Elaborazione batch delle schermate di lievito 2-ibrido consente di confronto diretto tra i profili di interazione delle proteine multiple esca con un insieme molto complesso di proteine di fusione di preda. Qui, descriviamo raffinati metodi, nuovi reagenti e come implementare il loro utilizzo per tali schermi.
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Articolo metodologico
Una schermata di 2-ibrido del lievito in Batch per confrontare interazioni proteina
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo screening per le interazioni proteina-proteina usando il dosaggio di 2-ibrido del lievito è stato a lungo uno strumento efficace, ma il suo utilizzo in gran parte è stato limitato alla scoperta di interattori di alto-affinità che sono altamente arricchito nella biblioteca di candidati interagenti. In un formato tradizionale, il dosaggio di 2-ibrido del lievito può produrre troppo molte colonie per analizzare quando condotto presso stringenza dove potrebbero essere trovati Interactiani bassa affinità. Inoltre, senza un interrogatorio esaustivo e completo della stessa libreria contro esca diversi plasmidi, un'analisi comparativa non possono essere realizzata. Anche se alcuni di questi problemi possono essere risolto utilizzando librerie allinearono preda, il costo e l'infrastruttura necessaria per far funzionare questi schermi possono essere proibitivi. In alternativa, abbiamo adattato il dosaggio di 2-ibrido del lievito per scoprire contemporaneamente decine di transitori e interazioni proteina statico all'interno di un unico schermo che utilizzano una strategia definita profondo (arricchimento dinamico per la valutazione della proteina reti), che incorpora il sequenziamento del DNA di alto-rendimento e calcolo per seguire l'evoluzione di una popolazione di plasmidi che codificano interattori. Qui, descriviamo su misura reagenti e protocolli che consentono un profondo schermo per essere eseguito facilmente e a costi contenuti.
Introduzione
Una comprensione completa dei processi biologici delle cellule si basa sull'individuazione delle reti di interazione della proteina che sono alla base della loro meccanismi molecolari. Un approccio per identificare interazioni della proteina è il dosaggio di lievito 2-ibrido (Y2H), che funziona con l'assemblaggio di un fattore di trascrizione chimerica funzionante una volta due dominii della proteina di interesse associare ad uno altro1. Una tipica schermata di Y2H viene eseguita mediante la creazione di una popolazione di lievito che ospita sia una libreria di plasmidi che codificano le proteine interagenti fuse ad un attivatore trascrizionale....
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Protocollo
1. preparazione di supporti e piastre
Nota: Tutte le piastre devono essere effettuata come minimo 2 giorni prima dell'inizio del protocollo. I mezzi di comunicazione può essere fatto in qualsiasi punto. Tuttavia, il buffer lievito estratto peptone destrosio dell'adenina (bYPDA) deve essere effettuato il giorno in cui verrà utilizzato. Alcuni media è realizzata con un mix di supplemento che contiene un livello di adenina è maggiore di quello che viene in genere utilizzato. Maggior parte dei supplementi media minimi specificare adenina 10 mg/L. I supplementi identificati '+ 40Ade' specificare un totale di adenina 40 mg/L.
- Preparare ....
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Risultati
Il dosaggio di Y2H è stato ampiamente utilizzato per la ricerca di interazioni proteina/proteina e diversi adattamenti e sistemi sono stati sviluppati. Per la maggior parte, le stesse considerazioni che aiutano a garantire il successo con questi approcci precedenti sono importanti per profondo. Sono alcuni dei punti di riferimento importanti: garantire espressione del dominio di legame al DNA proteine di fusione, garantendo un basso fondo di spurie suo + crescita in diploidi contenente l'.......
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Discussione
Qui forniamo una guida per come eseguire le analisi di Y2H in batch utilizzando metodi ottimizzati. Ci sono pochi passaggi critici nella procedura per garantire che la popolazione di lievito che sarebbe stato posto sotto selezione è rappresentante della libreria di partenza e che basta con la popolazione di lievito partenza viene utilizzato per subire la selezione per limitare la variabilità . D'importanza, questi benchmark sono relativamente facili da realizzare a fianco di adattare i metodi e i materiali per un dosaggi.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare
Ringraziamenti
Ringraziamo il personale all'interno l'Istituto di genetica umana per il sequenziamento e preparazione di biblioteca NGS. Ringraziamo Einat Snir per la sua esperienza nella preparazione di frammenti di libreria genomica per la libreria di plasmide Y2H fatta qui. Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health: R21 NIH EB021870-01A1 e da NSF Research Project Grant: 1517110.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Illumina HiSeq 4000 | di sequenziamento profondo | Illumina | |
| Anticorpi monoclonali anti-HA | Biolegend | 901514 Anticorpo primario per rilevare l'espressione di HA nei costrutti pGal4AD Anticorpi | |
| policlonali anti-myc | QED Biosciences Inc | 18826 | Anticorpo primario per rilevare l'espressione di MYC nei costrutti pTEF-GBD NarI |
| New England BioLabs | R0191S | ||
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3236S | |
| XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
| Polietilenglicole 3350, polvere | J.T. Baker | U2211-08 | |
| Salmon Sperm DNA | Trevigen, Inc venduto da Fisher Scientific | 50-948-286 | DNA trasportatore per la trasformazione del lievito Sezione 3.2.1. |
| Kanamicina monosolfato | Research Products International | K22000 | |
| LE Agarose | GeneMate | E-3120-500 | utilizzato per la produzione di gel di DNA agarosio |
| Sodium Chloride | Research Products International | S23025 | |
| Tryptone | Research Products International | T60060 | |
| D-Sorbitolo | Research Products International | S23080 | |
| Acetato di litio diidrato | MP Biomedicals | 155256 | |
| Cloruro di calcio | ThermoFisher | C79 | |
| EDTA Sale di sodio Prodotti | di ricerca internazionali | E57020 | |
| Estratto di lievito in polvere | Prodotti di ricerca internazionali | Y20020 | |
| Lievito base di azoto (solfato di ammonio) senza aminoacidi | International | Y20040 | |
| CSM-TRP-LEU+40ADE | Formedium | DCS0789 | |
| CSM-TRP-LEU-HIS+40ADE | Formedium | DCS1169 | |
| CSM-LEU-MET | Formedium | DCS0549 | |
| CSM-TRP-MET | Bio 101, Inc | 4520-922 | |
| L-Metionina | Formedium | DOC0168 | |
| Adenine | Research Products International | A11500 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International | G32045 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | utilizzato per la produzione di piastre per terreni nella sezione 1 |
| Peptone | Research Products International | P20240 | |
| 3-ammino-1,2,4 Triazole | Sigma | A8056 | |
| 2- Mercaptoehanol (BME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Zymolyase 100T | USBiologico | Z1004 | |
| Fosfato di potassio bibasico | Sigma | P8281 | |
| Fenolo:Cloroformio:IAA | Ambion | AM9732 | |
| Acetato di ammonio | Sigma-Aldrich | 238074 | |
| Ethanol | Decon Laboratories, INC | 2716 | |
| RNAsi A | ThermoFisher | EN0531 | |
| Urea | Research Products International | U20200 | |
| SDS | Research Products International | L22010 | |
| glicerolo | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Tris-HCl | Gibco | 15506-017 | |
| blu di bromofenolo | Amresco | 449 | |
| Kit di clonazione per l'assemblaggio Gibson | New England Biolabs | E5510S | Metodo di assemblaggio rapido per la clonazione di plasmidi nella sezione 2 |
| NEBNext 2x PCR Master Mix New | England Biolabs | M0541S | Utilizzato per l'amplificazione di prodotti per l'assemblaggio Gibson nella sezione 2.3 e per la preparazione del campione per il sequenziamento profondo DEEPN nella sezione 6.2.1 |
| Bromuro di etidio | Amresco | 0492-5G | |
| Kit di purificazione QIAquick PCR | Qiagen | 28104 | Utilizzato per la purificazione dei prodotti pcr nella sezione 6.2.3 |
| Qiaquick Kit di estrazione del gel di DNA | Qiagen | 28704 | Utilizzato per la purificazione del pTEF-GBD digerito nella sezione 2.1 |
| Kit KAPA Hyper Prep Kit | KAPA Biosystems | KK8500 | per il sequenziamento profondo |
| http://www.jcat.de | ottimizzazione del codone | ||
| Ottimizzazione dei codoni | https://www.idtdna.com/CodonOpt | ||
| gBlocks | Integrated DNA Technologies | Frammenti di DNA utilizzati per la clonazione nella Sezione 2.2 | |
| Stringhe | Thermofisher | Frammenti di DNA utilizzati per la clonazione nella Sezione 2.2 | |
| GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit | EPOCH Life Sciences | Utilizzato per preparare quantità di DNA nella Sezione 2.3 | |
| Covaris E220 | Ultra-suonatore ad alte prestazioni | Covaris | |
| oligo nucelotide 5'- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3' | Tecnologie DNA integrate o Thermofisher | utilizzate per l'amplificazione e il sequenziamento della pcr 5' inserto pTEF-GBD durante la costruzione del plasmide | |
| oligo nucelotide 5'-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3' | Tecnologie DNA integrate o Thermofisher | utilizzato per l'amplificazione e il sequenziamento della pcr 5' inserto pTEF-GBD durante la costruzione del plasmide | |
| oligo nucelotide 5'-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTTCC-3' | Tecnologie DNA integrate o Thermofisher | utilizzate per l'amplificazione e il sequenziamento della pcr Inserto da 3' pTEF-GBD durante la costruzione del plasmide | |
| oligonucelotide 5'-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3' | Integrated DNA Technologies o Thermofisher | utilizzati per l'amplificazione e il sequenziamento della pcr 3' insert pTEF-GBD durante la costruzione del plasmide | |
| oligonucleotide 5'-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3' | Integrated DNA Technologies o Thermofisher | 5' Pimer utilizzato per l'amplificazione dell'inserto di pGAL4AD | |
| oligonucelotide 5'-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3' | Integrated DNA Technologies o Thermofisher | 3' Pimer utilizzato per l'amplificazione dell'inserto dell'oligonucelotide pGAL4AD | |
| 5'-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3' | Integrated DNA Technologies o Thermofisher | 5' Pimer utilizzato per l'amplificazione dell'inserto di pGADT7 | |
| oligonucelotide 5'- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3' | Integrated DNA Technologies o Thermofisher | 3' Pimer utilizzato per l'amplificazione dell'inserto del ceppo di lievito pGADT7 | |
| PJ69-4A MatA | http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: librerie genomiche e un ceppo ospite progettato per una selezione altamente efficiente di due ibridi nel lievito. GENETICA 1996 144:1425-1436 | MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7 | |
| pTEF-GBD | Dr. Robert Piper Lab | Gal4-DNA binding doimain espressione plasmide | |
| pGal4AD (pPL6343) | Dr. Robert Piper Lab | Gal4-activation domain expression plasmid | |
| 100 mm Petri plates | Kord-Vallmark venduto da VWR | 2900 | |
| 125 mL pallone di Erlenmeyer | PYREX Fisher Scientific | S63270 | |
| pallone da 250 mL di PYREX Fisher | Scientific | S63271 | |
| 1.000 mL di pallone di Erlenmeyer PYREX | Fisher Scientific | S63274 | |
| pallone di Erlenmeyer da 2.000 mL | Fisher Scientific | S63275 | |
| provetta di coltura monouso da 20 x 150 mm | Thermofisher | 14-961-33 | |
| pipetta-aid | Drummond | 4-000-100 | |
| mL Pipetta sierologica | Denville | P7127 | |
| 10 mL Pipetta sierologica | Denville | P7128 | |
| 25 mL Pipetta sierologica | Denville | P7129 | |
| 1.000 mL PYREX Griffin Beaker | Fisher Scientific | 02-540P | |
| 1.000 mL PYREX Flacone per la conservazione dei terreni riutilizzabile | Fisher Scientific | 06-414-1D | |
| Cilindro graduato da 1.000 mL | Fisher Scientific | 08-572-6G | |
| SpectraMax 190 | Dispositivi | utilizzati per misurare la densità ottica delle cellule | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific Spettrofotometro | ND-2000 | utilizzato per quantificare la quantità di DNA |
| UV elettronico transilluminatore | Ultra Lum | MEB 20 | utilizzato per visualizzare il DNA in un gel di agarosio di bromuro di etidio |
| P1000 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F123602G | |
| P200 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F123601G | |
| P20 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F123600G | |
| P10 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F144802G | |
| 1250 µ L Puntali per pipette a bassa ritenzione | GeneMate | P-1236-1250 | |
| 200 &; Puntali per pipette di ritenzione LLow | VWR | 10017-044 | |
| 10 & Puntali per pipette a bassa ritenzione L XL VWR | 10017-042 | ||
| Provetta conica da 50 mL | VWR | 490001-627 | |
| Provetta conica da 15 mL | Raschietto cellulare VWR | 490001-621 | |
| Denville Scientific | TC9310 | ||
| Provette per microcentrifuga da 1,5 mL | USA Scientific | 1615-5500 | |
| HCl | Fluka Analytical | 318949-1L | |
| NaOH | J.T. Baker | 5674-02 | |
| Applicatori in legno | Solon Care | 55900 | |
| Microcentrifuga Eppendorf 5424 | Fisher Scientific | 05-400-005 | microcentrifuga |
| Sorvall ST16R | Thermo Fisher Scientific 75004381 | centrifuga da banco | |
| Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked Ab intero (da asino) | GE Healthcare | NA934-1ML | Anticorpo secondario |
| Amersham ECL IgG di topo, Ab intero legato a HRP (da pecora) | GE Healthcare | NA931-1ML | Anticorpo secondario |
| SuperSignal West Pico Substrato chemiluminescente | Thermo Fisher Scientific | 34080 | Soluzione di rilevamento ECL |
| Incubatore Isotemp | Incubatore Thermo Fisher Scientific | ||
| Mutitron 2 | INFORS HT | Incubatore a scuotimento | |
| Isotemp Bagno d'acqua a controllo digitale Modello 205 | Fisher Scientific | Bagno d'acqua | |
| Libreria di cDNA di topo Y2H in Y187 (tessuto piatto) | Libreria | Clontech 630482 | disponibile in commercio Libreria |
| di cDNA di topo Y2H in Y187 (cervello di topo) | Clontech | 630488 | libreria di cDNA disponibile in commercio |
| pGADT7 AD Vector | Clontech | 630442 | vettore AD disponibile in commercio che ospita molte librerie di cDNA |
| pGBKT7 DNA-BD Vector Clontech | 630443 | disponibile in commercio DNA-BD Vector | |
| Biolase DNA polimerasi | Bioline | BIO-21042 | DNA polimerasi utilizzata per la sezione 2.4 |
| GeneMate GCL-60 Thermal Cycler | BioExpress | P-6050-60 | pcr |
| TempAssure 0,5 mL provette per PCR | Stati Uniti Scientifico | 1405-8100 |
Riferimenti
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
- Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Mo....
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Ristampe e permessi
