Análisis computacional de lo elegans de Caenorhabditis del Germline para estudiar la distribución de núcleos, proteínas y citoesqueleto

Resumen

Presentamos un método automatizado para la reconstrucción tridimensional de lo elegans de Caenorhabditis del germline. Nuestro método determina el número y la posición de cada núcleo dentro de la línea germinal y análisis del germline proteínas distribución y estructura citoesquelética.

Resumen

La línea germinal de Caenorhabditis elegans (C. elegans) se utiliza para estudiar varios procesos biológicamente importantes, incluyendo dinámicas de desarrollo, apoptosis y el cromosoma de la célula de vástago. Mientras que la línea germinal es un excelente modelo, el análisis es a menudo dos dimensional debido al tiempo y mano de obra necesaria para el análisis tridimensional. Lecturas principales en estos estudios son la posición y número de núcleos y la distribución de la proteína dentro de la línea germinal. Aquí, presentamos un método para realizar el análisis automatizado de la línea germinal con microscopia confocal y los enfoques computacionales para determinar el número y posición de los núcleos en cada región de la línea germinal. Nuestro método analiza también la distribución de la proteína del germline que permite el examen tridimensional de expresión de proteínas en diferentes fondos genéticos. Además, nuestro estudio muestra las variaciones en la arquitectura citoesquelética en regiones distintas de la línea germinal que puede acomodar a los requisitos específicos de desarrollo espaciales. Por último, nuestro método permite conteo automatizado de los espermatozoides de la espermateca de cada línea germinal. Tomados en conjunto, nuestro método permite el análisis fenotípico rápido y reproducible de la línea germinal de C. elegans .

Introducción

La conservación de la señalización de las vías con los mamíferos hace C. elegans un excelente modelo para estudiar varios procesos biológicos^1,2. En nuestro laboratorio utilizamos el germline de C. elegans para estudiar el desarrollo de la célula de vástago, apoptosis y expresión génica. Mientras que la línea germinal es una estructura tridimensional, muchos estudios son dos dimensiones debido a la naturaleza desperdiciadora de tiempo y mano de obra intensiva de análisis tridimensional. Es muy probable que el análisis de dos dimensiones pueden tergiversar en vivo eventos en la línea ....

Protocolo

1. preparación y la cría de gusano

Nota: Consulte la Tabla de materiales para cualquier información del producto.

1. OP50 Escherichia coli cultura: cultura OP50 bacteria en caldo de lisogenia (LB) (triptona 1%, 0.5% levadura, 0,5% NaCl, pH 7.0) durante la noche a 37 ° C sin antibióticos.
2. Semilla de 400 μL de bacterias OP50 a las placas de los medios de comunicación (NGM) crecimiento nematodos (1,5 g de NaCl, 8,5 g de agar, 1.25 g de peptona, 1 mL de 1 M CaCl₂, 1 mL de colesterol 5 mg/mL en etanol, 1 mL de 1 M MgSO₄ y 25 mL de buffer de₄ M 1 KPO) y secar la bacteria ....

Resultados

Figura 1 indica el tiempo requerido para el análisis tridimensional del germline. Hermafroditas de L4 se incubaron a 20 ° C fueron disecados para aislar germlines y teñidas con DAPI, phalloidin y anticuerpos contra las proteínas de la línea germinal. Germlines son imágenes usando microscopia confocal. Microscopía confocal y tinción requiere aproximadamente 24 h. análisis computacional para el germline completado requiere 10-15 minutos para contar el número y .......

Discusión

El objetivo de este protocolo es mejorar la precisión y reducir el tiempo requerido para el análisis de la línea germinal. Después de la preparación estándar de germlines disecada, un modelo tridimensional de los núcleos de la línea germinal se prepara por procesamiento computacional. Permitiendo la observación de la distribución de los núcleos del germline en el espacio, representación tridimensional calcula el número de núcleos en regiones específicas de la línea germinal. El aspecto crítico de nuestro método es la def.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
C. elegans cepas: tipo salvaje (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?( q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
OP50 Escherichia coli bacterias	caseras
de medios de crecimiento de nematodos (NGM) Conejo	casero
anti-REC-8	SDIX	29470002
Alexa 488 anticuerpo conjugado criado en cabra	Thermofisher Scientific	A-21236
Colorante citoesquelético faloidina	Thermofisher Scientific	A-12380
DAPI	Thermofisher Scientific	62248
Poli-L-lisina	Sigma Aldrich	P5899
Tetramisol	Sigma Aldrich	P5899
MgSO4	Sigma Aldrich	M7506
1M Tampón HEPES, pH 7.4	Sigma Aldrich	G0887
10X PBS pH 7.4	Thermofisher Scientific	AM9625
Tween-20	Sigma Aldrich	P1389
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
37% Solución de paraformaldehído	Merck Millipore	1040031000
Suero de cabra normal	Sigma Aldrich	G9023
Reactivo fijador Fluoroshield	Sigma Aldrich	F6182
Etanol	Millipore
Metanol	Sigma Aldrich	34860
20° C & 25° CIncubador	cualquier marca
Microscopio	cualquier marca
	Cualquier marca (Leica, Zeiss)
Ordenador equipado con Imaris suit 8.4.1 o versión posterior, licencia completa para utilizar el software y el software Matlab.	Bitplane
Phospho, pH 7.4	Portaobjetos de
	Tekdon	941-322-8288

Placas policlonal 1009832511Microscopio óptico de confocal de Solución salina tamponada microscopio de teflón caseros