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Genetics

Tessuto-specifici miRNA Expression Profiling in Mouse cuore sezioni mediante ibridazione In Situ

Published: September 15, 2018 doi: 10.3791/57920
Automatic Translation
1, 2, 3
1Department of Cell and Developmental Biology, University College London, 2Yale Cardiovascular Research Group, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine, 3Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine

Summary

micro-RNA (Mirna) è brevi e altamente omologhi sequenze di RNA, che serve come regolatori trascrizionali di RNA messaggeri (mRNA). Attuali metodi di rilevazione di miRNA variano nella sensibilità e specificità. Descriviamo un protocollo che unisce l'ibridazione in situ e immunostaining per il rilevamento simultaneo di miRNA e proteina molecole su sezioni di tessuto di cuore di topo.

Abstract

micro-RNA (Mirna) è trascritti di RNA singolo filamento che associare a RNA messaggeri (mRNA) e inibiscono la loro traduzione o promuovono la loro degradazione. Ad oggi, i miRNA sono stati implicati in un gran numero di processi biologici e malattia, che ha significato la necessità per i metodi di rilevamento affidabile delle trascrizioni di miRNA. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la rilevazione basata su probe miRNA (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) digoxigenin-etichettati, combinati con proteine immunostaining su sezioni di cuore di topo. In primo luogo, abbiamo effettuato una tecnica in situ di ibridazione con la sonda per identificare espressione di miRNA-182 in sezioni di cuore da controllo e ipertrofia cardiaca nei topi. Successivamente, abbiamo effettuato immunostaining per la proteina cardiaca troponina T (cTnT), sulle stesse sezioni, a co-localizzano miRNA-182 con le cellule del cardiomyocyte. Usando questo protocollo, siamo stati in grado di rilevare miRNA-182 attraverso una fosfatasi alcalina basato su analisi colorimetrica e cTnT attraverso colorazione fluorescente. Questo protocollo può essere usato per rilevare l'espressione di qualsiasi miRNA di interesse attraverso sonde Scavare-contrassegnate LNA e l'espressione della proteina rilevanti su sezioni di tessuto di cuore di topo.

Introduction

micro-RNA (Mirna) è brevi (18 – 25 nucleotidi), singolo filamento, non codificanti RNA che fungono da regolatori negativi della espressione genica a livello post-trascrizionale inibendo la traduzione di RNA messaggero (mRNA) e/o promuovere la degradazione di mRNA 1. i miRNA sono trascritti da introni o essoni di codifica o di geni non codificanti e sono spaccati nel nucleo di DROSHA, al precursore Mirna (pre-miRNA), che sono strutture di breve gambo-ciclo di 70 nucleotidi2. Seguendo citoplasmico esportare, pre-miRNA vengono ulteriormente elaborati con DICER in Mirna maturi che si estendono su 18 – 25 nucleotidi3,4. Successivamente, il complesso di silenziamento indotto da RNA (RISC) incorpora questi miRNA come single-stranded RNA, che per il loro legame la regione 3' non tradotta (3'-UTR) del loro mRNA bersaglio consente di sopprimere la loro espressione3,5 .

Negli ultimi tre decenni, poiché in primo luogo sono stati identificati, Mirna sono emerse al Maestro regolatori dell'espressione genica, i cui livelli di espressione sono strettamente controllato6. Ruoli per i miRNA sono stati descritti in organo sviluppo7,8,9,10,11,12, mantenimento della omeostasi13,14 , così come contesti di malattia che includono neurologico15,16,17,18,19, cardiovascolare20, patologie autoimmuni21 ,22, cancri23,24e altri25. Il crescente apprezzamento per la rilevanza dei modelli di espressione di miRNA ha portato avanti la necessità di metodi di rilevazione affidabili delle trascrizioni di miRNA. Tali metodi includono la Real Time PCR, microarray, Northern Blotting, ibridazione in situ e altri, che variano per la sensibilità, la specificità e la potenza quantitativa, principalmente dovuto al fatto che miRNA trascrizioni sono costituite da brevi e sequenze altamente omologhe6.

Recentemente abbiamo segnalato un importante ruolo dei miRNA-182 nello sviluppo dell'ipertrofia del miocardio26, una condizione che descrive l'adeguamento strutturale del cuore in risposta a richieste emodinamiche elevati27,28. L'ipertrofia cardiaca è caratterizzata dall'aumento della massa miocardica, che, se associato con rimodellamento maladattativo29, può condurre al rischio aumentato per insufficienza cardiaca, una condizione pari al 8,5% di tutti i decessi attribuibili a cardiovascolare malattia30.

Qui, descriviamo il nostro protocollo che combina l'ibridazione in situ con sonda di acido nucleico (DIG) bloccato (LNA) e immunostaining per la rilevazione simultanea di miRNA e proteina molecole su sezioni di tessuto di cuore di topo, digoxigenin-labeled in nostro modello dell'ipertrofia cardiaca.

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Protocol

Campioni di tessuto di cuore di mouse per questo studio sono stati ottenuti in conformità con le leggi e le linee guida istituzionali e sono stati approvati dal comitato di uso e di Yale University istituzionale Animal Care.

1. soluzione preparazione

  1. Preparare la RNasi free ddH2O, trattando 5L di ddH2O con 5 mL di 0,1% dietilpirocarbonato (DEPC) durante la notte (O/N), a temperatura ambiente (TA). Sterilizzare in autoclave (121 ° C) per disattivare il DEPC. Uso trattata DEPC ddH2O quello per la preparazione di soluzioni a valle come indicato.
    Attenzione: DEPC è un noto cancerogeno, gestire solo nella cappa.
  2. Preparare soluzione salina tampone fosfato (PBS) 1x sciogliendo 5 compresse di PBS in 1 L di DEPC-trattati ddH2O. Autoclave (121 ° C).
  3. Preparare 0,1% detergente non ionico/PBS (PBST) diluendo 1 mL di detergente non ionico per 1 L di PBS 1X.
  4. Preparare il 90%, 70%, 50% e 30% di etanolo in trattata DEPC ddH2O.
  5. Preparare un 10 mg/mL soluzione stock di proteinasi K (ProK) trattata DEPC ddH2O. aliquota e conservare a-20 ° C. Preparare una soluzione di lavoro μg/mL 20 di ProK di diluizione 100 μL di soluzione di riserva ProK in 50 mL di DEPC-trattati ddH2O. Make fresco prima dell'uso.
  6. Preparare 4% paraformaldeide (PFA) aggiungendo 2 g di PFA in 50 mL di PBS 1X. Scaldare a 65 ° C con agitazione occasionale, fino a completa dissoluzione. Aliquotare e conservare a-20 ° C.
    Attenzione: PFA è un noto cancerogeno, gestire solo nella cappa.
  7. Preparare una soluzione di NaCl 3M aggiungendo 87,8 g a 500 mL di ddH2O. Autoclave (121 ° C).
  8. Preparare una soluzione di 1 M MgCl2 aggiungendo 20,3 g per 100 mL di ddH2O. Autoclave (121 ° C).
  9. Preparare 1 M Tris pH 8.0 di dissoluzione 121,1 g in 800 mL di ddH2O. regolare il pH a 8.0 con poche gocce di 1 N HCl, portare il volume a 1 L e autoclave (121 ° C). Preparare una soluzione di lavoro di 50 millimetri Tris pH 8.0 diluendo 2,5 mL di 1 M Tris pH 8.0 a 47,5 mL di ddH2O.
  10. Preparare 1 M Tris pH 9.5 di dissoluzione 60,6 g in 400 mL di ddH2O. regolare il pH a 9.5 con poche gocce di 1 N HCl, portare il volume a 500 mL e autoclave (121 ° C).
  11. Preparare 0,13 M 1-metilimidazolo pH 8.0 di diluzione 1.6 mL di 1-metilimidazolo a 130 mL di DEPC-trattati ddH2O. regolare il pH a 8.0 con circa 450 µ l di 12 N HCl. aggiungere 16 mL di 3 M di NaCl e portare il volume a 160 mL. Fare fresco prima dell'uso.
    Attenzione: 1-metilimidazolo è dannoso per la pelle, occhi e membrane mucose, gestire solo nella cappa.
  12. Preparare diluendo 176 µ l di EDC a 10 mL di 0,13 M 1-metilimidazolo 0,16 M N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide cloridrato (EDC). Regolare il pH a 8.0 con circa 100 µ l di 12 N HCl. fare fresco prima dell'uso.
    Attenzione: EDC è dannoso per la pelle, occhi e membrane mucose, gestire solo nella cappa.
  13. Preparare 1% H2O2 diluendo 1,5 mL di 30% H2O2 in 50 mL di 1X PBS. Fare fresco prima dell'uso.
  14. Preparare 20 x SSC pH 7.0 sciogliendo 175,3 g di NaCl e 88,2 g di citrato di sodio (Na3C6H5O7) in 800 mL di ddH2O. regolare il pH a 7.0 con poche gocce di 1 N HCl, portare il volume a 1 L e autoclave (121 ° C).
    1. Preparare una soluzione di lavoro di 2 x SSC pH 7.0 diluendo 20 mL 20 x SSC pH 7.0 in 180 ml di ddH2O.
    2. Preparare una soluzione di lavoro di 1 x SSC pH 7.0 diluendo 2,5 mL di 20 x SSC pH 7.0 a 47,5 mL di ddH2O.
    3. Preparare una soluzione di 0,2 x SSC pH 7.0 diluendo 5 mL di 2 x SSC pH 7.0 in 45 mL di ddH2O.
  15. Preparare la soluzione di ibridazione: 1x diluendo 0,5 mL di tampone ISH x microRNA 2 in 0,5 mL di DEPC-trattati ddH2O. Make fresco prima dell'uso.
  16. Preparare soluzione stock di 200 mM di Levamisole aggiungendo 250 mg a 5 mL di ddH2O. Aliquotare e conservare a-20 ° C.
  17. Preparare soluzione bloccante per passaggio 5 (10% pecora serum/1% BSA/0,2 mM levamisolo) diluire 1 mL di siero di pecora in 9 mL PBST e aggiungendo 0,1 g di BSA. Aggiungere 10 μL di Levamisole prima di utilizzare. Fare fresco prima dell'uso.
  18. Preparare soluzione bloccante per passaggio 6 (10% capra serum/1% BSA) diluire 1 mL di siero di capra in 9 mL di PBST e aggiungendo 0,1 g di BSA. Conservare a 4 ° C e consumare entro una settimana.
  19. Preparare soluzione prestaining diluendo 3,3 mL di 3 M NaCl, 5 mL di 1 M MgCl2, 10 mL di 1 M Tris-HCl pH 9.5, 100 µ l di Tween-20, 100 µ l di Levamisole a 81,5 mL ddH2O. Make fresco prima dell'uso.
  20. Utilizzare del nitroblue (compresse di fosfato (BCIP) NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indoly per preparare 20 mL di soluzione substrato fosfatasi alcalina (AP) secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere 20 μL di Levamisole. Fare fresco prima dell'uso e proteggerlo dalla luce.
  21. Preparare la soluzione KTBT con l'aggiunta di 4 g di Tris, 4,4 g di NaCl e 375 mg di KCl in 500 mL di ddH2O. Autoclave (121 ° C).
  22. Opzionale: Preparare una soluzione di lavoro di DAPI (1 μg/mL) diluendo 50 μL di soluzione di riserva DAPI (1 mg/mL) in 50 mL di PBS 1X.
    Nota: Soluzioni Standard come 3 M di NaCl, 1 M MgCl2, 1 M Tris-HCl, ddH nuclease-Free2O, 1x PBS e 20 x SSC possono essere acquistati in alternativa. Per questo protocollo, 50 mL vetro Coplin vasetti o mailer in polipropilene diapositiva 20 mL sono stati utilizzati vasetti.

2. tessuto preparazione

Nota: Le sezioni di cuore di topo usate qui sono state preparate dai servizi di Yale patologia del tessuto, dal tessuto formalina-fisso/paraffina-incastonato, tagliare a 5 μm e posizionate su slitte cariche.

  1. Reidratazione dei tessuti.
    1. Caldo le diapositive a 60 ° C per 10 min in forno ibridazione fino a paraffina visibilmente si sta sciogliendo.
    2. Incubare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di agente di compensazione commercialmente disponibili (Vedi Tabella materiali) per 10 minuti, due volte.
    3. Incubare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di etanolo al 100% per 2 minuti, due volte, seguito da 90% etanolo per 2 min, etanolo al 70% per 2 minuti, due volte, etanolo al 50% per 2 min e 30% etanolo per 2 min.
    4. Incubare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di DEPC-trattati ddH2O per 5 min.
    5. Incubare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di PBS 1X per 5 min.
  2. Tessuto de-proteinating.
    1. Incubare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di soluzione di lavoro ProK, a 37 ° C per 15 min in forno ibridazione 20 μg/mL.
      Attenzione: Sotto-digestione potrebbero poveri o nessun segnale di sviluppo, mentre la digestione eccessiva può provocare la degradazione del tessuto e lo sviluppo di una colorazione di fondo. Ottimizzazione può essere richiesto per questo passaggio (1 – 20 μg/mL ProK, incubazione di 5 – 20 min, RT-37 ° C).
    2. Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di PBS 1X per 5 min, a RT, due volte.
  3. Fissazione del tessuto.
    1. Utilizzare una penna idrofobica per disegnare un cerchio idrorepellente intorno al tessuto su ogni diapositiva.
    2. Applicare 500 µ l di soluzione al 4% PFA per la lunghezza di ogni diapositiva e incubare i vetrini in posizione orizzontale per 10 min, a TA.
    3. Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di PBS 1X per 5 min, a RT, due volte.
    4. Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di 0,13 M 1-metilimidazolo per 10 min, a RT, due volte.
    5. Applicare 500 µ l di soluzione EDC 0,16 M la lunghezza di ogni diapositiva e incubare i vetrini in posizione orizzontale per 1h a RT, in una camera umidificata.
    6. Sciacquare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di 50 mM Tris-HCl pH 8.0 a TA.
    7. Sciacquare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di PBS 1X a RT, due volte.
      Nota: Sia PFA ed EDC fissazione passi sono necessari per la reticolazione di miRNA e non devono essere omesso. 31
  4. Blocco della perossidasi endogena.
    1. Incubare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di 1% H2O2 per 30 minuti a TA.
    2. Sciacquare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di PBS 1X a RT, due volte.

3. ibridazione

  1. Preriscaldare la soluzione di ibridazione (500 µ l per vetrino) a 50 ° C nel forno di ibridazione, finché la temperatura di destinazione, è raggiungibile (10 – 15 minuti).
  2. Preparare la camera di ibridazione posizionando 2 pezzi di carta velina o di filtro nella parte inferiore dell'alloggiamento e bagnare la carta con 50% formammide/1 x SSC.
    Attenzione: Formammide è dannosa per le membrane mucose, occhi e pelle, unico manico nella cappa.
  3. Applicare 200 µ l di soluzione di ibridazione per la lunghezza di ogni diapositiva. Incubare i vetrini in posizione orizzontale per 1-3 h a 50 ° C, in una camera umidificata.
  4. Preparare la soluzione di sonda con sonda di 0,5 µ l stock (25 µM) in 250 µ l di soluzione ofhybridization (concentrazione finale di 50 nM) in una provetta da 1,5 mL.
    Nota: Diversi miRNA sono espressi a livelli diversi, ottimizzazione per quanto riguarda la concentrazione di sonda potrebbe essere necessaria per questo passaggio (1 – 50 nM) non evitare alcun segnale o sviluppo di alta priorità bassa.
  5. Applicare 250 µ l di soluzione della sonda per la lunghezza di ogni diapositiva e adagiarvi un coprioggetto gratis RNasi. Evitare la formazione di bolle.
  6. Accuratamente la camera di ibridazione con parafilm ed incubare O/N a 50 ° C.
    Nota: La temperatura di ibridazione deve essere impostata circa a 30 ° C sotto la temperatura di fusione di RNA (Tm) di ogni sonda. Ottimizzazione può essere richiesto. Qui, 50 ° C viene utilizzato come la temperatura di lavaggio/ibridazione di miRNA-182, regolare di conseguenza per diverse sonde.

4. condizioni di stringenza lavaggi

  1. Preriscaldare 200 mL di 2 x SSC a 50 ° C nel forno di ibridazione, fino a quando non viene raggiunta la temperatura di destinazione (20 – 40 min).
  2. Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di 2 x SSC a 50 ° C per 5 minuti, o fino a quando i coprioggetti allentare.
  3. Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di 2 x SSC a temperatura ambiente per 5 minuti, due volte.
  4. Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di 0.2 x SSC a RT per 5 min.
  5. Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di PBST presso RT per 5 min.
  6. Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di PBS 1X a RT per 5 min.
    Nota: Uso delle condizioni di RNAsi-libera non è più necessario poiché gli ibridi RNA-RNA sono considerati stabili.

5. rilevazione dell'anticorpo di scavare

  1. Utilizzare una penna idrofobica per ri-disegnare un cerchio idrorepellente intorno al tessuto su ogni diapositiva se necessario.
  2. Applicare 500 µ l di soluzione per la lunghezza di ogni diapositiva di blocco. Incubare i vetrini in posizione orizzontale per 30 min a RT, in una camera umidificata.
  3. Preparare la soluzione di anticorpo DIG (1:1, 000) diluendo 0,5 µ l di anticorpo DIG in 500 µ l di soluzione di ofblocking in una provetta da 1,5 mL.
    Attenzione: Ottimizzazione può essere richiesto per questo passaggio (1: 500 – 1:2, 000).
  4. Applicare 500 µ l di soluzione di anticorpo DIG per la lunghezza di ogni diapositiva. Incubare i vetrini in posizione orizzontale per 1h a RT, in una camera umidificata.
  5. Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di PBST presso RT per 5 min, tre volte.
  6. Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di prestaining soluzione a temperatura ambiente per 5 minuti, due volte.
  7. Incubare i vetrini in un barattolo di mailer in polipropilene diapositiva contenente soluzione di substrato UFAP 20 mL a 37 ° C, per 6-24 h, al riparo dalla luce.
    Attenzione: Lo sviluppo del colore deve essere controllato che ogni 2 h. ottimizzazione può essere richiesto per questo passaggio.
  8. Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di soluzione di KTBT a RT per 5 min, due volte.
  9. Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di PBS 1X a RT per 5 min.

6. cTnT rilevazione dell'anticorpo

  1. Utilizzare una penna idrofobica per ri-disegnare un cerchio idrorepellente intorno al tessuto su ogni diapositiva se necessario.
  2. Applicare 500 µ l di soluzione per la lunghezza di ogni diapositiva di blocco. Incubare i vetrini in posizione orizzontale per 1h a RT, in una camera umidificata.
  3. Preparare la soluzione di anticorpo cTnT (1: 100) diluendo 2 µ l di anticorpo cTnT in 200 μL di soluzione di ofblocking in una provetta da 1,5 mL.
  4. Applicare 200 µ l di soluzione di anticorpo cTnT alla lunghezza di ogni diapositiva. Incubare i vetrini orizzontalmente O/N a 4 ° C, in una camera umidificata.
  5. Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di PBS 1X a RT per 5 min, tre volte.
  6. Preparare la soluzione di anticorpo anti-coniugato-568 (1: 500) diluendo 0,5 µ l di anticorpo anti-coniugato-568 in 250 μL di soluzione di ofblocking in una provetta da 1,5 mL.
  7. Applicare 250 µ l di soluzione di anticorpo anti-coniugato-568 alla lunghezza di ogni diapositiva. Incubare i vetrini in posizione orizzontale per 1h a RT, in una camera umidificata.
  8. Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di PBS 1X a RT per 5 min, tre volte.
  9. Opzionale: Applicare 250 µ l di soluzione di lavoro di DAPI per la lunghezza di ogni diapositiva e incubare i vetrini in posizione orizzontale per 1 min a RT, al riparo dalla luce.
  10. Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di PBS 1X a RT per 5 min, due volte.

7. montaggio e Imaging

  1. Montare i vetrini con 2 – 3 gocce di mezzo di montaggio e un vetro vetrino coprioggetti. Lasciare i vetrini asciugare in piano, O/N, a 4 ° C, al riparo dalla luce.
  2. Procedere alla epifluorescente o microscopia confocale.

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Representative Results

ibridazione in situ di miRNA è stata ottimizzata su sezioni di cuore di topo utilizzando un scramble miRNA e U6-snRNA, che servivano come controlli positivi e negativi, rispettivamente. La macchiatura positiva è indicata in blu, mentre la macchiatura negativa è indicata dalla mancanza di sviluppo del colore (Figura 1A-1B). Cardiomyocyte espressione specifica dei miRNA-182 è stata valutata in sezioni di cuore da topi sovraesprimenti PlGF e controllo. I topi che trasportano il transgene PlGF sotto un promotore αMHC sviluppano ipertrofia cardiaca, secondaria all'aumentata angiogenesi, entro 6 settimane di transgene attivazione26. Abbiamo effettuato l'ibridazione in situ e trovato aumentata espressione dei miRNA-182 nei cuori dei topi PlGF, rispetto ai controlli (Figura 2A-2h), indicato dalla colorazione blu. Per determinare quali tipi di cellule esprimono miRNA-182, abbiamo quindi effettuato immunostaining per cTnT sulle sezioni stesse. Abbiamo trovato miRNA-182 co-localizzato con le cellule del cardiomyocyte cTnT-positivo, come pure DAPI macchiato i nuclei, in sezioni di cuore di topo PlGF sia di controllo (Figura 2-2 H), indicato da rosso e blu rispettivamente di colorazione. Queste immagini sono state con un obiettivo X 20.

Figure 1
Figura 1: Negativo e positivo in situ ibridazione macchiatura. (A) ibridazione In situ per scramble miRNA (25 nM) in sezioni di cuore di topo di controllo. (B) ibridazione In situ per U6-snRNA (25 nM) in sezioni di cuore di topo di controllo. Scala bar = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Cardiomyocyte espressione specifica dei miRNA-182 in controllo e cuori del mouse PlGF. (A-B) Ibridazione in situ di miRNA-182 in controllo e PlGF sezioni di cuore di topo. (C-D) Immunostaining per cTnT in controllo e sezioni di cuore di topo PlGF che sono stati precedentemente colorati di miRNA-182. (E-F) DAPI controcolorazione per localizzazione nucleare in controllo e PlGF sezioni di cuore di topo che sono stati precedentemente colorati di miRNA-182. (G-H) Immagini unite di miRNA-182 (blu profondo), cTnT (rosso) e DAPI (luce blu) che macchia per il controllo e PlGF sezioni di cuore di topo. Barra della scala = 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

rilevazione di miRNA trascrizione può essere raggiunto attraverso tecniche diverse che variano nella sensibilità, specificità e potere quantitativa. Qui, dimostriamo l'accoppiamento di miRNA ibridazione in situ con immunostaining e descrivere un protocollo che consente la valutazione simultanea dei livelli di espressione di miRNA e proteina molecole, le stesse sezioni di cuore. Abbiamo in primo luogo mostrano come eseguire ibridazione in situ di scavare-contrassegnato LNA miRNA sonde su sezioni di cuore di paraffina. Descriveremo come eseguire immunostaining per cTnT sulle sezioni stesse. Infine, dimostriamo come unire il colore risultante e immagini fluorescenti. Questo protocollo è stato ottimizzato per formalina fisso (4 ° C, O/N) / paraffina embedded tessuti di cuore di topo, con l'uso di sonde di miRNA LNA scavare-contrassegnate e cTnT. Ulteriore ottimizzazione può essere richiesto per diversi tessuti, sonda o tipi di anticorpo, come descritto di seguito.

Condizioni di RNAsi-libere dovrebbero essere attuate attentamente in tutto i passaggi che portano alla sonda di ibridazione, come contaminazione RNasi può seriamente compromettere l'esito dell'esperimento. Tutte le soluzioni devono essere eseguite con DEPC-trattati ddH2O, e tutti Coplin vasetti devono essere trattati con una soluzione di decontaminazione di RNAsi. Inoltre, le seguenti considerazioni dovrebbero tenere conto quando si lavora con diverse sonde di miRNA LNA scavare-contrassegnati. La temperatura di ibridazione dipende la temperatura di fusione (Tm) di ogni sonda. Come regola generale, una temperatura di 30 ° C sotto il determinato RNA Tm o a 20 ° C sotto il dato Tm di DNA deve essere utilizzata per l'ibridazione della sonda. Inoltre, la concentrazione di sonda ideale dovrebbe essere ottimizzata. Si trova solitamente fra 1 – 50 nM. Infine, la sonda contenente soluzione di ibridazione può essere riscaldata a 95 ° C per 5 min denaturare eventuali strutture secondarie, se si tratta di una preoccupazione. Un passo importante per testare la specificità di una sonda, soprattutto quando viene utilizzato per la prima volta, è quello di includere una negativo sonda di controllo (uova strapazzate) anche come positiva (ad esempio U6), per garantire il successo sperimentale (Figura 2). Controlli simili (ad esempio un anticorpo endoteliale CD31) devono essere usati durante il passaggio di immunostaining.

Un problema comune in esperimenti di ibridazione in situ è lo sviluppo di macchiatura segnale artefatto/sfondo. Per evitare o minimizzare artefatto procedura di macchiatura, il tessuto deve essere protetto dall'asciugarsi durante tutte le fasi, in particolare durante le incubazioni lunghe. Si consiglia di ricoprire le diapositive con lamelle di RNAsi-libera durante il passaggio di ibridazione, in particolare quando vengono utilizzate alte temperature e l'uso di appositi alloggiamenti. Inoltre suggeriamo l'uso di un fluoroforo 568 o 594 per rilevare cTnT o la proteina di interesse durante il passaggio di immunostaining. Questo eliminerà qualsiasi autofluorescenza che spesso si pone con l'uso di 488 fluorofori utilizzati su formaldeide tessuti fissata.

Un'altra variabile che consigliamo di prestare attenzione è la durata di AP macchiatura di sviluppo, che dipende dal livello del quieto specifico presente nel tessuto. Ti suggeriamo di verificare la progressione colorazione AP ogni 2 h, per il primo esperimento. Ulteriore ottimizzazione può includere cambiando la temperatura del parametro di incubazione (RT-37 ° C). Infine, se sfondo comincia a svilupparsi prima la sonda di miRNA vera colorazione, o se l'AP macchiatura soluzione cambia il colore blu-marrone, consigliamo di lavare i vetrini in PBST due volte e sostituendo la soluzione colorante con uno appena fatto.

Infine, anche se questo protocollo è stato ottimizzato per tessuti del cuore di formalina-fisso/paraffina-incastonato del mouse, può essere adattato per tessuti in alternativa trasformati (PFA fisso/OCT incorporato) e/o l'uso dei diversi tipi di sonda o anticorpo. Una limitazione di combinazione di ibridazione in situ e immunostaining che dovrebbe essere considerato è l'omissione di parecchi anticorpi di associare ai loro rispettivi epitopi, a causa della possibile distruzione di questi ultimi alle alte temperature utilizzate durante l'ibridazione e rigore fasi di lavaggio. Ulteriori limitazioni di ibridazione in situ e di tecniche di immunostaining più spesso si riferiscono alla potenza di queste tecniche per rilevare le concentrazioni molto basse di miRNA o proteina molecole rispettivamente. Kit di amplificazione del segnale sono disponibili per il rilevamento di scavare o di anticorpo quando miRNA o proteina abbondanza è una preoccupazione. Tali kit anche fornire un'alternativa di fluorescenza per la rilevazione di Mirna, che, quando accoppiato con fluorescente immunostaining può semplificare acquisizione immagine. Metodi alternativi, come Real-Time PCR e Western Blotting che hanno una maggiore sensibilità, possono anche risolvere i problemi di scarsa abbondanza. Tuttavia, contrariamente a protocollo in situ di ibridazione/immunostaining, queste tecniche non forniscono alcuna informazione sulla localizzazione delle molecole miRNA/proteine tessuto-specifica.

Per riassumere, descriviamo un protocollo che fornisce la rilevazione simultanea di miRNA e proteina molecole sul tessuto stesso, che crediamo sarà uno strumento prezioso nella ricerca di miRNA in modelli di mouse.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare Athanasios Papangelis, per osservazioni critiche sul manoscritto. FM è supportato dal Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC; BB/M009424/1). IP è supportato da American Heart Association scienziato Development Grant (17SDG33060002).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diethylpyrocarbonate Sigma Aldrich D5758 DEPC
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417 PBS
Tween-20 American Bioanalytical AB02038 non-ionic surfactant
Histoclear National Diagnostics HS-200
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Sigma Aldrich 3115879001 ProK
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148 PFA
Sodium Chloride ThermoFisher S271 NaCl
Magnesium Chloride Hexahydrate ThermoFisher M33 MgCl2
Tris Sigma Aldrich T6066
Hydrochloric Acid Solution, 1 N ThermoFisher SA48 HCl
Hydrochloric Acid Solution, 12 N ThermoFisher S25358 HCl
1-Methylimidazole Sigma Aldrich 336092
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma Aldrich 39391 EDC
Hydrogen peroxide solution H2O2 Sigma Aldrich 216763 H2O2
Trisodium citrate dihydrate Sigma Aldrich S1804 Sodium Citrate
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) Qiagen 339450 scramble miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe QIagen YD00615701 5'-DIG and 3'-DIG labelled
Levamisol hydrochloride Sigma Aldrich 31742
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9647 BSA
NBT/BCIP Tablets Sigma Aldrich 11697471001 NBT-BCIP
Potassium Chloride ThermoFisher P217 KCl
DAPI solution (1mg/ml) ThermoFisher 62248 DAPI
Glass coverslip ThermoFisher 12-545E Glass coverslip
Plastic coverslip Grace Bio-Labs HS40 22mmX40mmX0.25mm RNA-ase free plastic coverslip
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sigma Aldrich 11093274910 DIG antibody
Hydrophobic barrier pen Vector Laboratories H-4000 Pap pen
Anti-Cardiac Troponin T antibody Abcam ab92546 cTnT antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 ThermoFisher A-11011 anti-rabbit-568 antibody
Dako Fluorescence Mounting Medium DAKO S3023 mounting medium
Sheep serum Sigma Aldrich S3772
Goat serum Sigma Aldrich G9023
Deionized Formamide American Bioanalytical AB00600
Hybridization Oven ThermoFisher UVP HB-1000 Hybridizer

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Genetica problema 139 espressione di micro-RNA profilatura sonda LNA ibridazione in situ immunostaining ipertrofia cardiaca
Tessuto-specifici miRNA Expression Profiling in Mouse cuore sezioni mediante ibridazione <em>In Situ</em>
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Memi, F., Tirziu, D., Papangeli, I.… More

Memi, F., Tirziu, D., Papangeli, I. Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (139), e57920, doi:10.3791/57920 (2018).

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