Qui, presentiamo un protocollo per eseguire un'analisi quantitativa del livello di associazione di membrana plasmatica per etichetta fluorescente marginalmente-collegata della proteina. Il metodo si basa sulla decomposizione computazionale della membrana e citoplasmatico componente del segnale osservato in cellule identificate con marcatore fluorescente della membrana plasmatica.
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Articolo metodologico
Determinazione della membrana plasmatica di partizionamento per marginalmente-associated Proteins
In questo articolo
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Sommario
Abstract
Questo metodo fornisce un approccio veloce per la determinazione della membrana plasmatica di partizionamento di qualsiasi proteina fluorescente contrassegnati perifericamente associata utilizzando i profili di intensità di fluorescenza attraverso la membrana plasmatica. Profili di fluorescenza misurata sono dotati di un modello per la distribuzione di fluorescenza di membrana e citoplasma lungo una linea applicata perpendicolarmente alla periferia delle cellule. Questo modello è costruito dai valori di intensità di fluorescenza in celle di riferimento che esprime un indicatore fluorescente contrassegnati per citoplasma e con FM 4-64-labeled membrana plasmatica. Il metodo può essere applicato a vari tipi di cellule e organismi; Tuttavia, solo il plasma membrane delle cellule vicine non possono essere valutate. Questo metodo veloce basata su microscopia è adatto per esperimenti, dove sono attesi cambiamenti sottili e dinamici dei marcatori di membrana-collegato e necessità di essere quantificati, per esempio, nell'analisi delle versioni mutanti delle proteine, trattamenti inibitore, e osservazioni di trasduzione del segnale. Il metodo viene implementato in un pacchetto di R multi-piattaforma che è accoppiato con una macro di ImageJ che funge da un'interfaccia user-friendly.
Introduzione
Proteine di membrana plasmatica perifericamente associata sono i componenti chiave delle vie di segnalazione delle cellule. Uno dei loro ruoli fondamentali è la loro membrana plasmatica transitoria associazione e dissociazione, che è importante per la trasduzione del segnale tra membrana e citoplasma. Proteine della membrana di plasma perifericamente associata possono essere attaccati sulla membrana plasmatica dagli ancoraggi del lipido (N-miristoilazione, S-acilazione o prenilazione) o dai domini di legame dei lipidi (interagendo con fosfatidilinositolo fosfati, acido fosfatidico, ecc).
Associazione di membrana plasmatica le prop....
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Protocollo
1. preparazione del materiale biologico
- Preparare il materiale biologico che esprimono la proteina fluorescente contrassegnata di interesse, come pure un marker citoplasmatico. Seguire le procedure menzionate nell'introduzione.
2. confocale a scansione Laser
- Macchiare il materiale preparato in sezione 1 con FM 4-64 tintura7.
- Applicare un protocollo di colorazione che è appropriato per il materiale studiato. Per le celle di tabacco BY-2, macchia 200 µ l di sospensione cellulare con 0,2 μL di 10 mM FM 4-64 soluzione in dimetilsulfossido.
Nota: La concentrazione di coloraz....
- Applicare un protocollo di colorazione che è appropriato per il materiale studiato. Per le celle di tabacco BY-2, macchia 200 µ l di sospensione cellulare con 0,2 μL di 10 mM FM 4-64 soluzione in dimetilsulfossido.
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Risultati
DREPP10 è una proteina specifica pianta perifericamente associata-membrana plasmatica che è associata con la membrana plasmatica tramite un N-miristoilazione e un'interazione elettrostatica con fosfatidilinositolo fosfati11, 12. DREPP è stato descritto come un componente del macchinario di segnalazione del calcio nella cellula vegetale e interagisce anche con il citoscheletro13.......
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Discussione
Il metodo qui descritto genera una stima più accurata della membrana plasmatica di partizionamento per proteine marginalmente associate rispetto ad altri approcci basati sulla misura di intensità di fluorescenza5. Il miglioramento notevole di questo metodo è che prende in considerazione la diffrazione della luce e la sovrapposizione di membrana del plasma e i segnali citoplasmatici. Anche se questi risultati del metodo sono in correlazione con i risultati di un metodo semplice, basato sul confront.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo progetto è stato supportato da NPU ho, LO1417 (Ministero della pubblica istruzione, gioventù e sport della Repubblica Ceca).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| FM 4-64 | ThermoFisher Scientific | T13320 | Colorante a membrana plasmatica |
| Dimetilsolfossido | Sigma-Aldrich | D4540 Sigma | Solvente colorante |
| Attrezzatura ordinaria (vetrini microscopici, pipette, puntali, tubi) | Attrezzatura per marcatura cellulare e microscopia | ||
| Microscopio | |||
| Computer ordinario |
Riferimenti
- Barbosa, I. C. R., Shikata, H., Zourelidou, M., Heilmann, M., Heilmann, I., Schwechheimer, C. Phospholipid composition and a polybasic motif determine D6 PROTEIN KINASE polar association with the plasma membrane and tropic responses. Development. 143 (24), 4687-4700 (2016).
- Kato, M., Aoyama, T., Maeshima, M. The Ca2+-binding ....
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins
Posted by JoVE Editors on 11/02/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins. The Affiliations section was updated.
One of the affiliations was updated from:
Department of Experimental Plant Biology, University of Science, Charles University
to:
Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University
