Qui, presentiamo un protocollo per consentire la quantificazione accurata della metilazione del DNA (mtDNA) mitocondriale. In questo protocollo, descriviamo una digestione enzimatica del DNA con BamHI accoppiato con una pipeline di analisi bioinformatica che può essere utilizzata per evitare la sopravvalutazione dei livelli di metilazione del DNA mitocondriale causato dalla struttura secondaria del mtDNA.
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Articolo metodologico
Metodologia per la rilevazione accurata di metilazione del DNA mitocondriale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Quantificazione di metilazione del DNA può essere ottenuto utilizzando del bisolfuro, che sfrutta la proprietà di bisolfito di sodio per convertire unmethylated citosina in uracile, in un contesto di DNA single-stranded. Del bisolfuro può essere mirato (mediante PCR) o eseguite sul genoma intero e fornisce quantificazione assoluta di metilazione della citosina alla singola base-risoluzione. Data la natura distinta del DNA nucleare e mitocondriale, in particolare nella struttura secondaria, adattamenti di metodi di sequenziamento di bisolfito per indagare la metilazione della citosina nel mtDNA dovrebbero essere fatto. Struttura secondaria e terziaria di mtDNA può effettivamente portare ad bisolfito sequenziamento artefatti che conduce a falsi positivi a causa di scarso accesso denaturazione incompleta di bisolfito a DNA single-stranded. Qui, descriviamo un protocollo con una digestione enzimatica del DNA con BamHI accoppiato con pipeline di analisi bioinformatica per consentire la quantificazione accurata della citosina i livelli di metilazione nel mtDNA. Inoltre, forniamo le linee guida per la progettazione il primer di sequenziamento di bisolfito specifici di mtDNA, al fine di evitare indesiderabili segmenti nucleare mitocondriale di targeting (NUMTs) inserito nel genoma nucleare.
Introduzione
Il genoma mitocondriale è una struttura circolare, doppio filamento di circa 16,5 kg base (kb), che costituiscono un pesante e un filo di luce. Il genoma mitocondriale è presente in più copie all'interno di ogni cella, maternamente ereditata e codifica componenti essenziali della catena respiratoria complessi1. Simili ai genomi batterici e a differenza di genoma nucleare, il genoma mitocondriale è organizzato in numerose strutture secondarie e terziarie, come strutture a spirale e supercoiled2, che può rendere difficile l'accesso durante la sequenza esperimenti3.
Nel nu....
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Protocollo
1. trattamento degli enzimi di limitazione
- Linearizzare mtDNA trattando totale DNA umano con l'enzima di restrizione BamHI, che taglia in posizione 14258 nel DNA mitocondriale umano.
Nota: Per mouse DNA, utilizzare l'enzima di restrizione BglII in condizioni identiche come di seguito. - Per ogni campione dove la metilazione del DNA mitocondriale è di essere valutati, preparare una provetta di reazione di 0,2 mL e aggiungere il seguente miscela: 3 μg DNA genomico (quantificato dalla fluorometria), 15 µ l tampone 3, 3 μL BamHI e acqua fino a di 150 μL
- Inserire le provette in un termociclatore per 4 h a 37 ° C.
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Risultati
Due punti in questo protocollo sono cruciali durante l'analisi di metilazione del DNA mitocondriale. 1) l'apertura della struttura secondaria e 2) il disegno di primer specifici del DNA mitocondriale.
Digerendo il DNA genomico umano con l'enzima di restrizione BamHI (Figura 1), la struttura di DNA mitocondriale sarà tagliata alla posizione del nucleotide 14.258 e la struttura secondaria sarà aperto........
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Discussione
Qui, forniamo un protocollo del bisolfuro che è specificamente progettato per interrogare la metilazione del DNA mitocondriale. Le differenze con del bisolfuro protocolli utilizzati per DNA genomico si trova nell'utilizzazione di una fase di digestione degli enzimi di limitazione preventiva e un'analisi bioinformatica sentenza fuori falsi positivi derivanti da sequenze di NUMT.
Forniamo un protocollo per evitare artefatti del bisolfuro durante l'analisi di metilazione del DNA mitocondriale. Ma.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nessun concorrenti interessi finanziari di dichiarare.
Ringraziamenti
La Novo Nordisk Fondazione Centro per la ricerca di base metabolica è un centro indipendente di ricerca presso l'Università di Copenaghen, parzialmente finanziato da una donazione senza restrizione della Fondazione di Novo Nordisk.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BamHI | New England BioLabs | # R0136 | |
| Kit di metilazione-fulmine del DNA EZ | Zymo Research | # D5030 | |
| Saggio Qubit ssDNA | Thermo Fisher Scientific | # Q10212 | |
| Provette per test Qubit | Thermo Fisher Scientific | # Q32856 | |
| HotStarTaq più kit DNA polimerasi | Qiagen | # 203603 | |
| Kit di estrazione del gel QIAquick | Qiagen | # 28704 | |
| NEBNext Kit libreria DNA Ultra per Illumina | New England BioLabs | # E7370S | |
| NEBNext Multiplex Oligoes per Illumina | New England BioLabs | # E7335S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | # A63881 | |
| Chip DNA ad alta sensibilità | Agilent | # 5067-4626 | |
| Qubit test dsDNA ad alta sensibilità | Thermo Fisher Scientific | # Q33230 | |
| Kit di reagenti MiSeq v2 300 cicli | Illumina | # MS-102-2003 | |
| Controllo PhiX v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
| Idrossido di sodio | Sigma | # S5881 | |
| Termociclatore C1000 | Biorad | # 1851148 | |
| CFX96 Sistema di rilevamento PCR in tempo reale | Biorad | #1855195 | |
| Qubit Fluorimetro | Thermo Fisher Scientific | # Q33226 | |
| Bioanalizzatore 2100 | Agilent | # G2939BA | |
| Strumento MiSeq | Illumina | # SY-410-1003 |
Riferimenti
- Falkenberg, M., Larsson, N. -G., Gustafsson, C. M. DNA replication and transcription in mammalian mitochondria. Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).
- Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -H., Kaufman, B. A.
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Ristampe e permessi
