parece complementar los patrones de distribución de los núcleos (figura 3). En la región de mitosis, los núcleos parecen colocarse alrededor de la estructura interna de la actina. Como llegar a meiosis/paquiteno, los núcleos se organizan entre los dos cilindros de actina dejando el centro de la línea germinal en su mayoría carente de núcleos (figura 3). Esto probablemente podría ayudar a citoplasmática ininterrumpida en la línea germinal. Germlines fueron teñidas con un anticuerpo contra la proteína REC-8 y analizados por microscopia confocal. REC-8 se distribuye homogéneamente alrededor de primeros núcleos de la línea germinal más tarde hendida y degradada durante meiosis18. Distribución en análisis transversal tridimensional de la línea germinal la REC-8 muestra la distribución de proteínas en la región mitótica (figura 4).
Representación tridimensional del extremo proximal de la línea germinal incluye la espermateca y distal a la espermateca primero tres ovocitos. Nuestro análisis reconoce un promedio de 151 esperma en cada espermateca (n = 18). Esto corresponde a la bibliografía, indicando la fiabilidad del método (figura 5F)19. Este análisis puede realizarse junto con citoesqueleto o estudios de distribución de la proteína. El genoma de C. elegans se distribuye entre seis cromosomas. En ovocitos de tipo salvaje plenamente desarrollada, estos cromosomas son visibles y se pueden contar. Esta separación de cromosomas puede utilizarse para el estudio de estabilidad del cromosoma u otros defectos asociados con el desarrollo del ovocito. Representación tridimensional, se puede visualizar el número de cromosomas, y si los cromosomas se separan correctamente, el número puede ser obtenidos exactamente (figura 5).
Figura 1 . Línea de tiempo para el análisis automatizado de. Comparación de tiempo entre el análisis manual y computacional de la línea germinal de C. elegans . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Distribución de núcleos en el germline. (A) DAPI había manchado del germline mostrando mitotic, transición y regiones paquitena/meiótica. (B) modelo tridimensional cómputo de la línea germinal. (C) anotar el número total de núcleos de germlines de tipo salvaje. (D-F) Anotar el número de núcleos en mitosis, transición y regiones meióticas del tipo salvaje, rnp-8, cpb-3y glp-1 mutante germlines. (G) comparación del número total de núcleos en el mutante de glp-1 a 20 ° C y 25 ° C. Barra de error representa el error estándar. Prueba de Student. n < 0.0001, ***n < 0.001, **n < 0.01, *n < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Estructura citoesquelética de la línea germinal. (A-B) Organización interna (rojo) del citoesqueleto de actina de la línea germinal en la región de mitotic. La actina interna tiene una estructura difusa en comparación con el exterior actina en la región de mitotic. (C-D) En la región de paquiteno, citoesqueleto asume una estructura cilíndrica formando dos cilindros entre los cuales se organizan los núcleos (azul). (E-F) Organización de núcleos de la línea germinal en las regiones de mitotic y paquiteno. La distribución de los núcleos es más hacia la circunferencia de la 'germtube' en la región de paquiteno en comparación con la región mitotic (verde) y media de la línea germinal se carente de núcleos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . REC-8 expresión en la región mitotic. (A) micrografía mostrando el extremo distal de una línea germinal REC-8-manchadas. (B-C) Representación tridimensional de REC-8 tinción (mostrado en azul) y la distribución de la proteína entre los núcleos mitóticos (verde). REC-8 tinción es menos abundante proximal a la región mitotic (señalada con puntos blancos que representan a los núcleos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . Estructura del germline en el extremo proximal. (A) la coloración de DAPI de la línea germinal en el extremo proximal. (B) tridimensional representación de DAPI coloración muestra semen en la espermateca (amarillo) y los cromosomas en los ovocitos (blanco). (C-E) Estructura tridimensional del citoesqueleto en el extremo proximal de la línea germinal. Roja marca el extremo proximal completo y verde marca la espermateca. Análisis seccional cruzada muestran que el citoesqueleto no sólo forma una estructura filamentosa de la actina en ovocitos, pero también se separa entre ovocitos. (F) gráfico que muestra el número de espermatozoides en cada espermateca y el promedio obtenido de espermateca múltiples (n = 18). Barra de error representa el error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 1 complementaria . Descripción de herramientas de software. (A) los puntos y superficies herramientas para la detección de núcleos y la coloración de la proteína. (B-C) La selección de la región tridimensional de interés utilizando la herramienta de la superficie. (D) definir el diámetro de XY, utilizando herramientas de puntos, para la detección de núcleos. Dependiendo de la región de interés y la coloración, puede utilizarse la corrección z diámetro y fondo. (E) mínimo y detección de umbral de intensidad máxima. Un enfoque similar puede utilizarse para la función de la superficie donde en lugar de definir el diámetro, y pueden definirse los detalles superficiales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El objetivo de este protocolo es mejorar la precisión y reducir el tiempo requerido para el análisis de la línea germinal. Después de la preparación estándar de germlines disecada, un modelo tridimensional de los núcleos de la línea germinal se prepara por procesamiento computacional. Permitiendo la observación de la distribución de los núcleos del germline en el espacio, representación tridimensional calcula el número de núcleos en regiones específicas de la línea germinal. El aspecto crítico de nuestro método es la definición exacta de los parámetros de tamaño y forma de los núcleos. Esto depende de la claridad de la coloración y el aumento utilizado para la imagen. Se confirmó la exactitud del método comparando publicado datos analizados manualmente1. Para confirmar aún más la precisión de nuestro método, había utilizado a mutantes múltiples bajo diferentes condiciones y confirmó los resultados con la literatura publicada. También confirmó la capacidad del método para detectar fenotipos sutiles y fuertes - mutantes cpb-3 y glp-1 , respectivamente. Además, este método muestra adaptabilidad a los cambios en los núcleos tamaño y forma dentro de la línea germinal o incluso entre cepas. Esta propiedad también permite la identificación y calificación de estructuras más pequeñas en la línea germinal como cromosomas y el espermatozoide. El método también permite más solución de problemas para los parámetros de tamaño y forma, si es necesario. Nuestro análisis fue capaz de aclarar la distribución de núcleos en el germline y demostró que núcleos de mitotic y regiones de paquiteno se organizan en patrones diferentes. Mediante la aplicación de renderizado tridimensional a REC-8 y la coloración de DAPI, también mostramos la distribución de REC-8 dentro de los núcleos de la región mitotic.
Representación tridimensional de la actina coloración permitió la examinación detallada de estructuras citoesqueléticas del germline. El germline parece tener dos estructuras separadas de la actina, aunque mantienen el contacto físico. Mientras que la reconstrucción del citoesqueleto para el germline todo es posible como una entidad única, los mejores resultados pueden obtenerse si las regiones de interés son pre-seleccion en mitosis, la transición y las regiones meióticas. El citoesqueleto del germline distal tiene una forma definida y se desarrolla en una estructura filamentosa en el extremo proximal. Nuestro protocolo, por tanto, permite la reconstrucción tridimensional del germline del citoesqueleto de actina por definir parámetros específicos para dar cabida a las diferencias en la distribución de la actina. El aspecto más crítico del análisis es la definición de los parámetros como el tamaño de los núcleos y requisito del detalle superficial. Reducir el tamaño de los núcleos por debajo del tamaño real riesgo de software para recoger manchas dentro de los núcleos como objetos separados. Del mismo modo, valores altos detalles superficiales dará lugar a la pérdida de estructuras tridimensionales exacta. El método propuesto se basa en la precisión de la disección y la calidad de la tinción del germline. Una línea germinal dañado puede conducir a la liberación de los núcleos de la línea germinal, causando numeración incorrecta. Alto fondo de tinción también hará que el conteo de núcleos imprecisos y la inadecuada representación tridimensional.
Nuestro método extiende anteriormente conocidos métodos automatizados de análisis de la línea germinal donde somos capaces de analizar el número de núcleos y la distribución/la expresión de proteínas del germline en el espacio con un único protocolo de20. En segundo lugar, nuestro método permite la puntuación de estructuras más pequeñas como los cromosomas dentro de la línea germinal. Segregación cromosómica es un aspecto importante de ovocitos desarrollo21. Con nuestro método, es posible detectar el número y posición de los cromosomas donde la distancia se puede definir por calibrar contra ovocitos de tipo salvaje. Cualquier mutación que afecta a la separación del cromosoma puede estudiarse utilizando esta herramienta. También, el método se puede ampliar para estudiar los cromosomas en embriones en fase de 2 células. El análisis computacional también proporciona al número de espermatozoides de la espermateca, número de cromosomas en un ovocito y del germline las estructuras citoesqueléticas. Tomados en conjunto, el método ofrece análisis completo de la línea germinal de C. elegans utiliza un protocolo simple y reducir considerablemente el tiempo de análisis. El método elimina la necesidad de múltiples herramientas para cada análisis (número de núcleos, distribución de proteínas y citoesqueleto estructura) y elimina el tiempo de codificación en cualquier software específico. Por último, este método puede ampliarse eficazmente a otros estudios de gusano incluyendo el análisis tridimensional de gusanos vivos sedados.
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Disclosures
Los autores no declaran conflicto de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a Monash Microimaging por su apoyo técnico. Algunas cepas fueron proporcionadas por el centro de genética de Caenorhabditis , que es financiado por los NIH oficina de programas de infraestructura de investigación (P40 OD010440). Este trabajo fue financiado por Monash University biomedicina descubrimiento beca, subvención del proyecto NHMRC (GNT1105374), NHMRC Senior Research Fellowship (GNT1137645) y beca de innovación veski: 23 VIF a Roger Pocock.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| OP50 Escherichia coli bacteria | Homemade | ||
| Nematode Growth Media (NGM) plates | Homemade | ||
| polyclonal rabbit anti-REC-8 | SDIX | 29470002 | |
| Alexa 488 conjugated antibody raised in goat | Thermofisher Scientific | A-21236 | |
| Cytoskeletal dye phalloidin | Thermofisher Scientific | A-12380 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | 62248 | |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P5899 | |
| Tetramisol | Sigma Aldrich | P5899 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| 1M HEPES buffer, pH 7.4 | Sigma Aldrich | G0887 | |
| 10X PBS pH 7.4 | Thermofisher Scientific | AM9625 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1389 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| 37% Paraformaldehyde solution | Merck Millipore | 1040031000 | |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Fluoroshield fixing reagent | Sigma Aldrich | F6182 | |
| Ethanol | Millipore | 1009832511 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| 20°C & 25°CIncubator | Any brand | ||
| Light microscope | Any brand | ||
| Confocal microscope | Any brand (Leica, Zeiss) | ||
| Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software. | Bitplane | ||
| Phospho buffered saline, pH 7.4 | Homemade | ||
| Teflon microscope slides | Tekdon | 941-322-8288 |
References
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