Дифференциация белых и бежевых адипоцитов из жировой ткани сосудистой прародителями медведи потенциал повышения метаболизма ожирения. Мы описываем протоколы для CD34 + CD31 + эндотелиальных клеток изоляции из человеческого жира и последующих в vitro расширения и дифференцировку в белом и бежевом адипоцитов. Обсуждаются несколько нисходящие приложения.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Изоляция, расширение и адипогенном индукции CD34 + CD31 + эндотелиальных клеток от человека сальниковый и подкожной жировой ткани
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Ожирение сопровождается обширной реконструкции жировой ткани главным образом через Адипоцит гипертрофия. Экстремальные Адипоцит роста приводит к плохой ответ на инсулин, местные гипоксии и воспаления. Стимулируя дифференциация функциональных белый адипоцитов из прародителей, радикальные гипертрофия Адипоцит населения могут быть предотвращены, и, следовательно, метаболически здоровье жировой ткани могут быть улучшены наряду с сокращением воспаление. Кроме того стимулируя дифференциация бежевый/коричневый адипоциты, расходование энергии всего тела может быть увеличена, что приводит к потере веса. Этот подход может предотвратить развитие ожирения сопутствующие заболевания, такие как тип 2 диабет и сердечно-сосудистых заболеваний.
Этот документ описывает изоляции, расширение и дифференциации белых и бежевых адипоцитов из подмножества жировых тканях человека эндотелиальных клеток, которые совместно Экспресс CD31 и CD34 маркеров. Метод является относительно дешевым и не является трудоемким. Она требует доступа к человека жировой ткани и подкожные депо подходит для выборки. Для этого протокола, свежие жировой ткани образцов из morbidly ожирением предметы [индекс массы тела (ИМТ) > 35] собраны во время процедур бариатрической хирургии. Использование последовательных immunoseparation стромальные сосудистой фракции, достаточно клетки производятся из всего лишь 2-3 g жира. Эти клетки могут быть расширены в культуре в течение 10-14 дней, может быть криоконсервированных и сохраняют свои свойства адипогенном с пассированый до прохождения 5-6. Клетки обрабатываются в течение 14 дней с адипогенном коктейль, используя сочетание человеческого инсулина и PPARγ агонист Росиглитазон.
Эта методология может использоваться для получения доказательство концепции экспериментов на молекулярные механизмы, которые управляют адипогенном ответы в жировых клетках эндотелия, или для скрининга новых лекарств, которые могут повысить адипогенном ответ направлена либо на белый или бежевый/коричневый Адипоцит дифференциации. С помощью небольших подкожной биопсий, эта методология может использоваться для экрана-ответчик предметам для клинических испытаний, направленных на стимулирование бежевый/коричневый и белый адипоциты для лечения ожирения и сопутствующие заболевания.
Введение
Последние данные показывают, что в мышей и людей, подмножество ячеек, проживающих в сосудистую жировой ткани могут быть продифференцированы в белый или бежевый/коричневый адипоцитов1,2,3. Фенотип таких клеток является предметом споров, с подтверждающей эндотелиальных клеток, гладкие мышцы/перицит или спектр промежуточных фенотипов4,5,6,7. Область разработки этой методологии было проверить адипогенном потенциал CD34 + CD31 + эндотелиальных клеток, из....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Организационного комитета Правления обзор Восточной Вирджинии медицинской школы одобрил исследований и сбора образцах адипозных тканей человека, используемые в исследовании. Обоснованное письменное согласие была собрана из пациентов.
1. Подготовка буферов, средств массовой информации и инструментов
- Подготовить раствор Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered (KRBBS): 135 мм натрия хлорида, 5 мм хлорид калия, магния сульфата 1 мм, 0,4 мм калия фосфат двухосновной, 5,5 мм глюкозы, 1 мм аденозина, 0,01% антибиотик/противогрибковое микс (50 мкг/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, 30 мкг/мл гентамицина, амфотерицин 15 нг/мл) и 10 мм HEPE....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Наш протокол направлен на обеспечение в vitro подход для определения адипогенном потенциал CD34 + CD31 + сосудистой клетки из разных депо жировых тканях человека. Упрощенная схема схема изображена на рисунке 1A. Первый шаг, используя положительный выбор CD34 выражая клеток приводит к > 95% CD34 + клеток в населенности свежевыделенных клеток (рис. 1A). Важно отметить, что этот маркер теряется после того, как клетки кул.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В центре внимания настоящего документа – обеспечить методологию для изоляции, расширения и адипогенном индукции CD34 + CD31 + эндотелиальных клеток от висцеральных и подкожные депо жировых тканях человека.
Методологии были зарегистрированы для изоляции эндотелиальных клеток из различных сосудов кровати грызунов или людей, которые связаны главным образом методы с использованием антител CD31 дневно помечены или в сочетании с магнитной бусины18,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Авторы хотели бы отметить Бекки Маркес, клинических координатором в центре Sentara лечение ожирения, для ее помощи с процессом скрининг и согласие пациента. Это исследование было поддержано R15HL114062 АНКА D. Dobrian.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Large Equipment | |||
| Кабинет биобезопасности | Nuaire | nu-425-400 | |
| Инкубатор для клеточных культур | Thermo-Fisher Scientific | 800 DH | |
| Водяная баня | Forma Scientific | 2568 | Reciprocal Shaker |
| RT-PCR Machine | BIO-RAD | CFX96-C1000 | |
| Electrophoresis Box | BIO-RAD < | p>Mini PROTEAN 3 Cell | |
| Transblot Box | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell < | |
| p>Electrophoresion Power Supply | BIO-RAD | PowerPac Basic | |
| ELISA Reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | |
| Blot Reader | LI-COR | Odyssey | Near Infrared |
| Рефрижераторная центрифуга | Eppendorf < | p>5810 R | |
| Tabletop Centrifuge | Eppendorf | MiniSpin Plus | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | BX50 | |
| Inverted Microscope | Nikon | TMS | |
| KRBSS Buffer | |||
| HEPES < | p>Research Products International | H75030 | |
| <>Натрия бикарбонат < | >Сигма-Олдрич | <>792519 | |
| <р>Кальция хлорида дигидрат | <>Сигма-Олдрич | <р>С7902 | |
| Калийфосфат моноосновный | <р>Сигма-Олдрич | <>Р5655 | |
| <>Сульфат магния | <>Сигма-Олдрич < | >М2643 | |
| <>Натрия хлорид | <>Сигма-Олдрич | <>746398 | |
| <>Моногидрат фосфата натрия | <>Сигма-Олдрич | <>С9638 | |
| <>калия хлорид | <>Сигма-Олдрич | <>П93333 | |
| <>Глюкоза | <>Акрос Органикс | <>410950010 | |
| <>Аденозин | <>Акрос Органикс | <>164040250 | |
| <> бычья сыворотка альбумин | <>GE Здравоохранение Био-Науки | <>SH30574.02 | |
| <>ппенициллин/стрептомицин | <>Thermo-Fisher Scientific | <>15070063 | |
| <><стронг>Тканальное пищеварение < | |||
| р>20 мл шприца | <>Глобал Медикал | <> 67-2020 | |
| <>Нейлоновая сетка, 250 &м; м | <>Сефар | <>03-250/50 | |
| <>Иглы для пипеток | <>Поппер | <>7934 <> | |
| Тонкие ножницы | <> Инструменты для тонкой науки | <>14058-11 | |
| тканевые щипцы | <> Джордж Тиманн & Co | 160-20 | |
| Collagenaza, тип I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Чашки Петри, 100 мм | США Scientific | 5666-4160 | TC Treated |
| Eppendorf Tubes, 1,5 мл | <>США Scientific | <>1615-5500 | |
| <>конические пробирки, 15 мл | <>Nest Scientific | <>601052 | |
| <>конические пробирки, 50 мл | <>Nalgene | <>3119-0050 | |
| <>сцинтилляционные флаконы | <>Кимбл | <с>74505-20 | <>тканевые кости |
| <><с> изоляция клеток<> | |||
| <>челлометр | <>нэкселом < | >Авто 2000 | |
| <>с Слай<ки на > | <>Неexcelom | CHT4-SD100-002 | |
| Cellometer Viability Stain | Nexcelom < | p>CS2-0106-5mL | Acridine Orange/Propridine идий Йод |
| <>анти-CD34 магнитные шарики | <>Технологии стволовых клеток | <>18056 | <>Кит |
| <> EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| Anti-CD31 Пластиковые шарики | pluriSelect США | 19-03100-10 | |
| pluriSelect 10x Wash Buffer | pluriSelect США | 60-00080-10 < | |
| p>pluriSelect Соединительное кольцо< > | pluriSelect США | 41-50000-03 < | |
| p>pluriSelect Detach Buffer | pluriSelect США | 60-00046-12 < | |
| pluriSelect Incubation Buffer | pluriSelect США < | p>60-00060-12 | |
| pluriSelect S-клеточный фильтр | pluriSelect США | 43-50030-03 < | |
| p>Cell Culture | |||
| 6-луночные планшеты | США Scientific | CC7682-7506 | TC Treated |
| 4- хорошо камерные слайды | <>Corning Life Sciences | <>354559 | <>пс фибронектиновым покрытием |
| <>4-луночные горки | <>Thermo-Fisher Scientific | <р>154526ПК | <р> непокрытое стекло |
| <> жировые микрососудистые эндотелиальные эндотелиальные клетки человека (HAMVEC) | Sciencell Research Laboratories | 7200 | Primary Cell Line |
| Endothelial Cell Media (ECM) | ScienCell Research Laboratories | 1001 | Complete Kit |
| DMEM/F12 Basal Media | Thermo-Fisher Scientific | <>11320082 | |
| <>Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (ФБС) | <>Роки Маунтин Биологи < | >ФБС-ББТ < | |
| Инсулин < | >Лилли | <>У-100 | <>Хумалог |
| <>Росиглитазон < | >Сигма-Олдрич | R2408 < | |
| p>Cell Analysis | |||
| Oil Red O Dye | Sigma-Aldrich | O0625 | Приготовлено в изопропаноле |
| 96 луночных планшетах | США Scientific | 1837-9600 | |
| <>96 луночные ПЦР-планшеты | <>Genesee Scientific | <>24-300 | |
| <>РНК Экстракция | <>Zymo Research | <>р2072 | <>Кит < |
| > синтез кДНК | <>БИО-РАД | 1708841 | Supermix |
| JumpStart PCR Polymeraza | Sigma-Aldrich | D9307-250UN | Hot start, with PCR Buffer N |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | M8787-5ML | 3 мМ конечная в реакции ПЦР |
| <>дНТП | <>Промега < | >У1515 < | |
| Такман АдипоQ < | >Thermo-Fisher Scientific | <>Hs00605917_m1 | |
| <>Такман CIDEA | <>Thermo-Fisher Scientific | <>Hs00154455_m1 | |
| <>ТакМан РПЛ27 | <>Термо-Фишер Научный < | >Hs03044961_g1 | |
| <>Такман UCP1 | <>Термо-Фишер Научный | <>Hs00222453_m1 | |
| <>ВСА Анализ | <>Сигма-Олдрич | <>QPBCA-1KT | <>Кит |
| <>бис-акриламид | <>БИО-РАД | <>1610146 | <>40% стоковый раствор<> |
| <>аммония персульфат | <>БИО-РАД | <>1610700 | |
| ТЕМЕД | <>БИО-РАД < | >1610800 | |
| <>Трис | <>Сигма-Олдрич | <>Т1503 | |
| <>глицин | <>БИО-РАД < | >1610718 | |
| <> додекал сульфата натрия < | >сигма-Олдрич | <>Л3771 < | |
| пЭДТА ЭДТА | <>Фишер Сайн | <>С311С311-100 | |
| <>бромфенол синий | <>Сигма-Олдрич | <>В8026 <> | |
| Блот-мембрана < | >ЭМД Миллипор | <>IPFL00010 | |
| <>метанол | <>Фишер Сайентификал | <>А452-СК4 | |
| Одиссея Блокирующий буфер, трис | <>ЛИ-КОР | <>927-50000 < | |
| p>Anti-AKT антитело | Cell Signaling Technology | 2920S | Mouse monoclonal |
| Anti-pAKT антитело | Cell Signaling Technology | 9271S < | p>Rabbit polyclonal |
| Anti-UCP1 антитело | Abcam | <5p>ab10983 | Rabbit polyclonal |
| Anti-Mouse IgG антитела | LI-COR | 926-68070 | Goat Polyclonal, IRDye 680RD |
| Anti-Rabbit IgG антитела | LI-COR | 926-32211 < | p >2Козий поликлональный, IRDye 800CW |
| <>антикроличьи антитела IgG | <>джексон ImmunoResearch | <>111-025-003 | <> козий поликлональный, TRITC |
| Phosphate Buffer Salt Salt | Thermo-Fisher Scientific | 10010049 | |
| 37% раствор формальдегида | Electron Microscopy Sciences | 15686 | 4% раствор для фиксации клеток |
| Нормальная козья сыворотка | Vector Laboratories | S-1000 | 10% блокирующий раствор |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | 0,1% раствор для пермеабилизации |
| DAPI < | p>Thermo-Fisher Scientific | D1306 | |
| Calcein AM | Thermo-Fisher Scientific | p65-0853-39 | Cell fluorescent visualization |
| Matrix Basement Membrane Matrix | Corning Life Sciences | 356231 | Фактор роста снижен |
| DiI меченый ацетилированный ЛПНП | <>Термо-Фишер Научный | <>л3484 |
Ссылки
- Tang, W., et al. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322 (5901), 583-586 (2008).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metaboli....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
