Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

שיטות הגילוי של תרכובות הרומן להתכוונן קולטן גאמא אמינו בוטירית הקלד עצבית

Published: August 16, 2018 doi: 10.3791/57842
Automatic Translation
1, 1, 2
1Discovery Neuroscience, Pharma Research and Early Development, Roche Innovation Center Basel, 2HiQScreen Sàrl 6

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לגלות תרכובות פעיל קולטני GABAA , מן הכריכה פיזיולוגיה, פרמקולוגיה.

Abstract

זה מציג כתב יד פרוטוקול צעד אחר צעד לסינון תרכובות-גמא-aminobutyric חומצה סוג של קולטנים (GABAA) והשימוש בה לקראת הזיהוי של הרומן מולקולות פעילים מבחני פרה מ רקומביננטי במבחנה הקולטן והשפעותיהם תרופתי-קולטנים יליד פרוסות המוח מכרסמים. עבור תרכובות מחייב באתר בנזודיאזפינים של הקולטן, הצעד הראשון הוא להגדיר מסך ראשי המורכב בפיתוח מבחני הכריכה radioligand על קרום התא לבטא את תת-סוגי GABAA מז'ור. לאחר מכן, תוך ניצול של הביטוי heterologous של קולטני GABAA מכרסמים ואנושי oocytes צפרדע רפואית או תאים HEK 293, זה אפשרי לחקור, במבחני אלקטרופיזיולוגיות, המאפיינים הפיזיולוגיים של הקולטן שונים תת והמאפיינים תרופתי של תרכובות שזוהה. מערכת oocyte צפרדע רפואית , יוצגו כאן, החל הבידוד של oocytes את, microinjection שלהם עם mRNAs שונים, עד האפיון תרופתי באמצעות מלחציים שני-אלקטרודה מתח. לבסוף, הקלטות שנערכו פרוסות המוח מכרסמים יתוארו המשמשים פיזיולוגיים כמבחן משני כדי להעריך את הפעילות של מולקולות ב שלהם יליד קולטנים עצביים במעגל מוגדרים היטב. הקלטות חוץ-תאית באמצעות תגובות האוכלוסייה של נוירונים מרובים מודגמות יחד עם הבקשה סמים.

Introduction

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים על הגילוי של חומרים פעילים על קולטני GABAA , מן הכריכה פיזיולוגיה, פרמקולוגיה. חפש את הרומן מולקולות ספציפיות עבור קולטני GABAA , זה חיוני כדי להגדיר במדויק ככל האפשר, סוג המשנה של עניין את ההערכה של יחודיות של תרכובות שזוהה (ראהלמשל, לסקירה, רודולף ו Knoflach1או Sieghart2). נתיב אופייני. גילוי סמים ואת הצעדים שצריכים להיות מושגת מומחשים באיור1.

מבחני הכריכה, משמשים עדיין בעיקר בשלב הראשון של גילוי תרופות. במקרה של קולטני GABAA , והם ממוטבים לזהות תרכובות לאגד אתר איגוד בנזודיאזפינים של הקולטן איפה לאגד רפואית שימושי ובטוח סמים. טכניקות אחרות, באמצעות fluorometric הדמיה צלחת הקורא (FLIPR) ממברנה פוטנציאליים מבחני מבוסס-צבען אדום3, לזהות תרכובות כמו ברביטורטים לאגד לאתרים נוספים שהן לא רצויות בשל הפרופיל שלהם-לוואי בלתי רצויות. בנוסף, שימוש צבעים ניתן ישירות להפעיל קולטני GABAA , וכך לחקור את התועלת של אלה מבחני. גילוי סמים4. איגוד מבחני יכול לספק רק את הראיות זה תרכובת נתון באפשרותך לאגוד בשיעור קולטן ספציפי. במבחנה מבחני עם קרום התא משמשים לזיהוי האדם סלקטיבי GABAA α5β3γ2 קולטן ליגנדים. Transiently transfected תאים HEK293 לבטא את האדם GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 ו α3β3γ2 רצפטורים משמשות היכונו ממברנות מבחני אלה. השפעת ליגנדים מזוהה על ידי מדידת את נצנוץ של פלומאזניל [3H] מחויב על קולטני ממברנה (עיכוב של איגוד פלומאזניל [3H]). היתרון העיקרי של שיטה זו הוא כי החלטה מהירה ויעילה של אהדה המתחם מחייב על הקולטן עניין מספק את הקולטן של עניין.

מחקרים פונקציונלי חיוניים כדי להעריך את פעילות פונקציונלית של תרכובות, להציע הסבר פיזיולוגי ותרופתי של המנגנונים נגרם על-ידי הכריכה של תרכובות הקולטנים. . היום, זה מוכרת היטב כי פונקציונלית קולטני GABAA הם תוצאה של ההרכבה של חמישה subunits סביב ציר של pseudosymmetry שהוקמה על ידי נקבובית יונית תוצאת מההרכבה חמש subunits זהים. רוב קולטני GABAA מורכבים של שניים או יותר subunits שונים. הקולטן נכשלים GABAA , למשל, מורכבת subunits α1, β2 γ2 ב סטויכיומטריה של 2, 2, ו-1 בהתאמה5,6. שיחזור מערכת המחשב המארח כמו צפרדע רפואית oocytes או תאים HEK293 מציעה את האפשרות במהירות לחקור את מאפייני קולטני תרופתי.

המאפיינים תרופתי של תרכובות נידונות ואז עם הקלטות חוץ-תאי המוח פרוסות7. שיטה זו מאפשר חקירה של ההשפעה של תרכובות על עצבית והוא מספק דרך יעילה כדי לאשר את ההשפעות פונקציונלי של תרכובות נחוש במערכות heterologous ביטוי ברמה של רצפטורים מקורי הכולל סביבת עצביים. GABAergic עצבית יכולה גם להיות מוערך ברמה המולקולרית על ידי מדידת ההשפעות של תרכובות על זרמי postsynaptic מעכבות (IPSCs)8. אבל הפרוטוקול המשמש כאן, המבוסס על הקלטות מלחציים תיקון שלם-תא פרוסות המוח הוא משוכלל יותר ותשואות של תפוקה נמוכה יותר.

לבסוף, היתרונות והחסרונות של ה במבחנה הקרנת אשד המשמש לצורך זיהוי ליגנדים α5β3γ2 סלקטיבית נדונים בפרספקטיבה של הטכניקות השונות והמגבלות מהותי שלהם. עבודה זו צריכה לספק מומחים שאינם מומחים בתחום של קולטני GABAA סקירה מועיל של השילוב בין גישות שונות במבחנה המשמש כדי להתמודד עם גילוי מאפננים החדש של תעלות יונים ממותגת ליגנד אלה.

Protocol

צפרדע רפואית זריזה שוכנו, מטופלות במסגרת ההנחיות חיה בקנטון ז'נבה.

1. Radioligand איגוד

  1. הכנת צלחת assay
    1. להכין 1.5 ליטר assay מאגר עם 5 מ מ אשלגן כלורי, CaCl 1.25 מ מ2, מ מ 1.25 MgCl2, 120 מ"מ NaCl, 15 מ מ. טריס; להתאים את ה-pH עם HCl כדי 7.4.
    2. הכנת תרכובות להיבדק אצל 50.76 מיקרומטר (למשל, µL 5 מתחם-10 מ מ לתוך מאגר assay µL 980 צינור microcentrifuge). מערבבים אותם טוב באמצעות מכונת מערבולת במהירות גבוהה במשך 2-5 s.
    3. היכונו לדילול קדם פלומאזניל מתחם הפניה על-ידי pipetting µL 1 של המתחם (10 מ מ) 1,970 µL assay מאגר. מערבבים אותם טוב באמצעות מכונת מערבולת במהירות גבוהה במשך 2-5 s.
    4. לדלל פלומאזניל [3H] פתרון מניות עם המאגר assay ב 4 ° C ל- 4 nM צינור פוליפרופילן 50 מ ל.
    5. פיפטה 50 µL/טוב של מאגר assay לעמודות 1 ו- 3 – 11 של microplate 96-ובכן כפי שמוצג בפריסה צלחת מיוצג באיור2.
    6. פיפטה 73.2 µL של תרכובות מדולל ב 50.76 מיקרומטר (ראה שלב 1.1.2) לתוך עמודה 12 של הצלחת.
    7. לדלל כל המתחם, באמצעות גיאומטרי של מעל 9 שלבים (1E-10 – 1E–06 M), עם µL העברת נפח 23.12, מילוי עמודות 3-11. מערבבים הדילול ביסודיות. לשנות את הטיפ לאחר דילול בכל.
  2. לדלל לקרום התא
    1. להפשיר את קרום התא בעבר מבודד של HEK293 overexpressing האנושי GABAA קולטן (0.025 – 0.15 mg/mL) לקבל 80 מ ל טמפרטורת החדר (RT) ולהעביר את המתלים למאגר assay ב 4 º C.
    2. Resuspend הפתרון ממברנה עדיין ב 4 ° C עם מהמגן רקמה עבור 30-40 s ב- 10,000 – 12,000 סל"ד.
  3. לדלל דיאזפאם עבור הפקד מחייב שאינם ספציפיים (נאצית)
    1. לדלל 4 מ מ דיאזפאם פתרון מניות עם המאגר assay כדי ריכוז של 40 µM ב 5 מ.
  4. מתחיל את התגובה
    1. פיפטה 50 µL של 4 nM [3H] פלומאזניל לבאר כל צלחת 96-ובכן ולשמור אותו במיכל מי קרח.
    2. להוסיף 100 µL של קולטן GABAA סוג של ממברנות התכשיר יש ריכוז חלבון של 0.5 מ"ג/מ"ל.
    3. פיפטה 50 µL של 40 מיקרומטר דיאזפם לתוך עמודה 2.
    4. דגירה את הצלחת. בשביל h 1 על קרח.
    5. מוסיפים 50 µL assay מאגר כל טוב של צלחת 96-ובכן מסנן עבור הבאים ממברנה ההפרדה ו רדיואקטיביות מדידה, לעצור את תגובת לאחר מכן.
  5. לעצור את התגובה
    1. להכין מאגר כביסה עם 50 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4.
    2. לסנן את הפתרון באמצעות קומביין תא 96-ובכן. לשטוף את הצלחת 3 x עם 300 µL כביסה קרה כקרח מאגר לכל טוב.
    3. לאטום את התחתית לצלחת עם סרט פלסטיק ולהוסיף µL 40 של נצנוץ קוקטייל עבור נוזל נצנוץ לספור בכל טוב ואני לנגב את זה עם אתנול 70%.
    4. לנער בעדינות את הצלחת. בשביל לפחות שעה-RT. ומשהים לפחות לעוד שעה-RT.
    5. למדוד הרדיואקטיביות (ב CPM) על-ידי הצבת את הצלחת על השיש במטבח נצנוץ. לאפשר המדידה למשך 3 דקות לכל טוב.
  6. ניתוח נתונים
    1. לקבוע. המשמעות של 8 ושכפול של איגוד שאינם ספציפיים (נאצית), סה כ הכריכה (TB) כמו גם באשר כפילויות או triplicates של הדגימות. לחישוב של % מסוים הכריכה (SB) הממוצע של כל דגימה לפי המשוואה הבאה:
      Equation 1
      כאן,
      SB סה כ = מהשחפת כלומר מינוס מתכוונת נאצית.
    2. להתוות abscissa SB % לעומת ב כפוף ריכוז המעכב. מתאים נתונים באמצעות המשוואה ניתוח תחרות אתרים אחד:
      Equation 2
      כאן,
      y = האחוזים של SB,
      A = המינימום של y,
      B = המרבי של y,
      C = ה IC50,
      X = יומן10 של הריכוז של המתחם מתחרות,
      D = המדרון של העקומה (מקדם היל).
    3. לחשב את זיקה מחייבת (Ki) באמצעות ריכוז מעכבות מקסימלי (IC50), חצי קבוע דיסוציאציה (Kd) [3H] פלומאזניל בהתאמה ממברנות9, ואת הריכוז [3H] פלומאזניל ב וזמינותו לפי נתונים באמצעות המשוואה הבאה:
      Equation 3

2. קולטן ביטוי והקלטות של צפרדע רפואית Oocytes

  1. השחלות קציר והכנות oocyte
    1. להכין את הפתרון בארס סטרילי עם 88 מ מ NaCl, 1 מ"מ אשלגן כלורי, NaHCO 2.4 מ מ3, 10 מ מ HEPES, מ"מ 0.82 MgSO4.7H2O, 0.33 מ מ Ca (3)2.4H2O ו- 0.41 מ מ CaCl2.6H2O, ב- pH 7.4 , בתוספת 100 יחידות/mL של פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 100 ו 0.25 mL/µg של b. שהוא גוסס
    2. להכין את המדיום x OR2 1 (אין CaCl2) עם מ מ 88.5 NaCl, 2.5 מ מ אשלגן כלורי, 5 מ מ. HEPES, מ מ 1 MgCl2.6H2O, ב- pH 7.4.
    3. קורבן זריזה צפרדע רפואית נשית על ידי הרדמה עמוקה למשך 20 דקות מקורר Tricaine methanesulfonate (בריכוז של 150 מ ג/ליטר, מותאם ב- pH 7.4), סודיום ביקרבונט (300 mg/L) ואחריו עריפת ראש.
    4. הקציר השחלות במהירות עם מספריים נקיים וחדים ולמקם אותם ב 2-פטרי (10 ס מ) מלא עם 40 מ ל 1-פתרון בארת ואנטיביוטיקה/antimycotic.
    5. לאחסן את השחלות שאינם הפומבית עד 2 שבועות בפתרון בארס-4 מעלות צלזיוס.
    6. עבור הדיסוציאציה, לחתוך את השחלות עם סכין גילוח נקי בחלקים קטנים (1-2 ס מ3), דגירה אותם ב- 50 מ של ניתוח 2 בינוני ללא CaCl2 (ניתוח 2-noCaCl2) המכיל 0.2% collagenase (סוג)-17-19 מעלות צלזיוס ב ספינר 100 מ ל את הבקבוק עם עצבנות איטי במשך 4-5 ח' ודא הבר מגנטי הוא ממוקם כ 3-5 ס מ מעל החלק התחתון של הבקבוק טווה להימנע מוחצת את oocytes.
    7. לאחר 4-5 ה', ודא כי רוב oocytes שהתפנה מ שלהם זקיק (קרי, הם שוחים מסביב בנפרד). לשטוף אותם 5 x עם 200 מ של ניתוח 2 בתוספת 1.8 מ"מ CaCl2.
    8. להעביר את defolliculated oocytes על צלחות פטרי (10 ס מ) מלא בארס פתרון, אנטיביוטיקה/antimycotics ולשמור אותם לפחות ללילה ב 17 ° C לפני הזריקה cDNA או ה-mRNA.
    9. ביום הבא, בחר, תחת התאום, oocyte בריא הצגת ברורות בעלי חיים לעומת מוט vegetal (חום כהה על המוט בעלי חיים לעומת האור הצהוב על המוט vegetal). השתמש פיפטות פסטר נקי ועושה את oocytes אחת לצלחת סטרילי חרוט 96-הזרקת טוב.
      הערה: אין טיפול מיוחד נדרש על המיקום של oocytes על הזריקות mRNA; בעוד על הזריקות cDNA, היא הכרחית כדי להציב את oocytes עם הקוטב החיה פונה כלפי מעלה.
  2. הזרקת באופן אוטומטי mRNA או cDNA
    1. לסנתז את mRNAs באמצעות ערכת זמינים מסחרית ההוראות המומלצת. לנקות את הכלים ואת הטבלה עם RNase וללבוש את כפפות מגן מתאים.
      הערה: האיכות של ה-mRNA דטרמיננטה להניב ביטוי טוב, היא הכרחית כדי למנוע השפלה mRNA במהלך ההליך הזרקה.
    2. להכין cDNAs באמצעות ערכת זמינים מסחרית, לפזר את הסכום הרצוי במים bidistilled-ריכוז של 0.2 µg/µL.
    3. להזריק 10 – 50 nL של פתרון ה-mRNA-ריכוז של 0.2 nL µg/µL או 10 של פתרון cDNA ריכוז הנעים בין 0.02-0.2 µg/µL, רצוי בקבוצות 95 oocytes.
    4. על הממברנה חלבונים הדורשים subunits מרובים (קרי, קולטני GABAA α1β2γ2 heteromeric), מערבבים את mRNAs המתאים או cDNAs ביחס הרצוי (קרי, 1:1:1 או 1:10:1).
    5. לשמור את oocyte ב 17 ° C כדי למנוע הביטוי של חלבונים הלם חום על ידי oocytes; אחסן את microplate אזור אחסון תרמי.
    6. להמיס את תרכובות מבחן אשר נבדקו חיובי וזמינותו מחייבת בניתוח 2 ב 0.1 – 1,000 מיקרומטר להקלטות אלקטרופיזיולוגיות ולחסל אותם לתוך צלחת פוליפרופילן בתחתית שטוח 96-ובכן.
  3. פלסמידים לביטוי
    1. בצע את חוברות הדרכה של ערכות זמינים מסחרית לסינתזה mRNA עם חיידקי באמרגנים T7 או T6, הופך µL 20 של פתרון-0.2 µg/µL במים נטולי RNase.
    2. להכין µL לפחות עשרים של פתרון שמכיל וקטור ביטוי איקריוטים עבור הביטוי cDNA, בדרך כלל 0.2 µg/µL מומס במים bidistilled.
  4. Microinjection Oocyte, ויזואליזציה של איכות שלה
    1. להזריק 10 – 50 nL של התמיסה המכילה פלסמיד (ראה שלב 2.3.1 או 2.3.2) באמצעות מחט מיקרו-הזרקת זכוכית בקוטר עצה הנעות עד 100 מיקרומטר רכוב על micromanipulator מאובזר עם מערכת הפליטה בלחץ או עם מערכת הזרקה אוטומטית.
      הערה: בדוגמה שנדונו כאן, oocytes מוזרקים על ידי קבוצות של 95 עם מערכת אוטומטית מתאים לשימוש עם cDNA או ה-mRNA.
    2. למלא את המחט הזרקת µL 1 של צבע כגון מתילן כחול-1%, להזריק את oocytes באמצעות הליך רגיל (או בגרעין עבור cDNA בציטופלסמה של mRNA).
    3. השלך את oocytes מוזרק עבור 1 דקות במים רותחים. לחצי את oocytes עם סכין גילוח תחת משקפת.
      הערה: לצבוע יישאר מקומי כפי שמוצג באיור 3E, המאפשר אבחנה מדויקת של הזריקה.
  5. שני-אלקטרודה מתח קלאמפ הקלטות
    1. מקם את הצלחת טוב המכיל את oocytes על מערכת ממוכנת, העושה את העיקרון מאויר באיור4.
      הערה: בניגוד למערכת מלחציים תיקון מאויר באיור5, פוטנציאל ממברנה נכון של התא נקרא על ידי האלקטרודה מתח.
    2. תוכנית מערכת הקלטה אוטומטית באמצעות ממשק מבוסס על סמלים עם, לדוגמה, ערכת מאויר באיורים איור 6 מצפני הגומלין פעילות ריכוז.
  6. פריסטלטיות
    1. לנתח את התוצאות בעזרת תוכנה מתאימה, באמצעות עקומת הפעלה ריכוז מאויר, להתוות את משרעת הנוכחי כפונקציה של הלוגריתם של ריכוז אגוניסט.
    2. להתבונן העקומה sigmoidal זה יכול להיות מצויד לאחר מכן עם המשוואה היל אמפירית את הטופס:
      Equation 4
      כאן,
      Y= השבר של הנוכחי עורר,
      EC 50 = הריכוז עבור הפעלה של 50%,
      x = הריכוז של המתחם,
      nH = מקדם היל או cooperativity לכאורה.
    3. לנרמל את הזרמים כדי אחדות על-ידי חלוקת את משרעת של כל תגובת נגד הערך להקליט הריכוז הגבוה ביותר כדי לנתח את הנתונים המתקבלים סדרה של תאים.
    4. לקבוע את הממוצע ואת תקן שגיאות ולממש את פריסטלטיות באמצעות תוכנת standardly זמין.

3. אלקטרופיזיולוגיות הקלטות פרוסות המוח

הערה: עכברוש בהיפוקמפוס פרוסות מוכנות בהתאם להנחיות הלאומית ומוסדיים.

  1. הכנה של ההיפוקמפוס פרוסות
    1. להכין ניתוח מלאכותי סריברו-השדרה נוזל (dACSF) עם 124 מ מ NaCl 124, 2.5 מ מ אשלגן כלורי,2PO 1.25 מ מ ח'4, 2 מ מ MgSO4.7H2O, 2.5 מ מ CaCl2 2 H2O, 26 מ מ NaHCO3, גלוקוז 10 מ מ ו- 4 מ מ מולקולה בגז בבקבוק עם תערובת של 95% O2 ו- 5% CO2.
    2. הכינו הקלטה מלאכותי סריברו-השדרה נוזל (rACSF) עם 124 מ"מ NaCl, 5 מ מ אשלגן כלורי, פו2של 1.25 מ מ ח'4, 2 מ מ MgSO4.7H2O, 2.5 מ מ CaCl2 2 H2O, NaHCO 25 מ מ3וגלוקוז 10 מ מ בגז בבקבוק עם תערובת של 95% O2 ו- 5% CO2.
    3. עזים ומתנגד החולדות באמצעות תערובת של 2.5% איזופלוריין חמצן טהור, לכרות אותם.
    4. חותכים את הקרקפת בעקבות האמצע עם זוג מספריים נאה. לחתוך את הגולגולת לאורך הקו האמצעי ללא פגיעה הרקמה הבסיסית. אסיר את הגולגולת עם פינצטה, להשתמש במרית בסדר לאסוף את המוח.
    5. למקם את המוח הפתרון dACSF נודף גז-RT ומנתחים היווצרות בהיפוקמפוס השמאלי עם מרית משובחים.
    6. חותכים פרוסות רוחבי (בעובי 400 מיקרומטר) מהחלק בינונית של ההיפוקמפוס עם מסוק רקמות ולהעביר אותם לחדר ההקלטה עם השימוש במברשת בציור. לשמור על הפרוסות ב RT למשך 45 דקות.
    7. Perfuse את הפרוסות עם rACSF נודף גז ב 35 ° C, בקצב של 1.5 מ ל לדקה בועה הפתרון בתערובת של 95% O2 ו- 5% CO2.
      הערה: לאחר שלב זה, הפרוסות מוכנים הניסויים אלקטרופיזיולוגיות.
  2. אוכלוסייה אחת ספייק הקלטה
    1. מניחים פרוסה המוח אל החדר רכוב מיקרוסקופ.
    2. Perfuse הפרוסה בקצב של 3 mL/min עם rACSF.
    3. מקורב של micropipette זכוכית בורוסיליקט פולר פיפטה שיש התנגדות של ~ 2 MΩ.
      הערה: micropipette הזה משמש אלקטרודה הקלטה, מחובר חשמלית המגבר.
    4. למלא את micropipette עם פתרון המכיל 2 M NaCl ולמקם אותו לתוך המחזיק פיפטה של המגבר.
    5. מקם את micropipette הקלטה ב pyramidale שכבה באזור CA1 של הפרוסה בהיפוקמפוס באמצעות את micromanipulator נכון.
      הערה: המיקום מיוצג סכמטי איור 7.
    6. למקם אלקטרודה מבודדת דו קוטבית פלטינה/אירידיום המחזיק ב- micromanipulator השמאלי.
      הערה: אלקטרודה זו משמשת האלקטרודה גירוי, חשמלית מחובר הגנרטור הגירוי.
    7. בעמדה האלקטרודה גירוי שפר בהתקפה באזור CA1 הפרוסה בהיפוקמפוס באמצעות את micromanipulator נכון.
      הערה: המיקום מיוצג סכמטי איור 7.
    8. לספק דופק הנוכחי האלקטרודה גירוי באמצעות הגנרטור גירוי כל 30 s (100 µs משכים, החל מ- 10 µA) בהדרגה להגביר את עוצמת גירוי להופעת יתד האוכלוסייה (PS).
    9. להתאים את עוצמת הגירוי לעורר על PS המתאים ל-45% משרעת המרבי שניתן להשיג. PSs מסונן-2.4 KHz, דיגיטציה ב-20 קילו-הרץ באמצעות מגבר השידור.
  3. עיכוב לזווג...-דופק
    1. להכין את פרוסות המוח (שלב 3.1) והמשך כפי שתואר לעיל (צעדים 3.2.1–3.2.7).
    2. לספק שני פולסים הנוכחי (100 משכים µs במרווח 20 ms) האלקטרודה גירוי כל 30 s באמצעות הגנרטור הגירוי. קבע את עוצמת הגירוי לעורר על PS המקביל של משרעת מקסימלית 45%.
  4. מתחם בדיקות
    1. להפוך דילולים של תרכובות להיבדק בחנה המבר נודף גז כך הריכוז הסופי של דימתיל סולפוקסיד לא גבוה מ- 0.1%.
    2. להוסיף דימתיל סולפוקסיד הפתרון שליטה על ריכוז זהה מאשר בהפתרון מורכב.
    3. להקליט סינגל (שלב 3.2) או PS לזווג-הדופק (שלב 3.3) עורר מאת stimulations משני שפר כל 30 s במשך לפחות 30 דקות. הצורה PS צריך להיות יציב בתקופה זו בסיסית.
    4. להכין גביע עם rACSF נודף גז המכיל ריכוז קבוע של המתחם להיבדק.
    5. Perfuse על הפרוסה בהיפוקמפוס בעזרת פתרון זה תוך עדיין מקליט את PS. יחיד או מזווג-דופק
    6. להעריך את ההתאוששות מן האפקט מורכבים על-ידי פרפוזיה הפרוסה עם rACSF נודף גז ללא המתחם.
      הערה: אפקטי הפיכה, PS חוזרת להיות בצורתו הראשונית נצפתה במהלך תקופת בסיסית לפני היישום מורכבים.
  5. ניתוח נתונים
    1. ממוצע עקבות PS שנרשם במהלך הניסוי בבלוקים של 4 שימוש בתוכנת ניתוח נתונים.
    2. למדוד את amplitudes PS של עקבות בממוצע.
    3. לנרמל את amplitudes כאחוז של הערכים הבסיסיים הקליט 10 דקות לפני פרפוזיה תרכובת.
    4. לבטא את הנתונים אומר ± ב- SEM...

Representative Results

איגוד:
וזמינותו במבחנה עם קרום התא משמש לזיהוי סלקטיבי האנושי GABAA α5β3γ2 קולטן ליגנדים מחייב באתר BZD allosteric של γ2 המכילה רצפטורים. Transiently transfected תאים HEK293 לבטא את האדם GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 ו α3β3γ2 רצפטורים משמשים כדי להתכונן בקרום הזה וזמינותו. השפעת ליגנדים פוטנציאליים מזוהה על ידי מדידת את נצנוץ של פלומאזניל [3H] מחויב על קולטני ממברנה (עיכוב של איגוד פלומאזניל [3H]). הזחה איגוד עקומות ואז נוצרים כדי להעריך את מידת הבררנות של תרכובות של קולטן GABAA ספציפיים כמו בדוגמה עם RO4938581 (איור 8). איור 9 מסכם את הפרופיל של תרכובות עזר מספר כולל של α5 סלקטיבית GABAA קולטן שלילי allosteric אפנן, RO49385819, אשר נוצרו באמצעות איגוד וזמינותו.

הקלטות ב צפרדע רפואית oocytes:
הביטוי של קולטני GABAA כגון heteromer α5β3γ2 התשואות זרמים חזקים בתגובה לחשיפה GABA. מתח טיפוסי קלאמפ הקלטות שהושג ב oocyte לבטא את α5β3γ2 האנושית בתגובה קצרה פולסים גאבא (30 s) החל מיקרומטר עד 300 מוצגים באיור 6. בניסוי זה, ריכוזים שונים של גאבא נטו בצלחת 96-ובכן, התגובות ולעוצמת על-ידי הזזת התא לבאר ספציפיים. גאבא נשטף ביסודיות על ידי החזרת התא אל התא המרכזי זלוף והחלת זלוף בפתרון שליטה על ידי הפעלת המשאבה מינון המתאים. רצף תוכנית המשמש הקביעה של העקומה הפעלה ריכוז מודגם באיור 6א. התנהלה באופן מלא באופן אוטומטי, נתונים אלה להדגים שני איכות ההקלטות שניתן להשיג בצפרדע רפואית oocytes וקיבלתי הרמה הגבוהה של קולטן ביטוי מספר ימים לאחר ההזרקה mRNA. שני ניסויים, שילובים שונים קולטן, תשואה של סדרת s50EC, המהווה הריכוז של צורך להפעיל את מחצית קולטני GABA. מגרש של EC50של הערכים בגרף עכביש, כגון מאויר באיורים איור 10, מספק השוואה מהירה של המאפיינים קולטן ואת השפעת ההרכב יחידה משנית.

כדי לבחון את השפעת חיובית או שלילית allosteric אפנן (נאם או פאם), זה הכרחי להשוות את התגובה עורר על ידי הדופק מבחן אגוניסט (GABA), תחילה בפקד ולאחר מכן בנוכחות אפנן. טיפול נסיוני יעילה לערוך ניסוי כזה מודגם באיור11. התגובה של התא ריכוז הפניה של גאבא נקבע לראשונה, הרצף שחוזר על-ידי החלת ריכוז גאבא זהה ולאחר מכן על-ידי יישום שיתוף של גאבא פלוס אפנן. חלקת התגובות-גבי שני מגלה בדוגמה זו עיכוב מסומן הנגרמת על ידי הנוכחות של אפנן. כימות ההשפעה אפנן מתקבל ברצון על ידי חישוב היחס בין התגובה עורר בנוכחות אפנן לעומת הפקד ואת התוצאות ניתן להתוות בצורה של מגרש חום. הנתונים המוצגים באיור 12 ממחישים את העלילה חום התואם ההקלטות של שלוש סדרות נתונים שהושגו עבור תרכובות 96.

בעקבות זיהוי תרכובות הפעילים במידה מספקת, לעתים קרובות הכרחית כדי להעריך אם מולקולות אלה הן פעיל בצירופים קולטן. במקרה קולטן GABAA , זוהו הגנים 19 קידוד עבור subunits שונים, ידוע כי קולטן פונקציונלי יכול לנבוע אסיפה multimeric של subunits שונים (ראה Knoflach, הרננדז, ברטרנד10 שנים סקירה). למרות מספר subunits ושילובים התשואה רפרטואר רחב של קולטן תת זה עשוי לדרוש מספר גדול של מונה ההקרנה שיש לבצע, לעתים קרובות אפשר להתמקד קודם על הנפוץ סוג הנכס, במקרה של גאבאA רצפטורים, הוא הרכב α1β2γ2. ניסויים שנערכו ראש בראש עם הביטוי, לדוגמה, α5β3γ2 ו α1β2γ2 ב מאותה אצווה של oocyte תשואות השוואה טובה של ההשפעות בהתאמה של מולקולה נתונה. טיפוסי התוצאות המתקבלות שלושה תאים עבור α5β3γ2 וα1β2γ2 מוצגים באיור 13, אשר ממחיש את אפנון חיובי מועדף של מולקולה אחת ב α5β3γ2.

פרוטוקול נסיוני מאויר באיור 11 הוא גם מתאים אפיון פעילות פאם. פרוטוקול זה, המתחם הוא נבדק הוא שותף יישומית עם אגוניסט-בהדרגה, הגדלת ריכוזים. כדי למנוע את ההשפעות האפשריות המצטבר הנגרם על ידי מספר יישומים על אותו התא, תא חדש ותמימה נמדד עבור כל נקודת נתונים. יחידת מידה משרעת של התגובה הקליט עם אגוניסט לבד, ואז במהלך היישום מתחם מניבה יחס אשר מכמת את האפקט פאם או נאם. טיפוסי התוצאות המתקבלות ב α1β2γ2 ו α5β3γ2 עבור דיאזפאם מוצגות באיור איור 14, חושפני של רגישות לכאורה של α5β3γ2 כ 10-fold גבוהה יותר על הצירוף הזה קולטן. ערכים אלה הם מתאם טוב עם נתונים שפורסמו11. כיוון שהם סוברים כי האתר בנזודיאזפינים היוו על-ידי הממשק בין γ2 את שלו α סמוכים יחידת משנה12-14, הרגישות של α5β3γ2 מרמזת על משיכה דיאזפאם מועדף עבור γ2-α5 מעל γ2-α1. האפשרות להביע שילובים שונים קולטן בשילוב של אפיון פונקציונלי יעיל פותחת מספר דרכים לחקור גורמים של המאפיינים פאם, במשתמע שלהם עבור אפקטים פיזיולוגיים תרופתי.

פרוסות המוח בהיפוקמפוס:
עם פרוסות המוח בהיפוקמפוס עכברוש מתבצעות כדי לאמת את הפרופיל תרופתי של תרכובות שזוהתה במבחנה מבחני במודל של קולטן מקורית. באמצעות סוגי השולט המשנה קולטן GABAA מבוטא בתאי ההיפוקמפוס כפירמידה הם α1β2/3γ2 α2β2/3γ2, α5β2/3γ2, אשר נמצאים כל מווסת על ידי בנזודיאזפינים (BDZs)15. עיכוב לזווג...-הדופק היא פרדיגמה יכולה לגלות מעגל בהיפוקמפוס דעתנית על-ידי בדיקת השינוי בתגובה השנייה של שני גירויים חשמליים לזווג נמסר בנפרד 20 ms. השינוי של התגובה השנייה נובעת GABAergic משוב על-ידי interneurons innervating תא כפירמידה שכבה16-18. כפי שמוצג באיור 7, מצב הבקרה, התגובה השנייה של שני גירויים לזווג מעוכבת בשל עיכוב GABAergic. כאשר עיכוב זה הוא מופחת על ידי פרפוזיה הפרוסה עם β-CCM, נאם לא בררניים, התגובה השנייה של שני הגירויים לזווג מעוכבת במידה פחותה בהרבה. זו פרדיגמה נסיונית רגישה תרכובות סלקטיבית על קולטן GABAA המכילה את יחידת משנה α5.

Figure 1
איור 1 : הקרנת אסטרטגיה. תרופה טיפוסי הקרנת השביל מתחיל עם ההקרנה תפוקה גבוהה שבה מוקרנים ספריות גדולות של תרכובות עבור מטרה ספציפית. בעקבות זיהוי המועמד המוביל, מתחילה העבודה של כימיה מרפא. במהלך שלב זה, כימאים ללמוד ולמקד את המולקולות על ידי ביצוע שינוי מבני כדי לענות על הקריטריונים הרצויים, כגון מטרה סלקטיביות, המוח penetrance, יציבות, השפלה וכו במהלך שלב מכריע זה, זה חיוני כדי להעריך אם שינויים כימיים לא שינתה את המאפיינים מולקולה וכדי לחדד עבור המועמד הטוב ביותר. השלב הבא הוא לזהות כמה תרכובות ולהביא אותם אל השלבים הבאים הכוללים בטיחות, סובלנות, ועוד הערה אלקטרופיזיולוגיה הזה מסומן כמו assay פונקציונליות אבל זה בשיטות אחרות, כולל סידן קרינה פלואורסצנטית מבחני או צבעי רגיש מתח, יכול לשמש חלופות. שיטות אלה האחרונים משמשים גם במבחני תפוקה גבוהה כמו החלפה עבור מבחני הכריכה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : הפריסה של 96-ובכן מצופה מנוצל עבור איגוד ניסויים. עמודה 1 משמש עבור איגוד הכולל מדידות ועמודה 2 למדידות מחייב שאינם ספציפיים. שורות A – H מלאים תרכובות שונות 4 להגדיל את ריכוז (עמודות 3-12), כל המתחם שבו כפילויות (קרי, מתחם אחד ב שורות A ו E, מתחם 2 שורות B ו F, וכו) ייצג את הפריסה עם צבעים שונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : Microinjection באמצעות מערכת אוטומטית. (א) א מדויק XYZ מערכת שבה מחט ההזרקה זכוכית מלא עם הנוזל המכיל את פלסמיד עניין, הוא הציץ באופן אוטומטי לתוך oocytes. (B) לוח זה מראה את הצלחת חרוט 96-ובכן למטה אשר (C) oocytes מוזרקים באופן אוטומטי. (ד) בלוח זה מתאר את העיקרון הזרקה. עבור הזריקה גרעינית, המחט חודרת את oocyte מעט עמוק יותר לגרעין, כפי שמוצג בחלונית B. לאחר מכן, המחט נסוגה מהגרעין (ראה לוח ג) לפני הזריקה (ראה לוח D). (E) כדי להעריך את האיכות של הזריקה, המחט יכול להיות מלא עם צבע, oocytes "מבושל" ניתן לחתוך לשניים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : העיקרון אלקטרודה מתח שני-קלאמפ אוטומטיות. העיקרון מבוסס על העברת ההכנה בין בארות ולא החלת נוזלי זלוף. (א) בצד שמאל של החלונית ' ' מייצג את הסדר המאפשר את ההקלטה oocyte צפרדע רפואית עם שתי אלקטרודות, סל קטן על טיפונת נוזל סביב הכנת במהלך התנועה מ דוגמא אחת אחר. תמונה של oocyte להציב בסל עם שתי אלקטרודות מוצג בצד ימין. (B) לוח זה מציג ייצוג סכמטי של "הפוך" אלקטרופיזיולוגיה הקלטה עקרון. (ג) לוח זה מראה של חיסול oocyte, צלחת מתחם ותחנת שטיפה על השולחן הקלטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : שני-אלקטרודה מתח קלאמפ הקלטה לעומת תיקון קלאמפ. מלחציים מתח 2-אלקטרודה טיפוסי מהקלטה oocytes (החלונית הימנית) לעומת תצורת מלחציים תיקון משמש קו תא (לוח נכון). שימו לב להבדלים בגודל oocytes אשר הם בערך 1 מ מ קוטר לעומת תאים המהווים כ- 20 מיקרומטר. הצבת שני-אלקטרודה מתח, פוטנציאל הממברנה של oocyte לעומת המתח החזקה הרצויה, ההבדל אות מוזרק האלקטרודה הנוכחי. בהקלטה מלחציים תיקון, ההנחה היא כי התנגדותם של האלקטרודה מלחציים תיקון הוא זניח לעומת ההתנגדות ממברנה ו, לכן, כי המתח שהוטלו על ידי המגבר בנאמנות מוזן של קרום התא19. התמונה ממחישה זלוף נוזלי הלהט שבו בין שני הערוצים קו () שפופרת תטא מלאים, מצד אחד, פתרון שליטה ועם, מצד שני, הפתרון המכיל את התרופה20,21. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 : ריכוז הפעלת למקורבים קולטני α5β3γ2 אנושי. (א) הרצף שליטה המערכת האוטומטית מכילה סדרה של סמלים ומגדיר את נסיוני הקביעה של הקשר ההפעלה ריכוז. שלבים 1-3, כפי שמוצג בחלונית זו, המערכת טוען את oocyte מהצלחת לתוך הסל מדידה. הזרם הדליפה נמדד בשלב 2, ערך זה יעלה את הקריטריונים הרצויים, התא משתנה אוטומטית (שלב 3). לאחר תקופה של ייצוב (שלב 4), התגובה oocyte הפניה גאבא הריכוז הוא נמדד (שלבים 5-8). Oocytes ספרים זרמים גדולה יותר 1 µA נשמרים עבור המידה עוקבות. שלבים 11 – 13, התא. קוראים תיגר על ידי ריכוזים שונים של GABAA , התהליך חוזר על עצמו עבור המספר הרצוי של ריכוזי (שלב 14) ותאים (שלב 15). (B) לוח זה מציג את הזרמים טיפוסיים. עורר על ידי סדרה של יישומים גאבא קצרה (30 s) חלה גדל סדר. העיתוי של היישום מתחם מציינים את הסורגים. (ג) A עלילה של הזרם פנימה שיא כפונקציה של הלוגריתם של גאבא ריכוז תשואות העקומה הפעלה ריכוז זה מצויד ברצון על ידי המשוואה היל אמפירי, עם עקומה רציפה של EC50 מיקרומטר בערך 11, גבעה מקדם של 1.3. זרמים טלקוה 8 תאים היו מנורמל ל אחדות על התגובה עורר מקסימלי. הסורגים מציינים את שגיאת התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7 : Β-CCM, נאם GABAA מפחית את הדופק לזווג עיכוב בפרוסות בהיפוקמפוס. (א) לוח זה מציג ייצוג סכמטי של פרוסה בהיפוקמפוס חולדה. שפר בהתקפה (Sch C) שמקורם פרויקט אקסונים תא כפירמידה CA3 arborization דנדריטים של הנוירונים כפירמידה CA1. Micropipettes הונחו ב pyramidale שכבה (str pyramidale) כדי להקליט האוכלוסייה קוצים (PS) וב -radiatum שכבה (str radiatum) להקלטות דנדריטים של שדה פוטנציאל postsynaptic סינאפסות (epsp). האלקטרודה גירוי הונח בתוך בהתקפה שפר. (B) לוח זה מציג PSs עורר על ידי גירויים לזווג להחיל באמצעות האלקטרודה מגרה אותו במרווח 20 ms. התגובה האוכלוסייה הגירוי השני (PS2) היא משרעת קטן יותר מזה של תגובת הגירוי הראשון (PS1). (ג) PSs נרשמו היעדרות (פס שחור), נוכחות של β-CCM, נאם קולטן GABAA לא בררניים (בר ירוק). Β-CCM משופרת את משרעת של PS2 השני על ידי חוסמת חלקית כל עיכוב GABAergic הזנה-קדימה. הסורגים מציינים את שגיאת התקן של הממוצע ו * * * כי הנתונים הם מאוד משמעותי עם p < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8: תוצאות איגוד טיפוסית להשיג assay תחרותי (עיכוב או עקירה). הזחה איגוד עקומות נוצרים מן אשר ה IC50 ו הקי יכול להיקבע. IC50 הוא ריכוז ליגנד מתחרים אשר מזיחה של הכריכה ספציפית של radioligand 50% וקי (הקבוע עיכוב תרופה) הוא ריכוז ליגנד מתחרים אשר לכבוש 50% של קולטני אם אין radioligand נכחו. הקי מחושבת על פי ה IC50 באמצעות המשוואה נג-Prusoff:
Equation 5
אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 9
איור 9 : הזחה תחרותי איגוד בוצעה עם ליגנדים מחייב ב בסוגי מרכזי המשנה של קולטן GABAA . הזיקות (ננומטר) נמדדו באמצעות וזמינותו פלומאזניל מחייב [3H], ממברנות התאים HEK293 transiently transfected עם צירופים שונים ומותאמים האנושי יחידה משנית קולטן GABAA . הייצוג היסטוגרמה מדגים בבירור את הרגישות דיפרנציאלית שנצפו את RO493851 מורכבים עם הקי הנמוך ב קולטני α5β3γ2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 10
איור 10 : גאבא דיפרנציאלית רגישות של קולטני. מגרש של קולטן GABA EC50 על מגרש עכביש ייצוג של הרכב בשם יחידת משנה מספקים דרכים יעילות כדי להשוות את התפקיד של subunits שונים. שימו לב כי המבוא של subunits γ2 משויכת הפחתת הרגישות קולטן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 11
איור 11 : בודק את השפעת אפנן. (א) בלוח זה ממחיש את רצף סמל המשמש לשליטה המערכת האוטומטית. שימו לב כי הסמלים (A/D) שתי תואמות ההקלטה של הפקד (ירוק), במהלך החשיפה אפנן (אדום). (B) לוח זה מראה אופייני זרמי טלקוה תא לבטא את קולטן GABAA במהלך רצף. כדי להעריך את ההשפעות של אפנן, רצף של מדידת קודם את התגובה עורר כתוצאה מחשיפה ריכוז קבוע של גאבא (trace ירוק), ואחריו את החשיפה הראשון ל GABA, ואז גאבא פלוס אפנן (סימן אדום), נערך. מיצוב סמנים צלב דק (תכלת וכחול) בין המדידות, ומציין הצלב הכחול ההפרש המקסימלי בין שני התנאים הקלטה. היחס בין התנאי אפנן ובקרה מחושב באופן אוטומטי בתוכנת ניתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 12
איור 12 : מגרש חום עם משכפל שלוש. לוח זה מציג מגרש חום התואם משכפל שלוש תופעות אפנן השיג עבור תרכובות 96 על קולטני GABAA α5β3γ2 האנושית. היחס של התגובה במבחן שליטה הנעות בין 0.5 ל- 1.2 נחשבו לא שונה באופן משמעותי מהפקד, מיוצגים על-ידי נקודה ירוקה. יחסי מתחת 0.5 נחשבו כמייצג אפקט מעכבות, מיוצגים על-ידי נקודות כחולות. יחסי מעל 1.2 נחשבו שיפור התגובה, מיוצגים על-ידי נקודות אדומות. הערה של similitude דפוס בין שלוש הקלטות עצמאיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 13
איור 13 : מונה הקרנה בα1β2γ2. (א) בלוח זה הופעות וייצוג של ארגון בשם יחידה משנית. הלוחות הבאים מציגים (B-D), הערכה של השפעות חיוביות אפנן allosteric α5β3γ2 האנושי, (F-H) בα1β2γ2, באמצעות השוואה ריכוזים של גאבא וריכוזי דומה (100 מיקרומטר) של ? אפנן, המבליטים יחודיות של המתחם נבדק בניסויים אלה. (E) לוח זה מציג גם ייצוג של ארגון בשם יחידה משנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 14
איור 14 : הרכב רגישות, קולטן פאם. הקביעה של ההשפעות של סדרה של ריכוזים של אפקטים דיאזפם (A-D) α1β2γ2, (E-H) α5β3γ2 רצפטורים מגלה כמעט הבדל 10-fold זיקה נראית לעין. שימו לב גם השפעת ההרכב יחידה משנית על מסלול זמן תגובה עם הקהיה מהיר יותר בα1β2γ2 רצפטורים (ראו, לדוגמה, לוחות D ו- H). שים לב כי ככל α1β2γ2, α5β3γ2 רצפטורים התצוגה הזיקות שונים עבור גאבא (ראה גם איור 10), הריכוז של אגוניסט הותאם בין קולטני שני להיות בטווח ההפעלה דומות. (I) בלוח זה מייצג מגרש של הקיפול עלייה משרעת הנוכחי מנורמל כדי אחדות לעומת מצב שליטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 15
איור 15 : הביטוי פלסמיד כולל promotor T7 ו CMV. לוחות אלה מראים את פלסמיד לביטוי של צפרדע רפואית oocyte (לוח נכון העליון), קו תא. החלונית התחתונה נכון מדגים תא HEK-293 טיפוסי transfected עם פלסמיד המכיל גם את הגן של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) עם האלקטרודה תיקון-קלאמפ הקלטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

הפיתוח של תרכובות הרומן פעיל תעלת יונים ממותגת ליגנד כגון קולטני GABAA דורש השימוש של מספר גישות. בדרך כלל, הצעד הראשון בדרך כלל מתבצע באמצעות מבחני הכריכה; עם זאת, מדידות כאלה אינם מספיקים לאפיין את פעילות פיזיולוגית של המתחם או פרמקולוגיה המדויק שלו. בפרט, מתחם זה נקשר לקולטן עשוי לשפר או לעכב את תפקידה או אפילו לייצר אין השפעה תפקודית (להיות שקט) (קרי, לאגד הקולטן מבלי לשנות את תפקידו). לכן, בדיקה פונקציונלית נדרש עבור אפיון מלא המורכב.

מבחני האיגוד:
היתרון העיקרי של איגוד וזמינותו היא כי זה יכול להיות יעיל נערך על מספר רב של דוגמאות הנעות עד כמה אלפים, שהיא מספקת הזיקות מחייב עבור מולקולות פעילים. כמתואר להלן, הצעד הראשון מורכב להקמת שיטה להערכה מסוגי המשנה קולטן הרצוי. כלומר, בעוד איגוד יכול להתבצע על קולטנים יליד שברים או המוח כולו, השיטה תמנע הקביעה של הזיקות-קולטן ספציפי יחוברו. לכן, צורך להשתמש מערכות רקומביננטי מסך מולקולות על המטרה הרצויה. כיום, תרביות תאים ארעי או יציבה של cDNAs יחידת משנה קולטן הרצויים בשורות תאים מציע שיטה יעילה ואמינה לבטא את תת-סוגי קולטן עניין (למשל, GABAA α5β3γ2). שימוש מסורתי מחייב לבצע מבחני radioligands, אבל כיום טכניקות זמינים זה למנוע את אי הנוחות של טיפול רדיואקטיביות (למשל, כמותי מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית ליגנד מחייב).

ביטוי תפקודית במערכת מחשב מארח:
כדי לבטא את הגנים במערכת המחשב המארח, רצף קידוד עניין להוסיף לתוך פלסמיד המכיל את באמרגנים נאותה. בדרך כלל, עבור במבחנה סינתזת mRNA, משמשים את באמרגנים חיידקי T7 או T6. עבור ביטוי cDNA, שעתוק של הגן עניין להיות מפוקח על ידי promotor איקריוטים כגון CMV (cytomegalovirus) או שווה ערך. כיום, מספר פלסמידים, כולל את שני באמרגנים (כלומר, pUNIV, pCMV-6AC, psf-CMV/T7, pCI-neo, pcDNA), הם זמינים, המאפשר סינתזה של במבחנה של mRNA או ביטוי cDNA כמוצג באיור15. ביטוי של קולטני GABAA ניתן להשיג בנאמנות שורות תאים או צפרדע רפואית oocytes. היתרונות העיקריים של האחרונים הם העדר ביטוי הקולטן אנדוגני, הפשטות של מניפולציות, והזמינות של מערכת אוטומטית עבור מיקרו-זריקות והקלטות. בהליכים המתוארים תחת פרוטוקול זה להדגים את היעילות של מערכת אוטומטית אשר מאפשר ההזרקה של 96 oocytes כ 7 דקות והוא דורש כישורים המיקרומניפולציה. לזכור כי שחלה יחיד מ צפרדע רפואית מכילה בין 10,000-30,000 oocytes, ברור כי מספר גדול של מדידות התא יכול להתבצע על תכשיר יחיד. יתר על כן, כפי ביטוי יכול להתבצע באמצעות זריקות cDNA, פלסמידים באותו המכיל את הגנים של עניין זה מפותחים עבור הניסויים איגוד יכול לשמש עבור אפיון פונקציונלי ללא צורך נוסף בביולוגיה מולקולרית מניפולציות.

בהינתן גודל גדול וביטוי משטח גבוהה, oocyte יחיד מניבה מספר קולטנים אשר שווה בקירוב ל התאים confluent 35 מ מ פטרי. עם זאת, הזרקת והכנה oocytes מייצג חלק של העלות של קו תא, כמו הניסויים אינן דורשות מדיום תרבות מסוים ומניפולציות סטרילי. ההפעלה של ערוץ GABAA אחד מניב מספר picoamperes (10-12), זרמי הנעות עד עשרות microampere (10-6) נרשמות בקלות oocyte יחיד, אשר מאשר את הפעילות בו-זמני של מספר מיליוני קולטנים במהלך תשובה בודדת.

שלב ראשוני האפיון של תעלות יונים ממותגת ליגנד לעתים קרובות הקביעה של זיקה לכאורה של הקולטנים. הניסויים צריכים להתנהל מורכב החלה סדרה של פולסים מבחן בקצרה אגוניסט של התוויית את משרעת של עורר הנוכחי או, במקרים מסוימים, האזור מתחת העקומה (AUC) כפונקציה של הלוגריתם של ריכוז אגוניסט. כמו שזה ריאלי בקלות כדי microinject שונים פלסמיד ריכוזים, יחס מאותה אצווה של oocytes, מערכת זו של הביטוי מתאים במיוחד אפיון כזה. יתר על כן, השוואה אצווה-כדי-אצווה חשף רמה גבוהה של יציבות עבור s50EC שונים. השפעת ההרכב יחידה משנית על זיקה נראית לעין של הקולטן הוא מדמיין בקלות באמצעות מזימה עכביש, למשל, באיור10.

התוצאות של המלחציים שני-אלקטרודה מתח בשנת oocytes צפרדע רפואית מושווה לעתים קרובות עם הקלטות שבוצעו באמצעות אלקטרודות מלחציים תיקון. בעוד שזה יגיע מעבר להיקף העבודה הזאת להיכנס השוואה מפורטת בין שתי מערכות אלה, אפשר לבחון כמה נקודות. מלחציים תיקון בתאים מציעה יתרונות עבור אפיון biophysical עם יישום מהיר סמים, לדרישות שלו מורכבים יותר מאלה של ההקלטות שני-אלקטרודה צפרדע רפואית oocytes. קושי שעצירת והראשון הוא הביטוי של חלבון נתון בצורך של תרבות תא, הציעה שתושב זמני או תרביות תאים יציב, וזיהוי של התאים הם ביטוי הבונה הרצוי. בנוסף, היא הכרחית כדי לבחון את התרומה אפשרי של הביטוי אנדוגני בתא נחשב. יתר על כן, הקלטה מלחציים תיקון מחייב אדם מיומן לנהל את המיקרומניפולציה תחת מיקרוסקופ הגדלה גבוהה, בעוד אותו אדם גם צריך לבצע ניתוח נאותה במהלך הניסוי כדי להעריך, לדוגמה, האיכות של החותם. ההתנגדות גישה וכו לעומת זאת, מלחציים שני-אלקטרודה מתח הקלטה, במיוחד אחד באמצעות מערכת אוטומטית אלקטרופיזיולוגיות, אינו דורש שום כישורים ספציפיים, יכול להתבצע על ידי טכנאי מעבדה.

בעת רכישת של הגדרת אלקטרופיזיולוגיות, שיקול העלות היא ללא ספק גורם חשוב שצריך להיות מנותח בקפידה. לדוגמה, בעוד העלות של מערכת אוטומטית היא גבוהה יחסית, השוואה קרוב יותר מגלה כי ההתקנה של מעטה אלקטרופיזיולוגיות מלאה כולל קניית ציוד כגון micromanipulators טוב, עדשה דו-עינית, מגבר, זלוף המערכת, טבלת אנטי רטט, תוך רכישת נתונים וביצוע ניתוח גם. עלות השוואה בין שני-אלקטרודה מתח קלאמפ הגדרת נגד הפללה מלחציים תיקון מגלה אי-התאמות עוד יותר. יתר על כן, המערכת האוטומטית מציעה את היתרון של ציוד ממוחשב ופועל ללא התערבות יום ולילה.

המאפיינים תרופתי של תרכובת נקבעים על ידי פעולתה על הקולטן. לדוגמה, מעכבי תחרותי הם מולקולות יכולים להזין את היד לכיס איגוד, או באתר orthosteric, כמו אגוניסט עצמו גורם תחרות. מעכבי שאינו תחרותי הם תרכובות המעכבות את קולטני על ידי אינטראקציה באתר אחר, במקרה של ערוץ יונים ממותגת ליגנד, שניתן להזין או לחסום הנקבובית יוניים, לדוגמה. זה ילך מעבר להיקף עבודה זו לבחון את מנגנוני שונים של אינטראקציה, אך בהמשך ניתן לקבל מידע מתוך ספר לימוד תרופתי ו/או מהעבודה אחרים כגון ברטרנד, ברטראן22.

במקרה של allosteric מאפננים, איגודים תרכובת-אתר שהוא נבדל באתר orthosteric, אבל הנוכחות של המולקולה משנה מחסום האנרגיה בין המדינות פעיל ועוד. חיובי allosteric מאפננים (PAMs) הם תרכובות להפחית את מחסום אנרגיה מן המנוחה למצב הפעיל ולשפר, לכן, ההשפעה של אגוניסט. כדי לאפיין תופעות אפשריות פאם, יש, לכן לקבוע אם חשיפה למתחם משפר את התגובה אגוניסט,, ואם כן, על איזה ריכוז. הניסויים המוצגים באיור 11 ו -14 איור להמחיש פרוטוקולים יכול לשמש בהצלחה עבור אפיון PAMs על קולטני GABAA .

במקרים מסוימים, חשיפה פאם לבד עשויה להספיק להפעיל את הקולטנים. פעילות כזו יכולה להיקבע על ידי שינוי קל של פרוטוקול ניסיוני המוצג כאן. כלומר, במקום באמצעות יישום שיתוף של אפנן במהלך החשיפה גאבא, הפרוטוקול יכול להיות שונה עבור היישום של הראשונה המתחם לבד ולאחר מכן בנוכחות גאבא. אפיון של הפעילות אגוניסט ישיר ייעשה על ידי קביעת משרעת של התגובה עורר על ידי המתחם עצמו, לעומת הנוכחי עורר-GABA.

ניסויים שנערכו פרוסות המוח, כגון מאויר ב איור 7, משמשים כדי לאשר מתחם פעילות מקורית קולטנים במעגל מעכבות מובהק לפני שנמשיך הלאה במודלים של בעלי חיים, לאורך השביל לכיוון בניסויים קליניים. פרוטוקול הקלטה וניתוח נתונים פשוטים יחסית מאפשר הדירוג של תרכובות מרובים על-ידי הערכת השפעתם modulatory דיפרנציאלית על PS משרעת. אפקטים שאינם ספציפיים של תרכובות שאינן קשורות למערכת גאבא עשוי גם להיות שזוהו (למשל, כאשר שינויים בצורת PS מובחנות). ישירה, GABAergic עצבית יכול להידרש במקרים אלה על ידי מדידת ההשפעות של תרכובות על זרמי מעכבות postsynaptic (IPSCs) באמצעות טכניקה קלאמפ8תאים כל תיקון.

Disclosures

המחברים פרדריק Knoflach והרננדז מריה-Clemencia עובדים של פ הופמן-La Roche AG, 4070 באזל, שוויץ, חברת תרופות. הסופר דניאל ברטרנד הוא עובד של HiQScreen Sàrl 6, כביש דה Compois, 1222 Vésenaz ז'נבה, מתן שרותים ההקרנה לחברות התרופות.

Acknowledgments

המחברים תודה ג'ודית לינגל, מריה Karg, Grégoire פריץ, רחל Haab, ו מארי קלייר Pflimlin של רוש ו שר סרט דבורה Paolucci מ- HiQScreen לקבלת סיוע טכני מעולה שלהם.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
General equipment
96 well cell harvester -(Filtermate 196)  Packard To filter membranes with bound radioligand
Microtiter plate liquid scintillation counter (Top Count NXT) Packard Microplate Scintillation and Luminescence counter
Vial liquid scintillation counter (Beta-Couter 2500 TR) Packard Vial Scintillation and Luminescence counter
Liquid  handler (Biomek 2000) Beckman coulter To prepare compound dilutions
Vortex (Vortex Genie 2) Scientific industries Inc. To mix compound stock solutions
Tissue homogenizer (Polytron PT1200E) Kinematica AG To resuspend the membrane preparations
XLfit5 software Microsoft Excel
 add-on by IDBS		 Curve fitting software
Smart Pull UniPix - Electrode Puller
RoboInject MultiChannel Systems - Automated Injection (Xenopus Oocytes)
HiClamp MultiChannel Systems - Automated Voltage Clamp (Xenopus Ooocytes)
DataMining MultiChannel Systems - Data Analysis Software
DataMerger MultiChannel Systems - Data Processing Software
Digidata 1550 Molecular Devices Low noise data acquisition system
CyberAmp 380 or equivalent Axon Instruments Programmable Signal Conditioner
pClamp program suite Molecular Devices Software for data acquisition and analysis software
Antivibraton table  TMC To avoid microelectrode vibrations 
Patchstar Micromanipulators Scientifica To accurately position microelectrodes in brain slices
Faraday Cage  Sutter Instruments To isolate recordings from noise
McIlwain Tissue Chopper Campden Instruments LTD  To prepare brain slices
Borosilicate glass micropipette  Warner Instruments GC150TF-10 To record extracellular potentials in brain slices
Twisted pair, platinum iridium wires stimulation electrode World Precision Instruments To stimulate the brain slices with current
Stimulus generator for current and voltage driven stimulation MultiChannel Systems STG4000 Delivers the current to the stimulation electrode
Plasticware
Microtiter plate round bottom Corning #3365 Used for the binding assay
GF/C glassfibre filter-bottom 96-well microplate with 1.2 µm poresize, for cell harvesting assays using a vacuum manifoldwell filter  Packard  #6005174 used for the binding assay
50 mL Tubes Falcon  #352070 used for the binding assay
Safe-lock tubes 1.5 mL Eppendorf #0030 120086 used for the binding assay
Safe-lock tubes 2 mL Eppendorf #0030 120094 used for the binding assay
Shipping tubes 180 mL  Semadeni Europe AG  #3722 used for the binding assay
Pony vial Polyethylene 6 mL  Perkin Elmer  #6013329 used for the binding assay
Top Seal  Perkin Elmer  #60051859 used for the binding assay
Spinner Flask Bellco BELLCO # 1965-00100 Spinner Flask
96  Well Plate (Conical) Thermo Scientific Milian 56368 Injection plate for the oocytes
96  Well Plate (Flat bottom) Corning (Vitaris Switzerland) 3364-cor Compound Plate for the HiClamp
Glass capillary  Hilgenberg (Germany) - borosilicate glass 1.2 O.D. 0.76 I.D. with filament
RNA preparation
Ambion mMessage mMachine Thermo Fisher Scientific for the in vitro synthesis
Chemicals
Assay buffer: KCl 5 mM; CaCl2 1.25 mM; MgCl2 1.25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH adjust with HCl to 7.4; store up to 3 months at 4 °C. Used for binding assay
Washing buffer: Tris 50 mM -HCl pH 7.4; store at 4 °C. Used for binding assay
Stock solution of test compounds 10 mM in DMSO Used for binding assay
Flumazenil (RO0151788) 10 mM in DMSO Used for binding assay
Diazepam 4 mM in DMSO Used for binding assay
[3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in Ethanol; store at -20 °C Used for binding assay
Microscint 40  Packard  #6013641 Used for binding assay
Ultima Gold  Perkin Elmer  #6013329 Used for binding assay
MS-222 Sigma Sigma # A5040 MS-222
AB/AM Sigma Sigma # A5955 antibiotics / antimycotics
Collagenase Sigma Sigma # C1030 Collagenase Type I
Rnase Sigma Sigma # R2020-250 mL RNaseZAP
EndoFree Plasmid maxi Kit Qiagen Qiagen # 12362
Salts for artificial cerebrospinal fluid (NaCl, KCl, etc.) Sigma
Membranes
Frozen membrane preparations from transient or stably transfected HEK293 overexpressing different human GABAA receptor subtypes: α1β3γ2, α2β3γ2, α3β3γ2, α5β3γ2. See Ballard et al. 2009 for detailed methods. Used for binding assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rudolph, U., Knoflach, F. Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 685-697 (2011).
  2. Sieghart, W. Structure and pharmacology of g-aminobutyric acidA receptor subtypes. Pharmacological Reviews. 47, 181-234 (1995).
  3. Liu, J., et al. A high-throughput functional assay for characterization of g-aminobutyric acidA channel modulators using cryopreserved transiently transfected cells. ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 781-786 (2008).
  4. Mennerick, S., et al. Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function. Journal of Neuroscience. 30, 2871-2879 (2010).
  5. Hevers, W., Luddens, H. The diversity of GABAA receptors. Pharmacological and electrophysiological properties of GABAA channel subtypes. Molecular Neurobiology. 18, 35-86 (1998).
  6. Macdonald, R. L., Olsen, R. W. GABAA receptor channels. Annual Review of Neuroscience. 17, 569-602 (1994).
  7. Kemp, J. A., Marshall, G. R., Wong, E. H., Woodruff, G. N. The affinities, potencies and efficacies of some benzodiazepine-receptor agonists, antagonists and inverse-agonists at rat hippocampal GABAA-receptors. British Journal of Pharmacology. 91, 601-608 (1987).
  8. Prenosil, G. A., et al. Specific subtypes of GABAA receptors mediate phasic and tonic forms of inhibition in hippocampal pyramidal neurons. Journal of Neurophysiology. 96, 846-857 (2006).
  9. Ballard, T. M., et al. RO4938581, a novel cognitive enhancer acting at GABAA a5 subunit-containing receptors. Psychopharmacology. 202, 207-223 (2009).
  10. Knoflach, F., Hernandez, M. C., Bertrand, D. GABAA receptor-mediated neurotransmission: Not so simple after all. Biochemical Pharmacology. 115, 10-17 (2016).
  11. Gielen, M. C., Lumb, M. J., Smart, T. G. Benzodiazepines modulate GABAA receptors by regulating the preactivation step after GABA binding. Journal of Neuroscience. 32, 5707-5715 (2012).
  12. Bergmann, R., Kongsbak, K., Sorensen, P. L., Sander, T., Balle, T. A unified model of the GABAA receptor comprising agonist and benzodiazepine binding sites. PLoS One. 8, 52323 (2013).
  13. Richter, L., et al. Diazepam-bound GABAA receptor models identify new benzodiazepine binding-site ligands. Nature Chemical Biology. 8, 455-464 (2012).
  14. Rudolph, U., Crestani, F., Mohler, H. GABAA receptor subtypes: dissecting their pharmacological functions. Trends in Pharmacological Sciences. 22, 188-194 (2001).
  15. Wisden, W., Seeburg, P. H. GABAA receptor channels: from subunits to functional entities. Current Opinion in Neurobiology. 2, 263-269 (1992).
  16. Davies, C. H., Davies, S. N., Collingridge, G. L. Paired-pulse depression of monosynaptic GABA-mediated inhibitory postsynaptic responses in rat hippocampus. The Journal of Physiology. 424, 513-531 (1990).
  17. Karnup, S., Stelzer, A. Temporal overlap of excitatory and inhibitory afferent input in guinea-pig CA1 pyramidal cells. The Journal of Physiology. 516, Pt 2 485-504 (1999).
  18. Turner, D. A. Feed-forward inhibitory potentials and excitatory interactions in guinea-pig hippocampal pyramidal cells. The Journal of Physiology. 422, 333-350 (1990).
  19. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv. 391, 85-100 (1981).
  20. Adelsberger, H., Brunswieck, S., Dudel, J. Block by picrotoxin of a GABAergic chloride channel expressed on crayfish muscle after axotomy. European Journal of Neuroscience. 10, 179-187 (1998).
  21. Hapfelmeier, G., et al. Isoflurane slows inactivation kinetics of rat recombinant a1b2g2L GABAA receptors: enhancement of GABAergic transmission despite an open-channel block. Neuroscience Letters. 307, 97-100 (2001).
  22. Bertrand, S., Bertrand, D. Overview of electrophysiological characterization of neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 11, Unit11 17 (2004).

Tags

מדעי המוח גיליון 138 פרמקולוגיה עצבית מעכבות קולטני GABAA סמים גילוי מבחני הכריכה אלקטרופיזיולוגיה הקלטה אוטומטית ההתקנה
שיטות הגילוי של תרכובות הרומן להתכוונן קולטן גאמא אמינו בוטירית הקלד עצבית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Knoflach, F., Hernandez, M. C.,… More

Knoflach, F., Hernandez, M. C., Bertrand, D. Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission. J. Vis. Exp. (138), e57842, doi:10.3791/57842 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter