Summary
Her presenterer vi to protokoller for å studere Phagocyte -Mycobacterium abscessus vekselsvirkningene: screening av et transposon mutant bibliotek for bakteriell intracellulær mangel og fastsettelse av bakteriell intracellulær transcriptome fra RNA sekvensering. Begge metodene gir innsikt i genomisk fordeler og transcriptomic tilpasninger styrke intracellulære bakterier fitness.
Abstract
Hva skiller Mycobacterium abscessus fra andre saprophytic mykobakterier er evnen å motstå fagocytose av menneskelig makrofager og evnen til å formere seg i slike celler. Disse virulens egenskaper gjengi M. abscessus patogene, spesielt i sårbare verter med underliggende strukturelle lungesykdom, som cystisk fibrose, bronkiektasier eller tuberkulose. Hvordan pasienter bli infisert med M. abscessus uklar. I motsetning til mange mykobakterier, M. abscessus finnes ikke i miljøet, men kan ligge inne amoebae, miljømessige phagocytes som representerer en potensiell reservoaret for M. abscessus. Faktisk M. abscessus er motstandsdyktig mot amoebal fagocytose og intra-amoeba livet synes å øke M. abscessus virulens i en eksperimentell modell av infeksjon. Men er lite kjent om M. abscessus virulens i seg selv. Dechiffrere genene overdragelse en fordel M. abscessus intracellulær liv, ble en screening av en M. abscessus transposon mutant biblioteket utviklet. Parallelt utviklet en metode for RNA utvinning fra intracellulær mykobakterier etter co kultur med amoebae. Denne metoden var godkjent og lov sekvensering av hele M. abscessus transcriptomes i cellene, gi, for første gang, en global oversikt på M. abscessus tilpasning til intracellulær liv. Begge metodene gir oss et innblikk i M. abscessus virulens faktorer som aktiverer M. abscessus å colonize luftveiene hos mennesker.
Introduction
Slekten Mycobacterium omfatter arter fra ufarlig saprophytic organismer til store human patogener. Kjente sykdomsfremkallende arter som Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium marinum og Mycobacterium ulcerans tilhører undergruppen av langsom voksende mykobakterier (sdb). I kontrast, undergruppe av hurtig voksende mykobakterier (RGM) er preget av evnen til å danne synlig kolonier på mindre enn 7 dager på agar medium. RGM gruppen består av mer enn 180 arter, hovedsakelig ikke-patogene saprophytic mykobakterier. Studier på RGM vekselsvirkningene med deres verter fokusert hovedsakelig på Mycobacterium smegmatis og vise at disse mykobakterier fjernes raskt av bakteriedrepende handling av makrofager.
Mycobacterium abscessus er en av de sjeldne RGM som er patogene for mennesker og er ansvarlig for en rekke infeksjoner mellom huden og bløtvevet infeksjoner lunge og spres infeksjoner. M. abscessus regnes, sammen med Mycobacterium avium, viktigste mycobacterial patogen i cystisk fibrose pasienter1.
Ulike studier utført på M. abscessus indikerer at denne mycobacterium oppfører seg som en intracellulær patogen, i stand til gjenlevende bakteriedrepende svar makrofager og fibroblaster i lungene og huden, som ikke er vanligvis observert i RGM 2 , 3 , 4. M. abscessus genomet analyse har identifisert metabolske veier vanligvis finnes i miljømessige mikroorganismer i kontakt med jord, planter og akvatiske miljøer, der gratis amoebae ofte presentere5. De har også vist at M. abscessus er utstyrt med flere virulens gener ikke funnet i saprophytic og ikke-patogene RGM, trolig kjøpt av den horisontale genoverføring i en nisje gunstige genetisk Exchange som kan samles ulike amoeba resistente bakterier.
Eksperimentelt, var en av de første slående resultatene observasjon av intracellulær veksten av M. abscessus i makrofager så vel som for M. tuberkulose6. M. abscessus også motstår forsuring av phagosome, apoptose og autophagy, tre sentrale mekanismene for mobilnettet motstanden til infeksjon2. Det har også vist at M. abscessus er i stand til å etablere en umiddelbar kommunikasjon mellom phagosome og stoffer et mer næringsrik miljø som kan favorisere bakteriell multiplikasjon2. Svært lite er kjent om genomisk fordelene som M. abscessus besitter eller fått tillatelse overlevelse i et intracellulær miljø. Amoeba coculture er en effektiv metode som tillot isolering av mange nye amoeba resistente bakterier som Mycobacterium massiliense7,8. En evne til å multiplisere innen amoebae ble observert i en modell av aerosolization av M. abscessus i mus, som kan gi en økt virulens M. abscessus4. En hypotese er at M. abscessus hadde utviklet genetiske egenskaper oppstått innenfor dette miljøet å overleve i phagocytic celler, som er forskjellig fra andre ikke-patogene RGM. Disse oppkjøpene kan favorisere muligheten til å spre og dens virulens i menneskelig verten.
Denne rapporten beskriver verktøy og metoder for å fremheve genomisk fordelene overdratt til M. abscessus å overleve i amoebae miljøet. For dette formålet beskrevet screening av M. abscessus transposon mutanter først, på Acanthamoeba castellanii type belastningen, hvilke innrømmer identifikasjon av mutant's defekt for intracellulær vekst. En andre screening i makrofager er også rapportert å bekrefte hvis denne feilen vedvarer i menneskelig verten. For det andre, for å forstå mekanismene som er brukt i M. abscessus å tilpasse seg livet i phagocytic celler og øke sin virulens i dyr verten, en metode spesielt tilrettelagt for M. abscessus ble utviklet, etter co kultur i nærvær av amoebae som tillot utvinning av totale RNA fra intra-amoebal bakterier. Som en konsekvens, ble en omfattende visning av M. abscessus gener som kreves for en intracellulær liv utviklet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. biblioteket Screening
- Byggingen av Tn mutant biblioteket
- Få en transposon biblioteket.
Merk: For dette eksperimentet, et transposon mutant bibliotek er Hentet fra E.J. Rubin, Harvard School of Public Health, Boston, USA. Biblioteket ble konstruert fra en glatt klinisk belastning (43S) av den M. abscessus kompleks (M. abscessus subsp. massiliense) med en phagemid introdusert i M. abscessus slik at tilfeldige innsetting av en enkelt Tn i en TA dinucleotide (91,240 TA sekvenser i genomet M. abscessus ). For mer informasjon se referansen Rubin et al. 9 og Laencina et al. 10.
- Få en transposon biblioteket.
- Titrering bibliotek og bevaring av M. abscessusTn mutanter i plater
Merk: Dette tar en uke.- Tine biblioteket på isen. Bestemme bakteriell konsentrasjonen ved å utføre føljetong fortynninger i 1 mL vann (10-1 til 10-15). Plate en dråpe hver fortynning på en Petriskål inneholder 7H 11 agar medium med 250 mg/mL kanamycin. Inkuber platene på 37 ° C i 3-4 dager.
Merk: Her en titrering 1011 bakterier/ml ble gjenopprettet. - Etter å bestemme konsentrasjonen av biblioteket, fortynne biblioteket til en siste konsentrasjon av 3000 bakterier/mL i 10 mL 25% glyserol-vann. Aliquot biblioteket i 10 cryotubes med 1 mL av biblioteket i hver retning. Lagre dele på-80 ° C.
- Når du er klar til bruk, tine en aliquot av utvannet biblioteket på is og legge 100 µL av biblioteket til 10 kvadratmeter Mueller-Hinton (MH) agar plater (størrelse 12 cm) for å gjenopprette 200 til 300 personlige kolonier etter 3-4 dager med inkubering på 37 ° C.
- Med sterilt tannpirkere, overføre personlige koloniene (ca 6000 koloniene i 60 x 96-brønns plater) i 96-brønnen platene fylt med 200 µL av 7T 9 medium med 0,2% glyserol, 1% glukose, 250 mg/mL av kanamycin. Ruge på 37 ° C i 5 dager uten risting.
- Overføre 100 µL av kultur (trinn 1.2.4) til en 96-brønns plate som inneholder 100 µL av 7T 9 medium med 40% glyserol. Lagre bestilte biblioteket på-80 ° C.
- Gjenta 1.2.3. til 1.2.5. med resten av biblioteket til 10.000 personlige kloner gjenopprettes (rundt 100 x 96-brønns plate og 30 MH plater).
- Tine biblioteket på isen. Bestemme bakteriell konsentrasjonen ved å utføre føljetong fortynninger i 1 mL vann (10-1 til 10-15). Plate en dråpe hver fortynning på en Petriskål inneholder 7H 11 agar medium med 250 mg/mL kanamycin. Inkuber platene på 37 ° C i 3-4 dager.
- Utarbeidelse av amoebae
- Kultur amoeba Acanthamoeba castellanii (AC) i 75 cm2 vev kultur kolber ved romtemperatur (RT) i 30 mL av PYG medium (tabell 1) for forsterking av cellen linje11.
Merk: Eldre trophozoites fra store selvklebende celler med mange fordøyelsesenzymer vacuoles er tydelig på et mikroskop. Cellen dobling tid anslås å være 25 h. celler ble forsterket hver 3 dager ved å spre en tredjedel av den opprinnelige kulturen i 75 cm2 vev kultur flasker. - Fjern PYG mediet med en 25 mL pipette. Vask cellene med 10 mL av AC buffer (tabell 2), som ikke inneholder noen karbon eller nitrogen kilder12. Gjenta vask to ganger mer.
Merk: AC buffer som inneholder ingen karbon eller nitrogen kilder unngår ekstracellulære veksten av mykobakterier. Dette minimum mediet fører til encystment av amoebae. For å begrense dette, inaktivert E. coli ble lagt som et substrat (trinn 1.4) til amoebae og svært kort kultur ganger ble forfremmet (48 h for mutant screening) og 4 h eller 16 h kultur for RNAseq eksperimenter. Også bruke dette mediet men beriket med PYG medium (vanligvis 10%). - Koble amoeba fra bunnen av flasken med en enkelt energisk rist av vev kultur kolbe.
- Telle celler med en hemocytometer til å justere til celle konsentrasjonen til 5 x 105 amoebae/mL utvannet i AC buffer.
- Kultur amoeba Acanthamoeba castellanii (AC) i 75 cm2 vev kultur kolber ved romtemperatur (RT) i 30 mL av PYG medium (tabell 1) for forsterking av cellen linje11.
- Utarbeidelse av inaktivert Escherichia coli bakterier å mate amoeba etter smitte
- Vokse E. coli kliniske isolere belastningen fra en glyserol aksjer i 100 mL av Luria kjøttkraft (LB) overnatting på 37 ° C.
- Høste bakterier med sentrifugering 1,835 x g i 10 min i 50 mL rør. Kast nedbryting. Resuspend pellets med 10 mL glyserol 10% vann. Gjenta vask to ganger mer.
- Resuspend pellets med 5 mL glyserol 10% vann. Aliquot 0,5 mL i 1,5 mL rør. Bestemme mengden av bakterier/mL ved å utføre føljetong fortynninger og legge fortynninger på LB agar plater. Lagre dele på-80 ° C.
- Dagen før amoeba infeksjon, tine en aliquot på is og videre til varme-drapet av rugende røret på 70 ° C for 60 min.
Merk: Se på inaktivering ved plating 100 µL av deaktivert bakterier på LB agar plater overnatting på 37 ° C. Ingen kolonier skal vises etter en natt med kultur. - Fortynne de varme-drepte bakteriene til en konsentrasjon av 107 bakterier i 50 µL AC bufferen og lagre utvannet bakterier på 4 ° C for mer enn en uke.
- Co kultur av amoebae -M. abscessus Tn mutant: først skjermen
Merk: Dette tar 3-4 måneder for screening av 6000 mutanter.- Spre 5 x 10-4 amoebae/vel til en 96-brønns plate i 100 µL av AC buffer. Inkuber 1t ved 32 ° C uten å riste. La den flytende amoeba trophozoïtes tid å overholde brønnene.
- Mens rugende, tine bakterier på is 1t.
- Legge til 5 µL av tinte bakterier kulturer med en elektronisk flerkanals pipette. Infisere for 1,5 h. skjermen rundt 6000 individualisert kloner fra 96-brønns platen Tn mutanter lager.
NOTE MOI er ukjent på dette trinnet i protokollen; men ble alle 96-brønns platene som inneholder Tn mutanter dyrket i nøyaktig samme måte. Denne første skjermen mål å raskt identifisere intracellulær mangelfull mutanter, uten å vurdere variasjoner i inoculum tetthet. - Etter 1,5 h infeksjon, invertere 96-brønns plate sterilt gauzes plassert i en sterilisert metallbrettet fjerne AC mediet under avtrekksvifte. Fylle med 200 µL av AC medium. Gjenta denne vask to ganger mer.
- Legge til 200 µL av fersk medium med 100 µg/mL amikacin å fjerne resterende ekstracellulære mykobakterier.
- Inkuber for 2t før du fortsetter med 3 flere vasker (som beskrevet i trinn 1.5.3). Etter vasking, opprettholde kulturer med 50 µg/mL amikacin i 200 µL av AC buffer.
- Legge til 5 x 107 inaktivert Escherichia coli bakterier (fra trinn 1.4) på slutten av infeksjon og hver 24 h å hindre encystment av amoebae.
- Etter 48 timer av co kultur, lyse cellene ved å legge 10 µL av 10% SDS (natrium dodecyl sulfate) hver brønn og ruge i 30 min på 32 ° C. Fortsette med føljetong fortynning og legge på Columbia agar plater som inneholder 5% sauer blod (COS plater) for å vurdere hvor mange intracellulær mykobakterier. Forsegle platen med parafilm og Inkuber på 37 ° C.
- Når kolonier vises på agar platene etter 3-4 dager, fotografi platen og identifisere mutanter nedsatt intracellulær vekst ved å observere innskudd med det laveste nummeret av bakteriell koloniene.
Merk: Ikke tankene om formen, høyde eller tetthet i kolonien (figur 1A). 136/6000 mutanter ble identifisert.
- Spre 5 x 10-4 amoebae/vel til en 96-brønns plate i 100 µL av AC buffer. Inkuber 1t ved 32 ° C uten å riste. La den flytende amoeba trophozoïtes tid å overholde brønnene.
- Co kultur av amoebae -M. abscessusTn mutant: andre skjermen av mutanter identifisert under den første skjermen
Merk: Dette tar 2 uker. En ekstra skjerm må utføres med 136 dempes mutanter innhentet etter det første skjermbildet å tallfeste nøyaktig hvor mange bakterier inokulert og antall intracellulær overlevelse bakterier 2 dager etter smitte.- Vokst 1 koloni av hver påvirket mutant i 50 mL fylt rør med 20 mL 7T 9 medium med 0,2% glyserol, 1% glukose og 250 mg/mL av kanamycin. Tillate bakterier å nå den eksponentielle fasen (0,6 < OD < 0,8).
- Vask kulturen med sentrifugering (1,835 x g i 10 min) i AC medium. Kast nedbryting. Gjenta dette vaske to ganger mer med 20 mL 7T 9 medium med 0,2% glyserol, 1% glukose og 250 mg/mL av kanamycin.
- Resuspend bakterier i 5 mL av AC buffer.
- Bestemme kolonien danner unit (CFU) konsentrasjon av mutanter. I 24-vel plater, legge 1 mL vann til de to første radene. Legge til 100 µL av bakteriell suspensjon i den første brønnen. Brønnene, med blande tre ganger. Deretter Sug opp 100 µL og innskudd til andre også.
- Med nye tips, gjentar du trinn 1.6.4 fra andre brønnen til den tredje en, etc. til tolvte godt.
- Sug opp 30 µL av 10-12 fortynning og legge den til en COS plate. Gjenta for de andre fortynninger.
- Pakk COS platen med parafilm og ruge i 3-4 dager på 37 ° C. Bestemme konsentrasjonen av telle koloniene.
- Utføre co kultur analyser som beskrevet ovenfor i tre eksemplarer i en 24-vel plate med 5 x 104 amoeba per brønn i 1 mL av AC co kultur medium. Vaksinere med et mangfold av infeksjon (MOI) 10.
- Etter 48 timer av co kultur, fortsette celle lysis som beskrevet i trinn 1.5.7. Utføre føljetong fortynninger i vann (10-1 til 10-6) og legge til 30 µL COS platene. Inkuber platene i 4 dager på 37 ° C før du fortsetter med CFU teller.
Merk: Etter denne andre skjermen, 60 136 mutanter ble bevart. - Lagre mutanter påvirket for å overleve i cellene. Legge til en koloni i en cryotube som inneholder LB medium med glyserol (20% endelige) eller i en cryotube som inneholder kommersiell løsning og microbeads å favorisere en langsiktig bevaring og lette fremtidige vaksinering og deretter lagre på-80 ° C.
- Vurdere i vitro mutant veksten ved å måle optisk densitet (OD) på 600 nm hver 2 dager.
- Vokse 1 koloni av hver påvirket mutant i 50 mL rør fylt med 20 mL 7T 9 medium med 0,2% glyserol, 1% glukose og 250 mg/mL av kanamycin. Tillate bakterier å nå den eksponentielle fasen (0,6 < OD < 0,8) før du justerer OD til 0,01 for å begynne kinetics.
- Ekskludere mutanter med en i vitro vekst defekt sammenlignet med WT belastningen fra settet med intracellulære mangelfull mutanter.
- Co kultur av makrofager -M. abscessus Tn mutant defekt for en intra-amoeba livet
Merk: Dette tar 1 måned.- Spre 5 x 104 J774.2 murint makrofager per brønn av en 24-vel plate i 1 mL av rike medium, DMEM med 10% av Fetal kalv Serum (FCS). Inkuber platene 24 h 37 ° C og 5% CO2 tillate macrophage vedheft. Gi 3 gjentak.
- Utføre infeksjonen. Vaksinere Tn mutanter, med en MOI 10, fortynnet i DMEM med 10% FCS i et volum på 100 µL.
- Etter 3 h infeksjon, utføre tre vasker med 1 mL av DMEM (en vakuumpumpe kan brukes). Deretter behandle med 250 µg/mL amikacin (i DMEM med 10% FCS) 1t å fjerne resterende ekstracellulære mykobakterier.
- Etter 3 flere vasker med 1 mL av DMEM, opprettholde kulturer i 250 µg/mL amikacin (i DMEM med 10% FCS) til et siste volum 1 ml å hindre ekstracellulære mycobacterial multiplikasjon.
- 72 h etter co kultur, fjerne mediet og lyse i makrofager ved å legge til 1 mL kaldt vann. Inkuber i 30 min på 4 ° C.
- Utføre CFU analyser på COS plater å vurdere hvor mange intracellulære bakterier.
- I en 24-vel tallerken, Legg 1 mL vann til de to første radene. Legge til 100 µL av co cellen lysate den første brønnen. Brønnene, med blande tre ganger. Sug opp 100 µL og sette dem i andre også.
- Nye tips, gjenta fortynning fra andre brønnen til den tredje en, etc. til tolvte godt. Deretter Sug opp 30 µL av 10-12 fortynning og legge den til en COS plate.
- Gjenta for de andre fortynninger. Pakk COS platen med parafilm og vente 3-4 dager å observere og telle koloniene.
- Identifikasjon og sekvensering av stedet for innsetting av Tn i M. abscessus mutanter
Merk: Dette tar 1,5 måneder for 60 mutanter.- Genomic utvinning av M. abscessus mutanter
- Vokse mutanter i en 50 mL tube med 20 mL 7T 9 medium supplert med 0,2% glyserol, 1% glukose og kanamycin 250 mg/mL til eksponentiell fase (OD600= 0,8).
- Høste 10 mL av kulturer (2,396 x g, 5 min). Kast nedbryting. Suspendere bakterier i 500 µL av løsningen jeg (25% sukrose, 50 mM Tris pH 8, 10 mg/mL lysozyme, 40 mM thiourea). Overføre løsningen til 2 mL rør med skrukork og ruge 2 h på 37 ° C.
- Legg til 500 µL løsning II (25% sukrose, 50 mM Tris pH 8, 50 mM EDTA). Etter pipettering opp og ned 5 - 10 ganger, legge zirkonium perler til et volum på 500 µL i røret.
- Fortsette med cellen lyse med en homogenizer (3 x 6000 rpm, 45 s) med en 1 min incubation på is mellom hver runde.
- Legge til 5 µL av 20 mg/mL proteinasen K (100 µg/mL endelig) og ruge prøvene overnatting på 55 ° C.
- Legg 1 mL av kalde fenol/kloroform/isoamyl alkohol (25:24:1) under avtrekksvifte. Bland prøvene av vortexing før du fortsetter med sentrifugering RT og 16 500 x g i 30 min.
- Etter sentrifugering, gjenopprette den vandige fasen og legge til en lik mengde kalde fenol/kloroform/isoamyl alkohol løsningen under en hette. Sentrifuge prøvene 16 500 x g i 30 min å gjenopprette den vandige fasen igjen.
- Legge til 0,7 volumet av RT isopropanol den gjenopprettede vandige fasen under avtrekksvifte. Invertere sakte rør å tillate DNA nedbør og ruge 5 min på RT. Deretter sentrifuge for 10 min 16 500 x g og RT.
- Fjerne nedbryting og vask pellets med 500 µL av 70% etanol under en hette. Sentrifuge rør i 10 min 16 500 x g på RT før etanol. Inkuber i 10 min å tillate gjenværende alkohol fordampning.
- Til slutt, avbryte DNA pellet 100 µL DNase/RNase gratis vann. Bestemme DNA avkastning og renhet DNA med et spektrofotometer.
- Fjerne 1 µg genomisk DNA og fordøye med 10 U av ClaI for en natt for sub kloning Tn innsetting site. Bruke produsentens protokollen.
Merk: Clajeg enzymet er en av de mest representert begrensning enzymene i M. abscessus genomet (2,173 begrensning nettsteder). En Clajeg begrensning området finnes også i Tn sekvensen oppstrøms av kanamycin motstand kassetten av Tn mutant. Dermed kan Clajeg-mediert subcloning identifisere Tn innsetting site.
- Sub kloning i en plasmider genomisk DNA som inneholder Tn
Merk: Før du går videre med Tn-subcloning i den 2,686 bp pUC19 ampicillin-resistente plasmider, legge en Clajeg begrensning nettstedet i flere kloning for plasmider. En rekke pUC19 plasmider kan finnes på denne linken https://www.addgene.org/50005/sequences/.- Følg produsenten er protokollen å fordøye pUC19 plasmider med EcoRjeg og HindIII, som utgir et fragment av 51 bp og et fragment av 2635 bp. rense den doble fordøyd vektoren med en kommersiell PCR rensing kit å eliminere 51 bp utgitt fragment.
- Mix 1 µL (konsentrasjon 25 pmol/µL) av to utfyllende oligonucleotides (5 "AGCT TATA AGATCT TATA ATCGAT TATA3" og 5 'AAT TAA TAA TCG ATT ATA AGA TCT TAT A3') 28 bp hver inneholder Clajeg begrensning området og i endene HindIII og EcoR Jeg begrensning nettsteder. Varme ved 100 ° C i 10 min og kjøle for å knytte dem.
- Fordøye sammenkoblede primerne av EcoRjeg og HindIII etter produsentens protokollen.
- Ligate 150 ng av EcoRjeg /HindIII-begrenset pUC19 plasmider med ulike konsentrasjon av sammenkoblede primere (50 pmol/µL, 25 pmol/µL, 2,5 pmol/µL) 1t på RT med 1 U T4 DNA ligase i et siste volum på 20 µL. Sjekk kloning av en annen enzymatisk fordøyelsen.
- Fordøye det endrede plasmider med Clajeg for 2t på 37 ° C.
- Ligate 50 ng av Clajeg begrenset pUC19plasmider og 50 ng genomisk DNA fordøyd av Clajeg 1t på RT med 1 U T4 DNA ligase i 10 µL.
- Videre til E. coli electrocompetent bakterier transformasjon med 5-10 µL av hemorroider (2500 V, 200 ohm, 25 µF). Velg kloner på LB agar plater med 50 µg/mL kanamycin og 50 µg/mL ampicillin velge bakterier bærer plasmider med deler av Tn sekvenser.
- Vokse motstandsdyktig kloner overnatting i LB flytende medium med passende antibiotikumet utvalg (50 µg/mL kanamycin og 50 µg/mL ampicillin).
- Ekstra plasmider DNA. Sjekke tilstedeværelse av sette av enzymatisk begrensning og sekvens 3 slutten av Tn identifisere forstyrret genet med en oligonucleotide (5' TTGACGAGTTCTTCTGA 3) tilsvarende sist 17 base parene av Tn -kanamycin motstand kassett.
- Juster rekkefølgen mot M. abscessus går 06 belastningen ved å utføre en nukleotid eksplosjon (BLAST-N).
- Genomic utvinning av M. abscessus mutanter
2. RNA utvinning av intracellulær mykobakterier for Rnaseq analyse
Merk: Dette tar 4 måneder for eksperimenter og 4 måneder for RNAseq analyse.
-
Co kultur amoebae-M. abscessus i grupper
Merk: I følgende forsøket, co kultur er utført i 50 mL rør med agitasjon å favorisere bakterier til celle kontakter.- Vokse M. abscessus 7 h 9 medium med 0,2% glyserol, 1% glukose til midt-eksponentiell fase på 120 rpm.
- Vask bakterier to ganger med 10 mL av AC buffer.
- Beregne bakterier konsentrasjonen av måler OD600nm (1 OD600= 4 x 108 mykobakterier). Legge til 8.5 x 108 mykobakterier 8.5 x 106 amoebae i 10 mL av AC medium.
- Inkuber 1t på 30 ° C med mild agitasjon (ca 80 rpm).
- Høste celler av sentrifugering 253 x g i 12 min. Fjern nedbryting og suspendere cellene i 10 mL av AC buffer. Gjenta denne vask to ganger mer.
- Resuspend cellene i 10 mL AC bufferen som inneholder 50 µg/mL amikacin å eliminere ekstracellulære bakterier og ruge 4 h på 30 ° C med mild agitasjon (80 rpm). Vask cellene ganger.
-
Utvinning av totalt fra intracellulær M. abscessus
Merk: Utføre trinn 2.2.1–2.2.3 under avtrekksvifte skyldes bruk av giftige reagenser.- Etter de endelige vasker, resuspend de infiserte amoebae i 4 mL kaldt løsning III (tabell 3) med bevisst 280 µL av β-mercaptoethanol å forstyrre amoebae. Dette er guanidinium thiocyanate (GTC) skritt. Opprettholde suspensjon på is 10 min. sentrifuge cellen lysate for 30 min 2,396 x g og 4 ° C for å pellets utgitt intracellulære bakterier.
- Fjern nedbryting og avbryte den bakterielle pellet 1 mL kaldt løsning III. Høste bakterier 2396 x g i 30 min på 4 ° C. Resuspend pellet i 1 mL av utvinning buffer og overføre til en 2 mL skruen tube med zirkonium perler (inntil 500 µL gradering av rør). Lagre rør for minst 24 timer på-80 ° C.
Merk: Lagring i lyse reagensen tillater inaktivering av RNases og celle oppløsning. - Når du er klar til bruk, tine prøvene på is og lyse dem med en homogenizer ved å utføre to runder på 6000 rpm for 25 s, etterfulgt av en runde på 6000 rpm for 20 s med en 1 min incubation på is mellom hver runde.
- For å kjøle prøven ned, ruge dem på is 10 min. Deretter Legg 200 µL av kloroform fortynnet i isoamyl alkohol. Etter vortexing virvel prøvene for 1 min, i 15 min på 16.500 x g og 4 ° C.
- Legge til 0,8 mL kaldt isopropanol i den vandige fasen og Inkuber prøvene for 2-3 h på 20 ° C. Sentrifuge prøvene for 35 min på 16.500 x g og 4 ° C. Kast nedbryting.
- Vask RNA pellet ved å legge 500 µL av kaldt 70% etanol (ikke bland).
- Sentrifuge prøvene 16 500 x g i 10 min å fjerne etanol. Sug opp løsningen og tørr i en sentrifugal konsentrator.
- Når tørket, resuspend pellets i 100 µL DNase/RNase gratis vann.
Merk: Utvalg må behandles to ganger med DNases å fjerne DNA forurensninger i henhold til produsentens anbefalinger. - Vurdere RNA integritet på en agarose gel og bekreft ved å måle hvor RNA integritet (RIN) og ribosomal forholdet med en chip-baserte kapillært elektroforesemetode.
Merk: RIN tar hele electrophoretic spor hensyn. RIN programvare algoritmen gir klassifiseringen av totale basert på et nummereringssystem fra 1 til 10, 1 dårligst profilen og 10 er den mest intakte. For å fortsette cDNA biblioteket forberedelse, må RINs være over 8 og ribosomal forholdet [28S/18S] så høyt som mulig, ideelle verdien 2, avhengig av organismen og dens særegenheter. - Lagre RNA prøver-80 ° c til utarbeidelse av cDNA biblioteket for sekvenser.
-
Utarbeidelse av cDNA biblioteket
- For å fortsette med biblioteket forberedelser, kan du bruke et kommersielt tilgjengelig cDNA syntese kit (Tabell for materiale) bruker produsentens protokollen.
- Undersøke biblioteket for konsentrasjonen og kvaliteten på en DNA-Chip.
Merk: Mer presise og nøyaktige kvantifisering kan utføres med følsom fluorescerende-baserte kvantifisering analyser.
-
Biblioteket sekvensering
- Normalisere prøvene 2 nM og videre til multipleksing ifølge flyt celle organisasjonen.
- Denature prøvene i en konsentrasjon av 1 nM 0,1 N NaOH i 5 min på RT.
- Fortynne prøvene på 10 pM. Laste hver prøve flyt cellen på 10 pM.
- Fortsett med sekvensering med høy gjennomstrømming sekvensering system som gjør at store genomics. Her kjøringen var en SRM kjøre (SR: enkelt lese, PE: sammen-end leser, M: multiplekset prøver) av 51 sykluser med 7 indeks baser lese.
- Vurdere kvaliteten på sekvensering med den eksterne FastQC programmet13.
- Etter trimmingen av kortet sekvenser, Fortsett med Les justeringer mot en referanse genom. Justeres mot eukaryote celle genomet vurdere eksempel forurensning og, om nødvendig fortsette trimmingen av den ikke-bakteriell lest.
-
Statistisk analyse
- Bruke flere programmer tilgjengelig online å definere sett med ulikt uttrykt gener: R programvare, Bioconductor pakker inkludert DESeq2 og PF2tools pakken (versjon 1.2.12) utviklet på plattformen "Transcriptome et Epigénome» (Pasteur Institute, Paris).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
M. abscessus har evnen å motstå og unnslippe bakteriedrepende svarene makrofager og miljømessige protozoer som amoebae. M. abscessus uttrykker virulens faktorer når dyrket i kontakt med amoebae, som gjør det mer virulente i mus4. Det første målet for disse metodene var å identifisere genene i M. abscessus slik at den overlevelse og multiplikasjon innen amoebae.
For dette, en mutert bibliotek av M. abscessus subsp. massiliense, ved Tn levering9, ble vist etter co kultur i nærvær av amoebae, identifisere mutanter med dempes vekst i dette intracellulær miljø (figur 1). Virkemåten til samme mutanter ble også vurdert etter co kultur med makrofager analysere om denne veksten demping ble bevart i mus makrofager.
Blind transposon biblioteket screening tilnærming, bekreftet en defekt replikering fenotypen for 47 6000 mutanter som hadde en overlevelse av 50% eller mindre i amoebae og/eller makrofager, sammenlignet med10. For å utelukke ble mutanter dempes intracellulær overlevelse som kan skyldes en indre vekst mangelen på mycobacterium, veksten kurver av alle valgte Tn mutanter vurdert i en i vitro flytende kultur beriket medium (1% glukose - 7 H 9). In vitro vekst av alle mutanter ble overvåket av følgende OD600 kulturer hver 2 dager. Forskjellige mutanter vises en i vitro vekst defekt i forhold til tilsvarende vill-type belastning ble ekskludert fra studien.
Det var viktig for denne blind test for å bli reprodusert daglig på nøyaktig samme protokoll. Begrensning av denne teknikken var den første visuelle Screeningen, ble bildene tatt av hver CFU å gi et nøyaktig bilde for referanse. I denne gruppen av mutanter, ble 12 M. abscessus mutanter (inkludert dubletter) identifisert som transposon ble satt inn i gener tilhører ESX-4 locus av typen VII sekresjon system som understreker sin betydning i de intracellulær veksten av M. abscessus10.
Til nå, har analyse av M. abscessus virulens i hovedsak vært basert på komparativ analyse av genomet av M. abscessus med at av M. chelonae, en mycobacterium tilhører samme gruppe, men forårsaker bare infeksjoner i huden hos mennesker. Målet var å få en katalog av gener som er uttrykt i forskjellige co oppdrettsforholdene for å bedre forstå tilpasning og potensielt virulens mekanismer involvert i co kultur i nærvær av miljømessige professional phagocytes. Analyse av dette økt virulens gjennom en helhetlig tilnærming til totalt sekvensering messenger RNAs av M. abscessus, ble utført for å oppdage RNAs indusert eller undertrykt under amoeba co kulturer sammenlignet RNAs transkribert under i vitro forhold. Differensial uttrykket av disse RNAs kan gi til M. abscessus en forbedret "virulens" forklarer koloniseringen av øvre luftveiene hos mennesker.
Disse co kulturer ble igjen utført i et minimum medium (ingen kilde av karbon eller nitrogen) som beskrevet ovenfor, for å hindre ekstracellulære vekst av M. abscessus og å være representativt for miljøforholdene overfor disse mykobakterier og under press av valg av en antibiotika gjennom hele co kultur velge intracellulær mykobakterier.
Derfor utviklet en teknikk for å isolere RNA fra intracellulær mykobakterier. Største vanskeligheten med uttrekkingen av mycobacterial var å unngå forurensning med amoebal RNA (eukaryoter type). Du kan unngå dette ble lysis av amoeba utført på forskjellige tider innlegget co kultur, bruker guanidinium thiocyanate (GTC); siden intracellulær mykobakterier er motstandsdyktige. Etter dette trinnet ble en mekanisk utvinning av de mycobacterial RNAs gjennomført med en celle-homogenizer i nærvær av zirkonium perler. Denne teknikken tillot oss å få mycobacterial RNA av god kvalitet, med en RIN-nummer av høy kvalitet, avgjørende for å forbedre muligheten til å gjennomføre en fullstendig analyse av M. abscessus transcriptome, bruker sekvensering budbringer RNA (mRNA) teknikk (figur 2). Dette er aldri gjort før og ga oss en grunnleggende visjon av genet indusert eller undertrykt, ved å gruppere dem etter sin rolle: svaret av M. abscessus et miljø begrenset i kilden av næringsstoffer og mineraler, til en hypoxic eller surt miljø og motstand av M. abscessus mot oksidativ og nitrosative stress, og til slutt uttrykk for virulens av M. abscessus i miljømessige amoeba.
Figur 1 : A. første visuelle skjermen av M. abscessus Tn mutanter i amoeba. (A) store skjermen Tn mutanter på amoebae utføres i 96-brønnen plater med et tilfeldig mangfold av infeksjon raskt identifisere dempes mutanter. (B) identifikasjon av dempes Tn mutanter forstyrret gener. TN mutanter genomisk DNA er fragmentert med Clajeg klone Tn innsetting site. M. abscessus genomer havner 2500 Clajeg begrensning nettsteder som favoriserer innhenting av kort DNA fragmenter men senket sannsynligheten for å klone Tn innsetting site (1/2500). Kloner er merket med kanamycin, motstand Bjørn av transposon. Forstyrret genet er identifisert av sekvensering med en innføring i Tn kanamycin motstand kassetten (svart pil). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Analyse av mycobacterial RNA utvinning. (A) RNA utvinning av intracellulær M. abscessus under amoebae -M. abscessus co kultur. Amoebae co kulturer med M. abscessus er utført på en høy mangfold av infeksjon (dvs. 100) i store mengder, med milde agitasjon, å favorisere celle bakterier kontakter. Etter co kulturer, er celler høstet og lysed med en kombinasjon av GTC og ß-mercaptoethanol. Celle lysate inneholder bakterier er behandlet med GTC igjen å svekke bakterier cellevegg for å lette bakterier mekaniker lysis før RNA ekstraksjon. (B) RNA kvalitet og integritet vurdering med en bioanalyzer. En geleelektroforese gel er gitt som rRNA er observert (23, 16S og 5S). RIN må være over 8 for å fortsette med biblioteket forberedelse til sekvensering og rRNA prosenter (23/16S) så høyt som mulig avhengig av organismen, ideelle verdien blir 2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Virkemåten til M. abscessus er mye mer lik oppførsel av patogene SGM som M. tuberkulose enn noen andre mykobakterier tilhører RGM2. Viktig element i virusets av CMS er deres evne til å overleve eller selv multiplisere antigen presentere celler, som makrofager og dendrittiske celler.
M. abscessus har kjøpt visse genomisk fordeler som vist av totale sekvensen av sine genom14 for å overleve i en eukaryot phagocytic celle. Genomet av M. abscessus vist seg å være rask utvikling og veldig plast, med mange nylig introdusert innsetting sekvenser som prophages og nye gener15. Selv om det er færre data på virulens faktorer i M. abscessus forhold til M. tuberkulose, synes M. abscessus å kunne utvikle seg raskt og aktivt mot økt virulens. Inntil nå var analyse av M. abscessus virulens i hovedsak basert på komparativ analyse av genomet av M. abscessus med at av M. chelonae, en mycobacterium tilhører samme gruppe, men forårsaker infeksjoner som er begrenset til huden hos mennesker. Noen gener har ikke presentere i M. chelonae men til stede i M. abscessus, som fosfolipase C, delvis forklart motstanden av M. abscessus etter fagocytose av miljømessige amoebae4.
Utviklingen av en amoeba co kultur teknikk med miljøprøver har vist utvetydig amoeba-mycobacterial vekselsvirkningene16,17. Dermed mykobakterier kan isoleres fra lysates co kultivert i nærvær av amoebae i en vann behandling anlegget18og M. massiliense ble isolert fra sputum av en pasient etter co kultur med amoebae, mens kulturen alene ikke tillate isolering av denne mykobakterier8. Amoebae er stadig vurdert som en inkubator for mykobakterier4 og Acanthamoebasp. som en naturlig miljø vert for mange ikke-tuberculous mykobakterier. Amoeba pluss mykobakterier co kultur systemer er stadig blir foreslått som enkle og raske modeller som karakteriserer faktorer involvert i intracellulær veksten av mykobakterier19,20,21, 22,23,24.
I miljøet, er samspillet mellom mykobakterier og amoebae dårlig dokumentert. Første artikkelen beskriver bevis for en tilknytning mellom mykobakterier og amoebae i feltet kom ut i 2014, og denne studien fokusert på en analyse av en drikkevann nettverk25.
Vi vet er dette den første Screeningen beskrevet under en co kultur med amoebae. Denne studien tillatt oss å demonstrere rollen miljømessig phagocytes i kjøp av virulens av en opportunistisk patogen påvirker mennesker. For å markere de genene kreves for intracellulær overlevelsen av M. abscessus, ble en skjerm av et mutert bibliotek av transponering utført i en underart av M. abscessus komplekse og i en klinisk belastning. Mutant biblioteket ble vist med amoebae, dette siste har vist som "trening bakken" for å øke virulens av M. abscessus i mus4, lik som observert med M. avium26. Store resultatet ble funnet for første gang i mykobakterier av den essensielle rollen av ESX-4 locus koding en type VII sekresjon system og forfedre av ESX-1 locus anses avgjørende for virulens og intracellulær overlevelse av M. tuberkulose Mycobacterium microti og M. marinum,27,,28,,29,,30,,31.
Det andre målet var å få en katalog av gener som er uttrykt i forskjellige co oppdrettsforholdene for å bedre forstå tilpasning og potensielle virulens mekanismer involvert i co kultur i nærvær av miljømessige profesjonell phagocytes. Analyse av dette økt virulens gjennom en helhetlig tilnærming til totalt sekvensering av messenger RNAs av M. abscessus, ble utført for å oppdage RNAs indusert eller undertrykt under amoeba co kulturer sammenlignet RNAs transkribert under i vitro forhold. Differensial uttrykket av disse RNAs kan gi til M. abscessus en forbedret "virulens" forklarer koloniseringen av øvre luftveiene hos mennesker. Blant RGM arter er M. abscessus et unntak til ikke-patogene fenotypen sammen med M. chelonae. Evne til M. abscessus forårsake lignende patologi til tuberculous mykobakterier gjør det enda mer unikt. Mange studier har rapportert at intracellulær tilpasninger av M. tuberkulose liv i makrofager32,33 , men ingen har fokusert på M. abscessus tilpasninger i vivo. Transcriptional svar av M. abscessus hypoksi har vært beskrevet34 men på betydningen av mycobactins og dosR regulon som beskrevet i M. tuberkulose. Analyse av M. abscessus transcriptome i amoebae og makrofager gir innsikt i de bakterielle tilpasninger til intracellulær liv per se. En sammenligning av de transcriptomes tillater vurdering av rollen amoebae utløse M. abscessus virulens hos mennesker og å tyde av spesifikke tilpasninger til phagocytic pattedyrceller. En antakelse ble gjort at amoebal miljøet kan utgjøre et treningssted for M. abscessus før overføring til menneskelige celler, for å beskrive M. abscessus virulens i utviklingen avpasningene, gjør denne tilnærmingen opprinnelige .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi erkjenner sterkt Pr. E.J. Rubin (Harvard Medical School, Boston, USA) for dyrebare gave mutant biblioteket og Dr. Ben Marshall (fakultet, Universitetet i Southampton, UK) for korreksjoner manuskriptet. Vi erkjenner sterkt den franske pasienten Association for cystisk fibrose "Vaincre la Mucoviscidose" og "L'Association Gregory Lemarchal" for deres finansielle støtte (RF20150501377). Vi også takke National Agency for forskning (ANR program DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)) og Région Ile-de-France (Domaine d'Intérêt Majeur sykdommer Infectieuses et Emergentes) for finansiering postdoktorstipend V.L-m. L. L. er en doktorgrad fra den "Ministère de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Material/ Equipment | |||
| 24-well plates | Thermofisher | 11874235 | |
| 96-well plates | Thermofisher | 10687551 | |
| Beadbeater | Bertin | Precellys 24 | |
| Bioanalyzer | Agilent | ||
| Genepulser Xcell | Biorad | ||
| Nanodrop spectrophotometer 2000 | Thermofisher | ||
| QuBit fluorometer | Thermofisher | Q33226 | |
| zirconium beads/silica beads | Biospec products | 11079101Z | Beads |
| Name of reagent/cells | |||
| Acanthamoeba castellanii | ATCC | 30010 | strain |
| Amikacin | Mylan | 150927-A | powder |
| B-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | >93% granular anhydrous |
| Chloroform | Fluka | 25666 | solution |
| ClaI enzyme | New England Biolabs | R0197S | enzyme |
| Columbia agar | Biomerieux | 43041 | 90 mm |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | powder |
| DMEM | Thermofisher | 11500596 | medium |
| DNase and RNase free water | Invitrogen | 10977-035 | solution |
| E. coli electrocompetent | Thermofisher | 18265017 | bacteria |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | powder |
| Escherichia coli | Clinical isolate | personal stock | bacteria |
| Fe(NH4)2(SO4)-6H20 | EMS | 15505-40 | sulfate solution 4% aqueous |
| Fetal Calf Serum | Gibco | 10270 | serum |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | solution |
| Guanidium thiocyanate | Euromedex | EU0046-D | powder |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | solution |
| J774.2 macrophages | Sigma-Aldrich | J774.2 | Strain |
| kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | powder |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | Monobasic, anhydrous |
| LB liquid medium | Invitrogen | 12795-027 | powder |
| Lysozyme | Roche | 10837059001 | powder |
| MgSO4 | Labosi | M275 | pur |
| Microbank TM (cryotubes with beads) | Pro-Lab Diagnostic | PL.170/M | |
| Middlebrook 7H11 medium | Sigma-Aldrich | M0428 | powder |
| Middlebrook 7H9 medium | Thermofisher | 11753473 | powder |
| Müller-Hinton agar | Biorad | 3563901 | powder |
| N-Lauryl-sarcosine | Merck | S37700 416 | powder |
| Na2HPO4-7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | 98-102% |
| Phenol/chloroforme | Sigma-Aldrich | 77617 | solution |
| Proteinase K | Thermofisher | EO0491 | powder |
| proteose peptone | BD | 211684 | enzymatic digest of animal tissue |
| pUC19 plasmid | New England Biolabs | 54357 | plasmid |
| SDS 20% | Biorad | 1610418 | solution |
| Sodium citrate | Calbiochem | 567446 | powder |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | 88810 | powder |
| Tris | Sigma-Aldrich | 154563 | powder |
| Trizol | Thermofisher | 12044977 | solution |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | solution |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Kit | |||
| AMBION DNase kit | Thermofisher | 10792877 | kit |
| DNA Agilent Chip | Agilent | 5067-1504 | kit |
| GeneJET Plasmid Miniprep kit | Thermofisher | K0503 | kit |
| PureLink PCR Purification kit | Invitrogen | K310001 | kit |
| Quant-It" assays kit | Thermofisher | Q33140/Q32884 | kit |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | Y90001 | kit |
| TruSeq Stranded RNA LT prep kit | Illumina | 15032611 | kit |
References
- Qvist, T., et al. Comparing the harmful effects of nontuberculous mycobacteria and Gram negative bacteria on lung function in patients with cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 380-385 (2016).
- Roux, A. -L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
- Castañeda-Sánchez, J., et al. Defensin Production by Human Limbo-Corneal Fibroblasts Infected with Mycobacteria. Pathogens. 2 (4), 13-32 (2013).
- Bakala N'Goma, J. C., et al. Mycobacterium abscessus phospholipase C expression is induced during coculture within amoebae and enhances M. abscessus virulence in mice. Infection and Immunity. 83 (2), 780-791 (2015).
- Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).
- Tailleux, L., et al. Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells. Journal of Immunology. 170 (4), 1939-1948 (2003).
- Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches. Journal of Visualized Experiments. (80), e51055 (2013).
- Adékambi, T., et al. Amoebal coculture of "Mycobacterium massiliense" sp. nov. from the sputum of a patient with hemoptoic pneumonia. Journal of Clinical Microbiology. 42 (12), (2004).
- Rubin, E. J., et al. In vivo transposition of mariner-based elements in enteric bacteria and mycobacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (4), 1645-1650 (1999).
- Laencina, L., et al. Identification of genes required for Mycobacterium abscessus growth in vivo with a prominent role of the ESX-4 locus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1002-1011 (2018).
- Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens via amoebae, and the interaction of those and other isolates with amoebae. Journal of Clinical Pathology. 36 (9), 978-986 (1983).
- Moffat, J. F., Tompkins, L. S. A quantitative model of intracellular growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii. Infection and Immunity. 60 (1), 296-301 (1992).
- FastQC program. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2018).
- Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).
- Choo, S. W., et al. Genomic reconnaissance of clinical isolates of emerging human pathogen Mycobacterium abscessus reveals high evolutionary potential. Science Reports. 4, (2015).
- Greub, G., Raoult, D. Microorganisms Resistant to Free-Living Amoebae. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 413-433 (2004).
- Kicka, S., et al. Establishment and Validation of Whole-Cell Based Fluorescence Assays to Identify Anti-Mycobacterial Compounds Using the Acanthamoeba castellanii - Mycobacterium marinum Host-Pathogen System. Public Library of Science One. 9 (1), 87834 (2014).
- Thomas, V., Loret, J. -F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environmental Microbiology. 10 (10), 2728-2745 (2008).
- Lamrabet, O., Medie, F. M., Drancourt, M. Acanthamoeba polyphaga-enhanced growth of mycobacterium smegmatis. Public Library of Science One. 7 (1), (2012).
- Cosson, P., Soldati, T. Eat, kill or die: when amoeba meets bacteria. Current Opinion in Microbiology. 11 (3), 271-276 (2008).
- Lelong, E., et al. Role of magnesium and a phagosomal P-type ATPase in intracellular bacterial killing. Cellular microbiology. 13, November 2010 246-258 (2011).
- Ouertatani-Sakouhi, H., et al. Inhibitors of Mycobacterium marinum virulence identified in a Dictyostelium discoideum host model. Public Library of Science One. 12 (7), 0181121 (2017).
- Trofimov, V., et al. Antimycobacterial drug discovery using Mycobacteria-infected amoebae identifies anti-infectives and new molecular targets. Science Reports. 8 (1), 3939 (2018).
- Cardenal-Muñoz, E., Barisch, C., Lefrançois, L. H., López-Jiménez, A. T., Soldati, T. When Dicty Met Myco, a (Not So) Romantic Story about One Amoeba and Its Intracellular Pathogen. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 529 (2017).
- Delafont, V., et al. First evidence of amoebae-mycobacteria association in drinking water network. Environmental Science & Technology. 48 (20), (2014).
- Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S., Bermudez, L. E. Interaction of Mycobacterium avium with environmental amoebae enhances virulence. Infection and Immunity. 65 (9), (1997).
- Stamm, L. M., et al. Mycobacterium marinum escapes from phagosomes and is propelled by actin-based motility. Journal of Experimental Medicine. 198 (9), 1361-1368 (2003).
- Groschel, M. I., Sayes, F., Simeone, R., Majlessi, L., Brosch, R. ESX secretion systems: mycobacterial evolution to counter host immunity. Nature Reviews Microbiology. 14 (11), 677-691 (2016).
- Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nature Medicine. 9 (5), 533-539 (2003).
- Hsu, T., et al. The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12420-12425 (2003).
- Smith, J., et al. Evidence for pore formation in host cell membranes by ESX-1-secreted ESAT-6 and its role in Mycobacterium marinum escape from the vacuole. Infection and Immunity. 76 (12), 5478-5487 (2008).
- Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis. within Macrophages. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 693-704 (2003).
- Fontan, P., Aris, V., Ghanny, S., Soteropoulos, P., Smith, I. Global Transcriptional Profile of Mycobacterium tuberculosis during THP-1 Human Macrophage Infection. Infection and Immunity. 76 (2), 717-725 (2008).
- Miranda-CasoLuengo, A. A., Staunton, P. M., Dinan, A. M., Lohan, A. J., Loftus, B. J. Functional characterization of the Mycobacterium abscessus genome coupled with condition specific transcriptomics reveals conserved molecular strategies for host adaptation and persistence. BMC Genomics. 17 (1), 553 (2016).
