Aqui, vamos discutir uma série de protocolos para indução e validação da senescência celular em culturas de células. Podemos focar diferentes estímulos indutores senescência e descrever a quantificação de marcadores comuns associadas a senescência. Nós fornecemos detalhes técnicos utilizando fibroblastos como modelo, mas os protocolos podem ser adaptados para vários modelos de celulares.
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Artigo de método
Indução e validação da senescência celular em células humanas primárias
Neste artigo
Resumo
Resumo
Senescência celular é um estado de prisão permanente ciclo celular ativado em resposta a diferentes estímulos nocivos. Ativação da senescência celular é uma marca registrada de diversas condições fisiopatológicas incluindo supressão de tumor, tecido, remodelação e envelhecimento. Os indutores da senescência celular na vivo caracterizam-se ainda mal. No entanto, uma série de estímulos pode ser usada para promover a senescência celular ex vivo. Entre eles, indutores de senescência mais comuns são exaustão replicative, ionizante e radiação não-ionizante, drogas genotóxicas, estresse oxidativo e demethylating e acetificar agentes. Aqui, iremos fornecer instruções detalhadas sobre como usar esses estímulos para induzir os fibroblastos em senescência. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para diferentes tipos de células primárias e de linhagens celulares, incluindo as células cancerosas. Também descrevemos os métodos diferentes para a validação da indução da senescência. Em particular, focamos em medir a atividade da enzima lisossomal associada a senescência β-galactosidase (SA-β-gal), a taxa de síntese de DNA utilizando o ensaio de incorporação 5-ethynyl-2'-desoxiuridina (EdU), os níveis de expressão do ciclo celular p16 inibidores e p21 e a expressão e secreção de membros do fenótipo secretor Senescence-Associated (SASP). Finalmente, podemos fornecer resultados de exemplo e discutir aplicações desses protocolos.
Introdução
Em 1961, Hayflick e Moorhead relataram que fibroblastos primários na cultura perdem seu potencial proliferativo após sucessivas passagens1. Este processo é causado pelo sequencial encurtamento dos telômeros após cada divisão celular. Quando os telômeros atingir um comprimento curto criticamente, eles são reconhecidos pela resposta DNA-danos (DDR) que ativa uma detenção irreversível da proliferação — também definida como senescência replicative. Senescência replicative é atualmente um dos muitos estímulos que são conhecidos por induzir a um estado de prisão permanente ciclo celular que reproduz células minúsculas de mitógenos e apoptotic sinais<....
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Protocolo
1. preparação geral
- Prepare o suporte de D10. Suplemento DMEM médio-Glutamax com 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina (concentração Final: 100 U/mL).
- Prepare o PBS estéril. Dissolva os comprimidos em água de acordo com as instruções do fabricante. Esterilize em autoclave.
- Prepare 1 tripsina de x. Diluir 5 mL de EDTA de tripsina-Versene/10 x 01:10 em 45 mL de PBS estéril.
Nota: Em todo o protocolo, usamos as condições de cultura de células que estão mais perto a fisiológicas condições de fibroblastos primários. Isto significa que podemos incubar células em 37 ° C e 5% de CO2 , como é normalmente feito mas usando 5....
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Resultados
Enriquecimento de SA-β-gal coloração em fibroblastos senescentes
Β-galactosidase (β-gal) é uma enzima lisossomal que é expressa em todas as células e que tem um pH ótimo de 4.025,26. No entanto, durante a senescência, lisossomos aumentam de tamanho e, consequentemente, as células senescentes acumulam β-gal. O aumento dos montantes desta enzima tornam possível detectar sua a.......
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Discussão
Os protocolos explicados aqui foram otimizados para fibroblastos humanos primários, particularmente células BJ e WI-38. Os protocolos para a senescência replicative, radiação ionizante e doxorrubicina, foram aplicados com sucesso para outros tipos de fibroblastos (HCA2 e IMR90) e em outros tipos de células (nomeadamente neonatais melanócitos e queratinócitos ou cardiomyocytes iPSC-derivado) em nosso laboratório. No entanto, adaptações para tipos de células adicionais podem ser otimizadas ajustando alguns detalhes como o .......
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Agradecimentos
Agradecemos a membros do laboratório Demaria para discussões frutuosos e Thijmen van Vliet para compartilhar dados e protocolo sobre a senescência induzida por UV.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Mídia DMEM - GlutaMAX | Gibco | 31966-047 | |
| Soro bovino fetal | Hyclone | SV30160.03 | |
| Penicilina-estreptomicina (P / S; 10.000 U / ml) | Lonza | DE17-602E | |
| Dimetil Sulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | SC-202581 | |
| Água livre de nuclease (não tratada com DEPC) | Ambion | AM9937 | |
| Balão T75 | Sarstedt | 833911002 | |
| Solução de Tripsina/EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| PBS comprimidos | Gibco | 18912-014 | |
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Corning Tubos de centrífuga de 15 mL | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| placa de 6 poços | Sarstedt | 83.3920 | |
| placa de 24 poços | Sarstedt | 83.3922 | |
| lamínulas redondas de 13 mm | Sarstedt | 83.1840.002 | |
| Steriflip | Merck Chemicals | SCGP00525 | |
| fonte de césio137 IBL | 637 césio-137câmara de radiação UV para máquina de raios gama | ||
| bel BS-02 | |||
| Dicloridrato de Doxorrubicina | BioAustralis Fine Chemicals | BIA-D1202-1 | |
| Solução de peróxido de hidrogênio | Sigma-Aldrich | 7722-84-1 | |
| 5-aza-2'-desoxicitidina | Sigma-Aldrich | A3656 | |
| SAHA | Sigma-Aldrich | SML0061 | |
| Butirato de Sódio | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| X-gal (5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo) | Fisher Scientific | 7240-90-6 | |
| Ácido cítrico monohidratado | Sigma-Aldrich | 5949-29-1 | |
| Fosfato dibásico de sódio | Acros organics | 7782-85-6 | |
| Ferrocianeto de potássio | Fisher Scientific | 14459-95-1 | |
| Ferricianeto de potássio | Fisher Scientific | 13746-66-2 | |
| Cloreto de sódio | Merck Millipore | 7647-14-5 | |
| Cloreto de magnésio | Fisher Chemicals | 7791-18-6 | |
| 25% de glutaraldeído | Fisher Scientific | 111-30-8,7732-18-5 | |
| 16% de formaldeído (p / v) | Thermo-Fisher Scientific | 28908 | |
| EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina) | Lumiprobe | 10540 | |
| Sulfo-Cyanine3 azida (Sulfo-Cy3-Azide) | Lumiprobe | D1330 | |
| Ascorbato de sódio | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Sulfato de cobre(II) pentahidratado ((II)SO4.5H2O) | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| Triton X-100 | Acros organics | 215682500 | |
| base TRIS | Placa Multipoços Roche | ||
| LightCycler 480 384, branca | Folha | de vedação Roche 4729749001 | |
| Lightcycler 480 | Kit Roche | 4729757001 | |
| Sensifast Probe Lo-ROX | Bioline | BIO-84020 | |
| UPL Probe | Library Sigma-Aldrich | Vários | |
| DuoSet IL-6 Humanos ELISA | R& D | D6050 | |
| Bio-Rad TC20 | Bio-Rad | ||
| Lâminas de contagem | Bio-Rad | 145-0017 | |
| Incubadora a seco | Thermo-Fisher Scientific | Heratherm | |
| Dimetilformamida | Merck Millipore | 1.10983 | |
| Parafilm 'M' filme de laboratório | Bemis | ||
| Agulhas | |||
| de |
Referências
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Muñoz-Espín, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).
- Sharpless, N. E., Sherr, C. J.
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Reimpressões e permissões
